Abstract

Fundo e objetiva

O inquérito sobre a B7 expressão -H1 em células de câncer colorretal está em um estágio inicial. Não está claro se a expressão B7-H1 pode ter valor de diagnóstico ou prognóstico no carcinoma colorectal. Além disso, como B7-H1 é associado com as características clínicas de carcinoma colorretal não é conhecido. A fim de investigar a relação entre B7-H1 e cancro colorectal, analisamos a expressão B7-H1 e seu efeito em amostras clínicas e células HCT116.

Métodos

espécimes

parafina-encaixadas de 143 elegíveis pacientes foram utilizados para investigar a expressão de CD274 por imuno-histoquímica. Nós também examinou se em si B7-H1 pode estar relacionado à proliferação celular, apoptose, migração e invasão em células cancerígenas do cólon HCT116.

Resultados

Nossos resultados mostram que B7-H1 foi altamente expressa em colorectal carcinoma e foi significativamente associada com o estado de diferenciação celular e estágio TNM (tumor metástase). Pacientes com expressão B7-H1 positivo apresentou uma tendência de menor sobrevida. Utilizando análise multivariada, demonstramos que a expressão positiva B7-H1 é um preditor independente do prognóstico do carcinoma colorretal. Os nossos resultados indicam que B7-H1 silenciamento com ARNsi inibe a proliferação celular, migração e invasão. Além disso, a apoptose celular também foi aumentado pela inibição B7-H1.

Conclusões

expressão B7-H1 positiva é um preditor independente para o prognóstico do carcinoma colorretal. Além disso, knockdown de B7-H1 pode inibir a proliferação celular, migração e invasão

citação:. Shi S-J, Wang L-J, Wang L-D, Guo Z-Y, Wei H, Meng Y-L, et al. (2013) B7-H1 expressão é associado a mau prognóstico no carcinoma colorectal e regula a proliferação e invasão de células HCT116 câncer colorretal. PLoS ONE 8 (10): e76012. doi: 10.1371 /journal.pone.0076012

editor: John Souglakos, University Hospital Geral de Heraklion e Laboratório de Tumor Cell Biology, Faculdade de Medicina da Universidade de Creta, Grécia |

recebida: Junho 7, de 2013; Aceito: 19 de agosto de 2013; Publicação: 04 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No.30873004, 30.973.000 e 81.171.924) e Natural Science Foundation de Shan xi Província (No.2011JM4006). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorretal é a terceira neoplasia maligna mais frequentemente diagnosticado no mundo e a quinta maior causa de morte entre os pacientes com câncer na China [1]. Devido à falta de marcadores de diagnóstico eficazes, a maioria dos pacientes com câncer colorretal apresenta metástases distantes (fase IV) no momento do diagnóstico. O tratamento mais eficaz cancro colo-rectal é a cirurgia. No entanto, a falta de marcadores de prognóstico precisos torna difícil prever o tempo de sobrevivência do paciente depois da cirurgia. Assim, os novos marcadores e eficazes para o diagnóstico e prognóstico são necessários na clínica.

A molécula B7 homólogo de um co-estimulador (B7-H1 ou CD274) é um ligando identificado recentemente para a morte do receptor de co-inibidor programado -1 (DP-1 ou CD279) [2,3]. B7-H1 é expresso em células T, células B, macrófagos e células dendríticas. A expressão de B7-H1 pode ser ainda mais supra-regulada sobre a activação ou a presença de IFN-γ [2-4]. Além de linfócitos, B7-H1 também tem sido detectada em níveis baixos em endotélio cardíaco, células endoteliais microvasculares, ilhéus pancreáticos e syncytiotropho-blastos na placenta [5,6]. Tradicionalmente, a função de B7-H1 sobre as células apresentadoras de antigénio é conseguido através da ligação com DP-1 em células T, que se pensa ter um papel importante na indução e manutenção da tolerância imunológica [7-9].

para além da expressão em linfócitos e tecido normal, a expressão de B7-H1 aberrante também foi encontrado em várias malignidades humanas. tipos de tumores, incluindo carcinoma de células escamosas do pulmão, esôfago, cabeça e pescoço, e outros tipos de carcinomas, tais como ovário, bexiga, cancro da mama, melanoma e glioma também expressam B7-H1 [10-16]. A expressão do tumor-associados B7-H1 está correlacionada com mau prognóstico e alto grau de malignidade. O bloqueio da associado a um tumor B7-H1 foi mostrado para promover a regressão do tumor in vivo em vários transplantes de tumores de murinos [10,12,17,18]. PD-1 expressão é regulada positivamente nos linfócitos que se infiltram no tumor, e tem sido proposto que B7-H1 expressa em células cancerosas pode inibir a função de linfócitos que se infiltram [16]. Também tem sido demonstrado que o associado a tumores B7-H1 pode induzir a apoptose de CTL, que, posteriormente, resultou em uma fuga da vigilância imunológica mediada por células T [8,10]. estudo anterior prestou atenção excessiva para a função de associado ao tumor B7-H1 que produz efeitos como um ligando para a DP-1 ou CD80, mas negligenciada o efeito associado a um tumor de si B7-H1 na célula de tumor. O estudo sobre o efeito do tumor-associados B7-H1 em células tumorais ainda está em sua infância. Assim, associado a um tumor B7-H1 podem actuar em concertação com outros reguladores negativos da activação das células T para atenuar a resposta imune anti-tumor hospedeiro [19], também com a grande possibilidade, associado a um tumor B7-H1 pode afectar o processo de progressão do cancro através de interferir com a função da célula cancerosa.

a expressão de B7-H1 no carcinoma colorretal é inconsistente. Dong et ai. falhou para detectar a expressão de B7-H1 em tecidos do cólon normais, mas a expressão de B7-H1 foi detectado em uma proporção relativamente elevada (10/19) dos doentes com cancro colorrectal [10]. No entanto, um outro grupo identificada a expressão de B7-H1 no nível de ARNm, mas também não conseguiu detectar a expressão de superfície de células epiteliais do cólon B7-H1in de controlos saudáveis ​​[20]. O inquérito sobre a expressão B7-H1 em células de câncer colorretal está em um estágio inicial. Não está claro se a expressão B7-H1 pode ter valor de diagnóstico ou prognóstico no carcinoma colorectal. Além disso, como B7-H1 é associado com as características clínicas de carcinoma colorretal não é conhecido. Neste estudo, nós investigamos o perfil de B7-H1 expressão em 5 tecidos do cólon normal, 143 tecidos de câncer colorretal e 44 tecidos adjacentes. Também avaliamos o valor preditivo de B7-H1 para o prognóstico em pacientes com câncer colorretal e analisou se associado a tumor em si B7-H1 pode modular directamente a progressão do cancro colorectal em vez de através da ligação a PD-1 em células T.

materiais e Métodos

2.1: os pacientes e acompanhamento

Como descrevemos anteriormente, este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Quarta Universidade médica Militar e todos os pacientes participantes deram o seu escrito consentimento informado para as suas amostras de informação e de tecido a ser armazenado na base de dados de Xijing Hospital e utilizadas para a investigação [21]. . A coorte retrospectivo investigatedincluded143 pacientes com carcinoma colorretal potencialmente ressecável diagnosticada a partir de Fevereiro de 2006 a dezembro de 2007. Os pacientes foram coletadas a partir do Departamento de Cirurgia Gastrointestinal do Hospital Xijing, Quarta Universidade Médica Militar. Os critérios de exclusão para o recrutamento deste estudo são as seguintes: receber quimioterapia adjuvante antes da cirurgia, diagnóstico de tumor estromal gastrointestinal ou linfoma, diagnóstico com cancros adicionais, e qualquer paciente que se recusa consentimento. As amostras clínicas foram recuperadas do arquivo de tecido no Departamento de Patologia, Hospital Xijing, Quarta Universidade Médica Militar. As informações de acompanhamento de todos os participantes foi atualizado a cada 3 meses por telefone. A sobrevivência global foi definida como o tempo decorrido desde a cirurgia à morte. Informações sobre a morte de pacientes foi determinado com base em sua família

2.2:. Imuno-histoquímica (IHQ) coloração e avaliação

seções de tecidos normais e tumorais

parafina-embedded foram coradas para a expressão B7-H1. A coloração imuno-histoquímica para B7-H1 foi realizado como descrito anteriormente, com ligeiras modificações [22]. Resumidamente, as lâminas foram desparafinadas e re-hidratadas em xileno em uma série álcool graduado antes da actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2. vinculativo toda a proteína não específica foi bloqueada usando soro de coelho pré-imune. O anticorpo primário para B7-H1 (Abcam, ab58810) foi diluído de acordo com a concentração recomendada (5 ug /ml), e as secções foram incubadas durante a noite numa câmara humidificada a 4 ° C. As secções foram lavadas 3 vezes com PBS, e em seguida, foi adicionado um anticorpo secundário biotinilado e incubadas durante 30 min à temperatura ambiente. A visualização foi realizada utilizando sinal DAB cromogénio durante 2 a 3 min. O controlo negativo foi feito coloração através da substituição do anticorpo primário com soro de coelho pré-imune. A coloração B7-H1 foi marcado de forma independente por dois patologistas cegos para as características clínicas dos pacientes. O sistema de pontuação usado na classificação a expressão B7-H1 foi descrito anteriormente [23]. Tumores com intensidade de coloração imunológica forte e moderada foram classificados como tendo expressão positiva (+), enquanto que os tumores com imunocoloração ausente e fracos foram classificados como tendo negativo (-) expressão

2.3:. Cell cultura

células HCT116 cancerígenas do cólon humano foram obtidos a partir da Cell Bank da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), onde foram caracterizados por detecção de micoplasma, DNA -Fingerprinting, detecção isozima e detecção vitalidade celular. Esta linha celular foi expandida e imediatamente congelados de forma que as culturas de células pode ser reiniciado a cada 3 a 4 meses a partir do mesmo lote de frascos congelados. As células HCT116 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Hyclone, Logan, UT) e foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C em 5% de CO

2

2.4: transfecção siRNA e silenciamento de genes

para interromper B7-H1 em células, um pequeno ARN interferente (siRNA) foi transfectado para as células. Os duplexes de siRNAs (5′-GGCUGCACUAAUUGUCUAUTT-3 ‘e 5′-CCAGCACACUGAGAAUCAATT-3′), como alvo o gene de B7-H1. O duplex de controlo negativo (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘) de uma sequência alvo não específica. Os siRNAs foram sintetizados por Sangon Biotech (Xangai, China). Os ARNic em cadeia dupla (100 nmol /L) foram transfectados em células HCT116 utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As células HCT116 foram colhidas 48 h após a transfecção para análise posterior. A eficiência de inibição foi identificado por Western blot (Figura S1)

. 2.5: RT-qPCR (reverso de PCR de transcrição-quantitativa)

ARN celular total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN foi, então, transcrito de forma inversa com o auxílio reverter

TM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Sankt Leon-Rot, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As reacções em cadeia da polimerase-transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) foram realizadas utilizando um CFX96

TM Tempo Real-sistema de PCR (BioRad, Valencia, CA) com reagentes de SYBR Green (# DRR041A; Takara Bio, Japão) de acordo com a as instruções do fabricante. A análise por RT-qPCR foi realizado num volume total de 20 mL com os seguintes passos de amplificação: um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, o que foi seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg e alongamento a 55 ° C durante 30 seg. A expressão do gene de RT-qPCR foi normalizada para β-actina humana. Os iniciadores utilizados para PCR em tempo real no presente estudo foram os seguintes: 5′-TCAATGCCCCATACAACAAA -3 ‘(sentido) e 5′-TGCTTGTCCAGATGACTTCG -3′ (anti-sentido) para B7-H1; 5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 ‘(sentido) e 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’ (anti-sentido) para β-actina

. 2.6: Western Blot

As células foram colhidas em tampão de lise (50 mM de NaCl, 50 mM de EDTA, 1% de Triton X-100) contendo mistura de inibidores de protease (Roche, Indianapolis, IN, EUA). Os lisados ​​celulares (30 ug) foram separados utilizando géis de 10% SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado diluído em PBS durante 2 h à temperatura ambiente antes da adição do anticorpo primário apropriado. Os anticorpos utilizados neste estudo incluíram anti-B7-H1 (1: 400; Abcam, ab58810) e anti-GAPDH (1: 2000; Abcam, mAbcam9484). As membranas foram então lavadas com PBS contendo Tween a 0,05% e incubadas com o anticorpo apropriado conjugado com HRP secundário (1: 10000; Abcam) durante 1 h à temperatura ambiente. As bandas foram visualizadas usando um reagente de quimioluminescência (New England Nuclear, Boston, MA):

. 2.7: Ensaio MTT

A proliferação celular foi analisada in vitro com o sal de tetrazólio 3- (4, 5 -dimethylthiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) de reagente. As células HCT116 foram transfectadas com ARNsi específico (Si-precipitação ou Si-B7-H1), durante 24 h, e, em seguida, foi examinada a proliferação. Resumidamente, as células 2000 de cada grupo (parental, Si-precipitação ou Si-B7-H1) foram semeadas em cada poço de cinco placas de 96 poços em 200 ul de meio. Para analisar a proliferação celular, 20 pL de substrato de MTT a uma concentração de 2,5 mg /mL em PBS foi adicionado a cada poço. As placas voltaram então a incubadora de um tecido normal de um adicional de 4 h. O meio foi então removido, e as células foram solubilizados em 150 mL de sulfóxido de dimetilo para a análise colorimétrica (comprimento de onda, 490 nm). Uma placa foi analisada imediatamente após as células aderiram (aproximadamente 4 h após o plaqueamento). Em seguida, uma placa por dia foi examinado para os próximos 4 dias consecutivos

2.8:. Análise de citometria de fluxo para detectar células apoptose

células HCT116 foram transfectadas com siRNA específico (si-corrida ou si- B7-H1) durante 48 h, e as células foram então suspensas em tampão de incubação, a uma densidade de 1 x 10

6 células /ml. As células foram incubadas com Anexina V-FITC e iodeto de propídio (BD Bioscience, San Jose, CA) durante 15 min no escuro à temperatura ambiente. apoptose celular foi então analisada usando um citómetro de fluxo (BD FACS Aria)

. 2.9: migração e invasão ensaio

A migração celular e a capacidade de invasão in vitro foram medidas utilizando ensaios de migração Transwell (Millipore, Billerica , MA). As células HCT116 foram transfectadas com ARNsi específico (Si-precipitação ou Si-B7-H1) durante 48 h e suspensas em DMEM com 10 g /L de BSA a uma densidade de 50 células /ml. Em seguida, as suspensões de células (200 ul) foram semeadas na câmara superior com uma membrana revestida com aporous (para o ensaio de invasão Transwell) ou sem (para o ensaio de migração) Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA). Para atrair as células, 500 ul de DMEM com soro a 10% foi adicionada à câmara inferior. Depois de deixar as células para migrar durante 24 horas ou invadir durante 48 h, as células penetraram sobre os filtros foram fixados em metanol e corados seca em 4 g /L de violeta de cristal. O número de células que migraram ou invasivos foram determinados a partir de cinco campos aleatórios utilizando um microscópio (Olympus) no × 10 ampliação

2.10:. A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando software de estatística IBM SPSS ( versão 20.0). As curvas de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier, e distribuições foram avaliados pelo teste de longa-rank. Modelo proporcional de Cox de factores relacionados com a sobrevivência foram utilizados para calcular horas e identificar os fatores que afetam a sobrevivência. As diferenças de características entre os 2 grupos foram examinados pelo χ

2 e teste exato de Fisher. Todos os

P

-Valores foram determinados a partir de testes de 2 lados, ea significância estatística foi baseada em um

P

-valor de 0,05.

Resultados

3.1: o significado clínico de expressão B7-H1 positiva em tecido de cancro colorectal

Para determinar a prevalência e significado clínico de expressão B7-H1 no carcinoma colorretal, foi avaliado o nível de proteína B7-H1 por imuno-histoquímica em uma coorte retrospectivo de 143 doentes com cancro colorectal após a ressecção do tumor. Entre os 143 doentes, 64 pacientes (44,8%) mostraram expressão positiva B7-H1 na membrana e no citoplasma (Figura 1A). Havia 79 amostras de pacientes sem expressão detectável B7-H1 (Figura 1C). Além disso, apenas 5 (11,4%) de 44 tecidos adjacentes mostraram expressão positiva B7-H1 (Figura 1B D). Nosso estudo não conseguiram detectar a expressão B7-H1 em tecidos de cólon normais. Também foi avaliada a relação entre a expressão de B7-H1 e características clínicas usando um teste do qui-quadrado de Pearson ou exato de Fisher. Nós encontramos uma tendência de aumento da expressão B7-H1 entre carcinoma bem e pouco diferenciado e do estágio TNM I a IV. Estes resultados sugerem que a expressão B7-H1 foi significativamente associada com o estado de diferenciação celular e estágio TNM no carcinoma colorretal (

P

= 0,030 e 0,034, respectivamente). No entanto, a expressão B7-H1 não é significativamente correlacionada com sexo, idade, localização do tumor, ou o status dos linfonodos (Tabela 1).

(AD) coloração immunohistochemiscal Representante da expressão positiva e negativa de no câncer colorretal ou adjacente tecido (ampliação original × 100). (A) B7-H1 tecido tumoral positiva, (B) B7-H1 tecido adjacente positiva, (C) B7-H1 tecido tumoral negativo, e (D) de B7-H1 tecido adjacente negativa. imagens representativas foram mostrados. (E) de associação entre a expressão B7-H1 e morte específica por câncer em 143 espécimes de cancro colorrectal.

Características clínicopatológicos

Total Nº de pacientes, N =

B7-H1

χ positiva

2

p

Idade (anos) 143 (59,8 ± 12,5) 641.1620.570≤4014640-606024≥606934Sex0.8420.398Men6130Women8234Tumor location2.9870.573Ascending5725Transverse1810Descending2411Sigmoid3312Rectum116T status1.9060.592T110T2145T312358T453N status0.3020.945N07233N16830N231M status0.9470.512M013361M1103TNM stagei1258.5020.034

*ii5332iii6824iv103Differentiation7.0550.030

*well7627moderately5126poorly1611Table 1. A correlação clínica entre a expressão de B7-H1 e outras características clínico-patológicas no carcinoma colorectal

* P ≤ 0,05 CSV Baixar CSV

3.2:. A expressão positiva de B7-H1 está associada com sobrevida global pobres

para determinar o valor prognóstico da expressão de B7-H1 em carcinoma colorrectal, analisou-se a relação entre a expressão de B7-H1 e o resultado clínico. O tempo médio de sobrevida global do paciente em nossa coorte retrospectivo foi de 43 meses (intervalo: 1-56 meses). Dos 143 pacientes, 73 pacientes estavam vivos e 70 pacientes foram falecido no momento da análise (60 meses). A relação entre B7-H1expression e sobrevida global foi investigada através de análise de Kaplan-Meier e um teste de log-rank. Os pacientes foram divididos em 2 grupos com base em se B7-H1 estava presente ou ausente, que foi definida como B7-H1 negativo positivo ou B7-H1. Foi encontrada uma diferença estatisticamente significativa na sobrevivência global entre os grupos positivos e negativos B7-H1 (Figura 1E, teste log-rank:

P

= 0,0169). Os pacientes com positiva B7-H1expression tendiam a ter um risco aumentado de morte em comparação com pacientes com negativo B7-H1expression. O HR não ajustada foi 2,611 (IC 95%: 1,008-3,576; p = 0,006). Como mostrado na Tabela 2, a diferenciação de células e fase TNM também foram associados com o prognóstico de carcinoma colorrectal. Na análise multivariada, verificou-se que a expressão B7-H1 positivo foi associada com uma sobrevida global diminuiu. O HR ajustado foi de 2,771. (IC 95%: 1,048-2,994; p = 0,003), indicando que a expressão B7-H1 poderia ser um fator prognóstico independente destas características clínico-patológicas ajustadas (Tabela 2)

univariada

multivariada

HR

95% CI

P Valor

HR

95% CI

P Valor

B7-H1 expression2.611(1.008-3.576)0.006

*2.771(1.048-2.994)0.003

*Age0.815(0.497-1.335)0.4160.888(0.520-1.516)0.663Sex1.225(0.757-1.983)0.4081.010(0.596-1.714)0.433Tumor location1.199 (0.463-3.104) 0.7090.904 (0.281-2.906) 0.865TNM stage2.345(1.153-2.778)0.010

*1.416(1.179-1.971)0.043

*Differentiation1.956(1.224-2.928)0.030

*3.192(1.126-3.679)0.004

*Table . 2. A análise de regressão de Cox de fatores prognósticos para a sobrevida global em doentes com cancro colorectal (n = 143)

IC 95% indica 95% de intervalo de confiança * P ≤ 0,05 CSV Baixar CSV

3.3: knockdown eficaz de B7-H1 por siRNA em células HCT116

tem sido relatado que o associado a tumores B7-H1 poderia promover a apoptose da célula T [10], mas não existem estudos que indicam um papel para a expressão de B7-H1 sobre as células tumorais. Como uma linha celular de cancro colorrectal humano vulgarmente usado, as células HCT116 foram mostrados para ser invasivo e altamente móveis in vitro [24-26]. Assim, para examinar a função de B7-H1 na biologia celular do cancro colo-rectal, usamos siRNAs segmentação B7-H1 para inibir a expressão de B7-H1. Em seguida, examinou as características de células tumorais, incluindo a proliferação celular, apoptose, migração e invasão. O knockdown eficaz de B7-H1 foi confirmada por qRT-PCR, transferência de Western e análise de citometria de fluxo. Em comparação com células transfectadas com ARNsi mexidos, as células transfectadas com ARNsi de B7-H1 mostrou reduzida significativamente a expressão de B7-H1 (cada experiência foi repetida três vezes, e o resultado típico está presente como Figura 2A, 2B e 2C).

(a) análise de RT-qPCR para mostrar o nível de B7-H1 ARNm. células parentais ou HCT116 transfectadas com siRNA mexidos ou siRNA segmentação B7-H1 por 48 h foram colhidas e RT-qPCR foi realizada; (B) análise por Western blot para detectar o nível de proteína B7-H1. células parentais ou HCT116 transfectadas com ARNsi mexidos ou siRNA alvejando B7-H1 durante 48 h foram recolhidas e os lisados ​​celulares foram preparados e utilizados para a mancha de Western; (C) Análise de fluxo de citometria e fluorescência média de canal para mostrar a expressão B7-H1 na membrana celular. células parentais ou HCT116 transfectadas com ARNsi mexidos ou siRNA alvejando B7-H1 durante 48 h foram colhidas e a coloração da superfície celular foi realizada antes da análise por citometria de fluxo. Os dados foram apresentados como médias ± SD, * P 0,05 versus o grupo si-corrida

3.4:. Efeito da B7-H1 knockdown na proliferação celular

Depois de confirmar a eficiência knockdown dos ARNic de segmentação B7-H1, foi determinado o efeito de um nível de B7-H1 reduzida sobre a proliferação celular utilizando um ensaio MTT. As células HCT-116 que foram transfectadas com ARNsi de segmentação B7-H1 mostrou significativamente menos do que a proliferação das células progenitoras ou mexidos transfectadas com ARNsi (Figura 3A). Este resultado demonstrou a B7-H1 teve um efeito directo sobre a proliferação celular em células HCT116 e que um nível elevado de proteína de B7-H1 está correlacionado com o aumento da proliferação celular.

(A) análise de MTT de detectar a proliferação de células. células parentais ou HCT116 foram transfectadas com ARNsi mexidos ou siRNA alvejando B7-H1 durante 48 h foram semeadas em placas de 96 poços e a proliferação de células foi detectada por MTT. Os dados foram apresentados como médias ± SD, * P 0,05 versus o grupo si-corrida. (B) A análise de citometria de fluxo para detectar a apoptose celular. células parentais ou HCT116 transfectadas com ARNsi mexidos ou siRNA alvejando B7-H1 durante 48 h foram recolhidas e coradas com anexina-V-FITC e PI antes da análise por citometria de fluxo. Os dados foram apresentados como médias ± SD, * P 0,05 versus o grupo si-corrida

3.5:. Efeito da B7-H1 knockdown na apoptose celular

Temos demonstrado que o nível de expressão de B7-H1 está correlacionado com a proliferação celular. Portanto, testou-se a proliferação celular inibida pode ser causado por um aumento da apoptose celular em células knockdown B7-H1. células HCT116 transfectadas com siRNA corrida ou siRNA segmentação B7-H1 por 48 h foram analisadas para a apoptose. Os resultados indicam que, comparado com as células transfectadas com ARNsi parentais ou mexidos, células transfectadas com ARNsi de segmentação B7-H1 tinha aumentado índice de apoptose que calculada por adicionar as células nos 1 e as células no 2 (12,3 ± 5,9% e 17,2% ± 6,2 vs 1,1 ± 0,4%, P 0,05; 12,3 ± 5,9% e 17,2% versus 0,9 ± 0,5%, P 0,05; cada experiência foi repetida três vezes, e o resultado típico está presente como a Figura 3B). Colectivamente, estes resultados sugerem que a expressão de B7-H1 em células HCT116 é importante tanto para a proliferação celular e a apoptose

3.6:. Efeito de B7-H1 knockdown na migração celular e invasão

B7 -H1 tem sido mostrado previamente para regular a migração celular e invasão de células de carcinoma pancreático [27]. As nossas observações de que a expressão de B7-H1 desempenharam um papel importante na proliferação de células HCT116 e apoptose levou-nos a avaliar a função de B7-H1 sobre a migração celular e invasão de células cancerígenas do cólon. Para testar a migração, utilizou-se ensaios de câmara transpoço padrão Matrigel-revestidos ou não revestidos. Nós descobrimos que em comparação com as células transfectadas com ARNsi mexidos, células HCT-116 transfectadas com ARNsi de segmentação B7-H1 tinha reduzido a migração e a capacidade de invasão (Figura 4A-4D), e um número /migração celular número reduzido índice invasiva (célula invasão, Figura S2 ). Em conclusão, os nossos resultados indicam que a expressão de B7-H1 em células HCT116 está correlacionado com a proliferação celular, apoptose, migração e invasão.

de ensaio (A) Boyden câmara para detectar a migração celular. células parentais ou HCT116 transfectadas com siRNA mexidos ou siRNA segmentação B7-H1 por 48 h foram semeadas em câmaras de Boyden, sem membrana Matrigel-revestido, e depois de mais 48 h, as células migraram foram coradas e contadas sob um microscópio (ampliação × 10). Imagens representativas foram mostrados. (B) Número de células migraram mostrados na A. Os dados foram apresentados como médias ± DP de cinco campos. * P 0,05 versus o grupo Si-precipitação. ensaio de câmara (C) de Boyden para detectar a invasão celular. células parentais ou HCT116 transfectadas com mexidos siRNA ou siRNA alvejando B7-H1 durante 48 h foram semeadas em câmaras de Boyden modificadas com a membrana de Matrigel-revestido, e após mais 24 h, as células invasivas que se movia através da membrana de Matrigel foram coradas e contadas sob um microscópio (ampliação de × 10). Imagens representativas foram mostrados. (D) Número de células invasivas mostrados em C. Os dados foram expressos como média ± DP de cinco campos. * P . 0,05 versus o grupo si-corrida

Discussão

B7-H1 é altamente expressa em diferentes tipos de tumores. No entanto, a correlação entre a expressão B7-H1 e progressão do câncer colorretal não foi bem estudado [20,28]. Neste estudo, confirmou-se que a expressão de B7-H1 pode ser detectado tanto em cancro colorectal e tecidos adjacentes, mas com uma frequência diferente. Nós também forneceram evidências de que a expressão B7-H1 positivo foi correlacionado com características clínicas e patológicas adversas no carcinoma colorectal. Além disso, demonstrou-se que o nível de expressão de B7-H1 também foi preditiva de progressão da doença e morte específicas de cancro. Nossos resultados mostraram os pacientes com expressão positiveB7-H1 são geralmente em um risco significativamente maior de progressão do câncer, a morte específico do câncer e sobrevida global mais curto. Este risco aumentado foi independente do sexo, idade, tamanho do tumor, localização do tumor, estado de diferenciação e estádio TNM. Estes resultados forneceram a primeira evidência de apoio B7-H1 como um preditor de mau prognóstico no carcinoma colorectal.

A descoberta mais emocionante e inesperado foi os nossos resultados demonstraram que a própria B7-H1 correlacionada com a proliferação celular, apoptose, migração e invasão. Embora alguns grupos de pesquisa confirmaram que as células tumorais que expressam B7-H1 teve um índice proliferativo alta [14,27], a maioria dos grupos tendiam a acreditar B7-H1 evitar a destruição do tumor somente por formar “um escudo molecular [18,29]”, mas não formando “um mais poderoso lança” [18,30]. A nossa descoberta fornece uma poderosa evidência de que B7-H1 pode ter função oncogênico durante a carcinogênese do cólon, que derramou uma nova luz sobre a função de B7-H1 no desenvolvimento do cancro colorectal.

A taxa de recorrência do carcinoma colorectal é relativamente alta. Uma possível razão para a recorrência é que o tumor residual pode fugir immunesurveillance host. Estudos anteriores confirmaram que a infiltração de células T alta em tecido de cancro colorectal é correlacionado com uma sobrevida global em 5 anos melhorado. Um elevado nível de infiltração de células T pode servir como um melhor indicador de prognóstico de estadiamento histopatológico convencional [31]. No entanto, também tem sido demonstrado que doentes com cancro colorectal tem uma população expandida de Treg. O aumento do número de células Treg CD4 pode suprimir

função da célula T + em resposta a antigénios associados a tumores [32]. Também tem sido relatado que a frequência de Tregs em TDLNs foi correlacionada com a fase da doença [33]. pacientes com câncer colorretal com alta expressão de Th1 ou genes do cluster citotóxicos têm uma sobrevida livre de doença prolongada. Por outro lado, a alta expressão dos genes Th17 do cluster resulta em um mau prognóstico [34,35]. A relação entre o associado a tumores B7-H1 e a função das células T infiltradas no microambiente do tumor tem sido bem estabelecida. É também bem aceite que associado a um tumor B7-H1 pode ajudar as células tumorais escapar à vigilância imunitária através da inibição da função das células T efectoras e melhorando a função de Tregs no cancro colorrectal [36]. E nossos resultados suportam esta noção em alta expressão de B7-H1 que pode paralisar o immunesurveillance de acolhimento está associada com mau prognóstico no câncer colorretal.

No entanto, a função de B7-H1in a supressão da imunidade tumor ainda não é totalmente compreendido. Por exemplo, como B7-H1 regula a função da célula T e o receptor putativo não-DP-1 devem ser identificados. A identificação de B7-1 como um novo receptor de B7-H1 feita a questão mais complexa, e a complexidade destas interacções moleculares sugere que o bloqueio de B7-H1 ou PD-1 por si só pode não ser suficiente para bloquear as vias inibitórias. E nossos resultados fazem esta pergunta mesmo tornar-se mais complicado. Os nossos resultados mostraram que as células com expressão reduzida de B7-H1 tinha prejudicada a proliferação celular, migração e invasão. Além disso, a redução B7-H1expression levaram a um aumento da apoptose celular (Figuras 3 4). Embora um mecanismo mais detalhada deve ser descoberto para explicar os nossos resultados, estes resultados fornecem evidência de que B7-H1 pode ser não só um ligando para a DP-1 ou um receptor putativo não-DP-1, mas também funcionar como uma molécula oncogénica. Tomados em conjunto os nossos resultados e as literaturas precedentes, podemos chegar à conclusão de que B7-H1 pode acelerar a progressão do cancro colo-rectal, embora a inibição da função das células T e aumentar o grau de malignidade da célula do cancro colo-rectal, tornando-se assim associada com o mau prognóstico em pacientes com câncer colorretal.

Notamos também uma literatura recentemente obter uma conclusão contraditória com o nosso estudo.