Abstract
Fundo
extensiva de próstata rastreio antigénio específico para câncer de próstata gera um número elevado de biópsias desnecessárias e excesso de tratamento devido a insuficiente diferenciação entre tumores indolentes e agressivos. Nossa hipótese é que o plasma seminal é uma fonte robusta de novos biomarcadores de câncer de próstata (PCA) com o potencial de melhorar o diagnóstico primário de e para distinguir avançada da doença indolente.
Metodologia /Principais Achados
um open-label estudo de caso /controle de 125 pacientes (70 APC, 21 de hiperplasia benigna da próstata, prostatite crônica 25, 9 controles saudáveis) foram inscritos em 3 centros. painéis de biomarcadores a) para o diagnóstico de PCA (comparação de pacientes CaP contra controles benignos) e b) para a doença avançada (comparação de pacientes com pós cirurgia marcar Gleason 7 versus escore de Gleason 7) foram procurados. coortes independentes foram utilizados para a descoberta de biomarcadores proteómica e testar o desempenho dos perfis de biomarcadores identificados. O plasma seminal foi perfilado utilizando espectrometria de massa de electroforese capilar. foram determinados a estabilidade pré-analítica e precisão analítica da análise do proteoma. aprendizagem de máquina de vetores de suporte foi utilizado para a classificação. aplicação por passos de duas assinaturas de biomarcadores com 21 e 5 biomarcadores desde 83% de sensibilidade e especificidade de 67% para a detecção CaP no teste de um conjunto de amostras. Um painel de 11 biomarcadores para a doença avançada discriminação entre pacientes com Gleason score 7 e confinado ao órgão ( pT3a) ou doença avançada (≥pT3a), com sensibilidade de 80% e 82% de especificidade em um cenário de validação preliminar. perfis seminais mostraram estabilidade pré-analítica excelente. Oito biomarcadores foram identificados como fragmentos de N-acetyllactosaminide beta-1,3-N- acetilglucosaminiltransferase, fosfatase ácida prostática, Stabilin-2, um membro da família de GTPase IMAP 6, semenogelina-1 e -2. tamanho da amostra restrita era a principal limitação do estudo.
Conclusões /Significado
O plasma seminal representa uma fonte robusta de potenciais tomadores de peptídeos para o diagnóstico CaP primário. Nossos resultados justificam a validação ainda mais prospectivo para confirmar o potencial diagnóstico de identificados os candidatos biomarcadores seminais
Citation:. Neuhaus J, Schiffer E, von Wilcke P, Bauer HW, Leung H, Siwy J, et al. (2013) Seminal Plasma como fonte de candidatos Prostate Cancer Peptide biomarcador para detecção de indolente e doença avançada. PLoS ONE 8 (6): e67514. doi: 10.1371 /journal.pone.0067514
editor: Antonia Vlahou, Fundação de Pesquisa Biomédica, Academia de Atenas, Grécia |
Recebido: 24 de setembro de 2012; Aceito: 23 de maio de 2013; Publicação: 24 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Neuhaus et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado em parte pelo Ministério alemão da Economia e Tecnologia do BMWi com concessão No. KF0362802MD8 para JUS, JN, PW, ES, JS e conceder No. EP110141 para ES e JS. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. ES e JS são funcionários da Mosaiques Diagnostics GmbH. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
O câncer de próstata (PCA) é o segundo cancro mais frequentemente diagnosticado e a sexta maior causa de morte por câncer em homens em todo o mundo [1]. A introdução de rastreio da próstata no soro Antigénio Específico (PSA) conduziu a um aumento significativo no número de casos diagnosticados [2], mas não conseguiram demonstrar uma vantagem estatisticamente significativa de mortalidade do cancro da próstata [3]. Noventa e cinco por cento dos homens com cancro detectado-PSA que são seguidas por 12 anos não morrem de CaP, mesmo na ausência de tratamento definitivo, tais como prostatectomia radical, terapia de radiação ou terapia hormonal [3].
Este exagerou significativamente nossa incapacidade atual para fazer recomendações baseadas em evidências sobre as opções de tratamento de acordo com o comportamento do tumor, ou seja, clinicamente insignificante, ou doença indolente e clinicamente significativo ou doença avançada [4]. Por conseguinte, novas modalidades de rastreio são urgentemente necessários para reduzir o número de homens que necessitam de biópsia e para melhorar a precisão discriminatório entre tumor indolente, que tem um prognóstico clínico favorável, mesmo sem a intervenção, e doença que é provável que já têm clinicamente avançada, a fim de reduzir o excesso de diagnóstico e sobre-tratamento.
proteômica triagem biomarcador tornou-se popular durante a década passada. O sangue, urina, fluidos da próstata, e no tecido prostático foram avaliadas como fonte de biomarcador. Vários candidatos a biomarcadores encontrados nesses estudos foram introduzidas como biomarcadores em uma tentativa de abordar as necessidades clínicas para a discriminação da doença indolente e avançada [5] – [7]. No entanto, todos os biomarcadores individuais disponíveis atualmente, não têm precisão de diagnóstico para a aplicação clínica de rotina. A variabilidade biológica elevada de cancro da próstata sugere que um conjunto distinto de biomarcadores claramente definido, em vez de um único biomarcador, pode ser mais eficiente para avaliar com precisão a doença. avanços técnicos recentes, especialmente em espectrometria de massa e computação, permitir a aplicação de perfis proteômica para a descoberta de biomarcador de proteína múltipla.
Recentemente, foram identificados e validados um padrão proteômica de 12 que ocorrem naturalmente, biomarcadores peptídicos urinários em massa eletroforese capilar espectrometria de massa (CE-MS), capaz de detectar CaP utilizando primeiro fluxo de urina com uma sensibilidade de 90% e 61% de especificidade [8], [9]. Estas experiências sugeriram que os fluidos da próstata podem servir como fonte de biomarcadores [10]. Com base nesses achados, a hipótese de que o plasma seminal pode oferecer uma fonte robusta para identificar novos perfis fabricante de proteína APC. Este estudo teve como objetivo a avaliação sistemática da estabilidade plasma seminal pré-analítico e de sua adequação para o desenvolvimento de painéis de biomarcadores APC.
Resultados
desfecho clínico dos pacientes
total de 70 pacientes com PCA, 21 pacientes com hiperplasia benigna da próstata (HBP), 25 pacientes com prostatite crônica (CP) e 9 controles saudáveis (HC) foram incluídos no estudo (Tabela 1 e Figura 1). CP e grupos HC eram significativamente mais jovens do que os pacientes no grupos hiperplasia benigna da próstata (HBP) (Tabela 1) APC e. Como os níveis de PSA esperados foram significativamente menores no CP e HC em comparação com BPH (0,98-6,70 ng /ml) ou PCA (2,0-20 ng /ml) em ambos, treinamento e conjunto de teste (p 0,05, teste de Mann Whitney, dois atado; Tabela 1). A classificação TNM revelou 60 confinado ao órgão (≤pT2c) e 10 avançada PCA (≥pT3a). A alocação dos pacientes nos grupos de baixo e alto risco variou consideravelmente entre os sistemas de classificação (Tabela 1).
Para a descoberta de biomarcadores no total de 125 amostras de plasma seminal foram utilizados a partir de 70 pacientes com PCA, 21 pacientes com hiperplasia benigna da próstata ( BPH), 25 pacientes com prostatite crônica (CP) e 9 controles saudáveis (HC). Este conjunto de amostras disponíveis foi usada na composição variada em três braços do estudo. No estudo A “diagnóstico Marcadores” 50/125 pacientes com e sem câncer de próstata (22 APC, 14 CP; 9 BPH e 5 HC) foram utilizados para a descoberta de biomarcadores e os restantes 75/125 pacientes (48 APC, 12 BPH, 11 CP , e 4HC) foram usadas para testes de desempenho de diagnóstico. No Estudo B “Advanced Disease Markers” amostras de CaP disponíveis (n = 70) foram estratificados de acordo com a pontuação de Gleason. Para os pacientes descoberta de biomarcadores com pontuação de Gleason 7 (n = 21) e escore de Gleason 7 (n = 16) foram comparados. Os restantes 33/70 pacientes com Gleason score 7 (28 indolente doença pT3a e 5 ≥pT3a doença avançada de acordo com as diretrizes da EUA) foram utilizados para testar o desempenho clínico. perfis Além disso, na avaliação preliminar estudo C de estabilidade e precisão da abordagem foi realizada.
perfis proteômica
Análise CE-MS renderam alta resolução (Figura 2, Tabela S1). Para a calibração perfil preliminar usamos isótopos peptídeos sintéticos rotulados como referência. Este pré-calibração permitiu a definição de 287 “péptidos de manutenção da casa”, como pontos de dados em massa de referência e tempo de migração. Quando a intensidade de sinal de iões (de amplitude) mostrou uma variabilidade significativa, os sinais de 46 péptidos altamente abundantes foram usadas como peptídeos padrão interno para normalização de sinal (Tabela S2). Estes péptidos estavam presentes em 97% das amostras analisadas e mostrou menor variabilidade do sinal. O procedimento para usar “padrão interno” para normalizar a amplitude, mostrou-se de um método simples e de confiança para tratar tanto as variações analíticas e diluição em um passo de calibração simples [11]. espectrometria de massa em tandem [12] – [14] identificou 141 peptídeos seminais nativas representando 47 proteínas parentais diferentes (Tabela S3). Oitenta e oito peptídeos identificados (83/141, 59%) eram fragmentos de semenogelina-1 ou -2, de longe, os peptídeos mais abundantes do peso molecular proteoma seminal baixa.
Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massa de perfis do plasma seminal humano revelou um total de 1784 péptidos. Os péptidos sintéticos perfurantes para as amostras para efeitos de pré-calibração estão marcados com setas brancas. peso molecular normalizado (700-25,000 Da) na escala logarítmica é plotado contra o tempo de migração normalizada (15-45 min). A intensidade de sinal significativo do pico polipéptido é dada em 3D-representação. conjuntos de dados compilados de PCA (caso) combinados todos os controles e também separadamente CP (controle), BPH (controle) e HC (controle) do conjunto de treino são mostrados.
descoberta de biomarcadores
Estudo a:. marcadores de diagnóstico da
Para a descoberta de biomarcadores de diagnóstico dividimos as 125 amostras disponíveis em uma descoberta definido com 22 APC, 14 CP; 9 BPH e 5 amostras de HC e os restantes 48 APC, 12 BPH, 11 CP, e as amostras 4HC em um conjunto de teste independente (Figura 1). Várias estatísticas de teste resultou em 21 discriminatórios polipéptidos alterados significativamente entre pacientes com ou sem cancro da próstata (Tabela 2 e Figura 3). Seis dos 21 polipéptidos foram identificados como fragmentos de N-acetyllactosaminide beta-1,3-N- acetilglucosaminiltransferase, fosfatase ácida prostática, semenogelina-1 e -2 (Tabela 3). . A fim de definir os candidatos biomarcadores diferenciar confiavelmente APC e BPH, comparamos BPH
vs
PCA, BPH
vs
CP . HC, e BPH
vs
CaP CP HC usando várias estatísticas de ensaio adequadas. Cinco polipéptidos foram significativas em todos os três testes que sugerem adequação destes candidatos para identificar especificamente BPH e, por conseguinte, para excluir a presença de CaP (quadro 2, figura 3). Um deles era um fragmento de membro da família GTPase IMAP 6 (Tabela 3).
peso molecular Normalizada (700-25,000 Da) na escala logarítmica é plotado contra o tempo de migração normalizada (15-45 min). A intensidade de sinal significativo do pico polipéptido é dada em 3D-representação. conjuntos de dados médio do conjunto de treino são mostrados
Nós aplicamos uma abordagem de duas etapas:. (i) um primeiro painel (21 polipeptídeos, 21PP) para discernir APC e BPH a partir de próstata inflamatória e saudável; (Ii) um segundo painel (5 polipéptidos, 5PP) para diferenciar CaP e BPH. Ambas as assinaturas foram treinados na coorte de descoberta (Figura 1), utilizando algoritmos de máquinas de vetores de suporte (SVM) e alcançou valores da AUC de 100% (IC 95% 93% -100%) para 21PP e 99% (IC 95% 90% -99 %) para 5PP.
para confirmação de desempenho da classificação das assinaturas de biomarcadores foi aplicada a combinação de 21PP e 5PP a um conjunto de testes independente de 48 APC, 12 BPH, 11 CP e 4HC (Figura 1). Amostras positivas para 21PP (acima da classificação cortadas) foram re-classificados usando 5PP para identificar especificamente BPH excluindo CaP. Portanto, as amostras positivas e negativas para 21PP para 5PP foram considerados como APC, as amostras positivas em ambos os painéis foram considerados como BPH e amostras negativas para 21PP (abaixo da classificação cortada) foram considerados como CP ou amostras de controlo HC. Esta abordagem identificou corretamente 40 das 48 amostras de CaP [sensibilidade de 83% (IC 95% 70% -93%)], 6, de 12 de BPH e 12 de 15 controles [67% de especificidade (IC 95% 46% -83%)] . valor AUC foi de 75% (IC 95% 64% -83%,
P
= 0,0001). O desempenho observado de diagnóstico foi tão elevado quanto o desempenho do PSA como referência, a qual mostrou 87% de sensibilidade (IC de 95% 75% -97%) e 59% de especificidade (IC de 95% 40% -80%).
Estudo B: biomarcadores doença avançada
Para a descoberta avançada doença biomarcador dividimos as 70 amostras de CaP disponíveis em um conjunto de treinamento com 37 amostras de CaP (21 pós-cirurgia Gleason score 7, 16 pós-cirurgia de Gleason marcar 7). Os restantes 33 amostras com pós-cirurgia Gleason score 7 foram usados como um conjunto de teste. Comparação do 21 GS 7 pacientes ( pT3a) a 16 GS 7 pacientes (11 pT3a, 5 pT3a) usando as estatísticas corrigido para ensaios múltiplos resultou em 11 candidatos biomarcador com um fragmento de Stabilin-2 entre eles (Tabelas 2 e 3). Estas como padrão (11PP) foram encontrados para classificar a coorte com uma AUC de 99% (IC de 95% 87% -100%, Figura 1).
Para testar o desempenho dos biomarcadores associados com doença avançada, 11PP foi aplicada ao conjunto de teste de pacientes com pós-cirurgia Gleason 7, que não foram utilizados para a descoberta de biomarcador. Das 33 amostras, 9 marcou tão avançado (acima da classificação cortadas) e 24 tumor como indolente (abaixo a classificação cortadas).
Na prática clínica vários sistemas de classificação são usados para estimar o risco de progressão do cancro da próstata . Portanto, nós comparamos o desempenho dos nossos biomarcadores para cinco sistemas comumente utilizados (Tabela S4): resultados 11PP foram significativamente correlacionados aos estágios TNM [rho 0,423 (IC 95% 0,093-0,669), P = 0,0142], pontuação EAU [rho 0,408 ( IC 95% 0,076-0,659), P = 0,0183] e pontuação NCCN [rho 0,365 (IC 95% 0,024-0,629), P = 0,0370] (Figura 4A-C), enquanto Capra, RTOG e D’Amico pontuação não eram correlacionada (resultados não apresentados). Usando a classificação EAU como padrão de referência, 11PP corretamente identificados 4/5 avançado (≥pT3a) e 23/28 órgão-confinada ( pT3a) tumores, resultando em uma AUC de 83% (IC 95% 66% -94%,
P
= 0,0055, frente e verso β potência = 0,84, Figura 5D). Sensibilidade foi de 80% (IC 95% 29% -97%) e especificidade foi de 82% (IC 95% 63% -94%)].
.box e suiça parcelas (A) de resultados obtidos em 11PP a coorte de teste de pacientes APC com o GS 7 estratificados de acordo com TNM, (B) EAU, e sistemas de classificação (C) NCCN. quadrados pretos indicam medianas e bigodes 1,5 vezes a intervalos interquartil. correlação de postos coeficientes de Rho, o respectivo IC 95% e P-valores são dados acima. curva (D) ROC (linhas pretas) para a classificação 11PP da coorte de validação independente de pacientes com CaP GS 7 com doença indolente (N = 28) ou avançado (N = 5) de acordo com a classificação de EAU como padrão de referência. intervalos de confiança de 95% estão representados graficamente como linhas tracejadas. A linha diagonal representa supondo probabilidade com uma área sob a curva de 0,5. intervalos de confiança de 95% (IC) são apresentadas como linhas a tracejado.
(a) um média de 1887 ± 202 polipéptidos foi detectada em cada uma das 14 medições armazenados para diferentes vezes à TA. A média é marcado com uma linha a negrito; desvio padrão é destaque em cinza. (B) para além desta avaliação qualitativa assinaturas biomarcadores foram aplicadas para a estabilidade 14 replica para obter os dados quantitativos de estabilidade dependente do tempo do plasma seminal. Para 21PP análise de correlação classificada revelou uma diminuição significativa dos escores SVM longo do tempo com rho de Spearman de -0,576 (95% CI -0,854 para -0,07, P = 0,0379). A análise de regressão revelou uma taxa de decréscimo de -0,05 u.a. ( 2%) por hora. 5PP e 11PP exibida nenhuma dependência tempo significativo. (C) precisão analítica dos classificadores SVM estabelecidos foi avaliada aplicando-a a 15 conjuntos de dados CE-MS obtidos a partir de repetições independentes de uma amostra de um paciente de 57 anos com BPH significativo. Pontuações médias de classificação foram 0,619 ± 0,07, 2,290 ± 0,