Abstract

O mau prognóstico do carcinoma hepatocelular (HCC) relacionados ao diagnóstico tardio requer o desenvolvimento de biomarcadores de diagnóstico precoce. Temos anteriormente delineado a paisagem da metilação do DNA em pacientes com CHC desvendar a importância da hipometilação do promotor na ativação de Câncer e genes de condução metástase. O propósito do presente estudo foi o de testar a viabilidade de que os genes que estão em hypomethylated HCC poderia servir como marcadores de diagnóstico candidatos. Nós usamos a análise de fusão de alta resolução (HRM) como um método simples traduzível baseado em PCR para definir estados de metilação em amostras clínicas. Testamos sete regiões selecionadas da lista de genes hypomethylated no HCC e mostrou que a análise de HRM de vários deles distingue estados de metilação em amostras de câncer de fígado de fígado normal adjacente e hepatite crônica na região de Xangai. Essas regiões foram identificados dentro promotores da glicoproteína de membrana neuronal genes A12 melanoma antígeno família (MAGEA12) M6-B (GPM6B) e. Diferenças na GRH na imunoglobulina superfamília de receptores de Fc (FCRL1) separados tumores invasivos de HCC menos invasiva. Os biomarcadores identificados diferenciado HCC de hepatite crônica em um outro conjunto de amostras de Dhaka. Embora o foco principal em diagnósticos metilação do DNA no câncer está em genes hypermethylated, o nosso estudo, pela primeira vez ilustra o uso potencial de genes hypomethylated como marcadores para tumores sólidos. Após uma validação adicional em uma coorte maior, o DNA identificou hypomethylated regiões podem tornar-se importantes candidatos a biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico do câncer de fígado, especialmente em populações com alto risco para o desenvolvimento de HCC

Citation:. Stefanska B, Bouzelmat A, Huang J, Suderman H, Hallett M, ZG Han, et al. (2013) Descoberta e validação de DNA A hipometilação Biomarkers para o cancro do fígado utilizando sondas HRM-Specific. PLoS ONE 8 (8): e68439. doi: 10.1371 /journal.pone.0068439

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Março, 2013; Aceito: 29 de maio de 2013; Publicação: 07 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Stefanska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por doações do Ministère du Développement Economique, de l’Innovation et de l’programa (MDEIE) do governo de Quebec (No. 215004, de MS) Exportação, o Instituto canadense de Pesquisa em Saúde (No. MOP-42411, a MS) e Centro Internacional de Doenças diarreicas Research, Bangladesh (ICDDR, b). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Aberrações em modificações epigenéticas, particularmente nos padrões de metilação do DNA, têm sido associados ao desenvolvimento e progressão do cancro em muitos estudos nas últimas décadas [1], [2], [3]. A hipermetilação de genes supressores de tumor ligado ao silenciamento transcricional, desmetilação de ADN globais associados a rearranjos do genoma e a instabilidade, e recentemente relatado hipometilação promotor ligado à activação de oncogenes e genes prometastatic são características de quase todos os tipos de cancro [2], [3], [ ,,,0],4], [5]. a hipermetilação do ADN de genes supressores de tumores tem sido mostrado como tendo um potencial de diagnóstico de vários cancros [6], [7], [8], no entanto a nossa recente desenrolar do vasto âmbito de hipometilação em cancro do fígado sugerem que biomarcadores potenciais podem ser encontrados em hypomethylated genes que desempenham um papel crítico na condução do cancro e metástases do cancro [4]. Identificar biomarcadores confiáveis ​​de HCC é de particular importância uma vez que o início tardio dos sintomas clínicos é responsável por um diagnóstico tardio e alta taxa de mortalidade. Estima-se que a detecção precoce do HCC aumenta a taxa de cura de 5% a 80% [9].

Nós já usou uma abordagem de todo o genoma para delinear perfis de metilação do promotor DNA em tumores HCC e revelou cerca de 2.000 genes cujas promotores foram hypomethylated em tumores, em comparação com o tecido normal adjacente combinados [4]. Estes genes foram implicados em processos biológicos e vias cruciais para o desenvolvimento de câncer e invasão, o que aponta para um papel funcional importante das alterações observadas. A hipometilação foi observada em várias famílias de genes através de cromossomos. A questão de saber se ele vai especificamente marcar tumores e diferenciar amostras tumorais de tecido saudável. Em nosso trabalho anterior, nós nos concentramos na comparação entre as diferenças na metilação do DNA média em todo o promotor e as mudanças anti-correlacionadas na expressão gênica. Foram analisados ​​em detalhe 230 genes que foram induzidas e hypomethylated em tumores HCC. A maioria destes genes caiu em uma categoria de promotores com elevado teor de CpG. No presente estudo sobre biomarcadores hipometilação de DNA para o cancro do fígado, foram selecionados primeira genes que foram fortemente hypomethylated em amostras de carcinoma hepatocelular, em comparação com o tecido normal adjacente combinados (mudança ≥2 vezes na metilação do promotor com base na análise de microarray,

P

10E-4). Este grupo de genes foi, em seguida, rastreados para a sonda mais consistentemente hypomethylated (região de 200-400 pb, ≥1.5 vezes mudança,

P

10E-3) entre os pacientes, conforme determinado pela análise de microarray. A fim de aumentar a relevância funcional de biomarcadores potenciais, que subsequentemente esta lista limitada de 47 genes que foram induzidas em tumores HCC como medido por matrizes Affymetrix (mudança ≥1.5 vezes,

P

0,05, Quadro S1 ). Levando-se em conta as mudanças na metilação do promotor, a expressão e a extensão da desmetilação das sondas específicas, escolhemos sete genes que demonstraram o maior hipometilação promotor, as sondas mais hypomethylated através das pacientes e alta indução da expressão. Além disso, limita a lista para genes com funções relacionadas com o cancro com base em conjuntos de dados disponíveis publicamente como detalhado abaixo. Estes sete genes hypomethylated como listadas na Tabela 1 foram selecionados para identificar e otimizar sondas específicas cuja metilação diferencial seria distinguir tumores de tecidos normais usando alta resolução de fusão análise (GRH). A análise HRM é um método simples baseado em PCR facilmente transponível para definição clínica para detecção de diferenças nos padrões de metilação do DNA [10]. Este método requer um tratamento de ADN com bissulfito que converte resíduos de citosina em uracilo deixando resíduos de 5-metilcitosina afectada. A seguir à amplificação, resulta em alterações na sequência de ADN de uracilo onde é convertido em timidina e 5-methylcytosines permanecem como as citosinas. fragmento amplificado de ADN não metilado que contém timidina em vez de citosina dentro de sequências CpG apresenta diferentes propriedades de fusão do que o ADN metilado. Seguindo otimização primer, três sondas correspondentes a três genes

NEURONAL glicoproteína de membrana M6-B

(

GPM6B

),

MELANOMA ANTIGÉNIO FAMÍLIA A 12

(

MAGEA12

) e

superfamília de imunoglobulinas FC RECEPTOR

(

FCRL1

), foram encontrados para diferenciar HCC a partir de tecido normal adjacente e /ou tumores invasivos de tumores não-invasivos em um conjunto chinês de amostras, bem como HCC de infecção por hepatite B crónica (HBC) em amostras de Bangladesh.

GPM6B

está envolvido no desenvolvimento neural e regulação da formação óssea [11], [12]. A expressão deste gene foi mostrado no genoma vasta de perfis transcriptoma para servir como um preditor de tumores cerebrais [13], [14] e leucemias linfóides [15]. Alta expressão de

MAGEA12

, membro do oncogênico

MAGE

família, foi mostrado para ser associado com carcinoma da bexiga [16], melanoma [17], o cancro da mama [18] e oral de células escamosas carcinoma [19].

FCRL1

é uma proteína de membrana da superfície celular expressos preferencialmente em células B que regulam a activação de células B e diferenciação [20]. Alta expressão deste gene foi observado nos melanomas metastáticos [21] e em diferentes tipos de leucemias [20]. Nenhum destes genes ou o seu estado de metilação foi previamente ligado ao HCC.

MAGEA12

foi mostrado antes de ser reprimida nas células normais por metilação do promotor e ativado em células cancerosas por desmetilação [22], [23], ao passo que o papel da

GPM6B

e

FCRL1

metilação na atividade do promotor não foi previamente testado. Nosso presente estudo valida pela primeira superexpressão momento da

GPM6B

,

MAGEA12

e

FCRL1

em pacientes com CHC em relação ao tecido normal e investiga a metilação do DNA dentro de seus promotores como um potencial marcador de diagnóstico de câncer de fígado. Desde o diagnóstico precoce do HCC aumenta a taxa de cura e sobrevivência, os candidatos a biomarcadores epigenéticas identificadas poderiam ter um impacto sobre o resultado da terapia de câncer de fígado após a validação em uma coorte maior.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito, e ao Comité de Ética das instituições em causa (Chinese National Human Genome Center em Shanghai, China e Bangabandhu Sheikh Mujib University Medical (BSMMU), Dhaka, Bangladesh) aprovou o estudo .

pacientes e amostras de tecido

amostras de tecidos adjacentes cancerosas e normais foram obtidos de 12 pacientes com HCC e 1 paciente com pseudotumor inflamatório (paciente controle) em chinês National Human Genome Center em Shanghai, China (Dr. Ze-Guang Han) (Tabela 2). coorte de Bangladesh consistiu de 4 pacientes com CHC e 4 doentes com HBC em Bangabandhu Sheikh Mujib University Medical (BSMMU), Dhaka, Bangladesh (Tabela 2). As amostras de HCC foram obtidos a ecografia guiadas aspiração com agulha fina, enquanto as amostras CHB foram obtidos a per-cutânea biópsia hepática usando agulha de biópsia Tru-cut. Em ambos os casos foi utilizada anestesia local.

isolamento de ADN e tratamento bissulfito de DNA

DNA a partir de amostras cancerosas, normal adjacente, e CHB foi isolada usando a técnica de extração de fenol-clorofórmio padrão. bissulfito de conversão foi realizada tal como anteriormente descrito [24]. Resumidamente, 2 mg de DNA foi linearizado com EcoRI e incubadas durante 3 h a 37 ° C, seguido de purificação utilizando o Kit de Purificação de limpeza rápida por PCR (GenScript) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADN purificado foi então desnaturado com NaOH 3M e incubou-se durante 15 minutos a 37 ° C. 3,6 M recentemente preparada de sódio bissulfito mistura hidroquinona mM /1 (pH 5,0) foi adicionado ao ADN desnaturado e incubadas durante 2 minutos a 95 ° C e depois 8 horas a 55 ° C, seguido de 2 minutos a 95 ° C e 2 h a 55 ° C. As amostras de DNA foram então dessalinizada e purificada (Kit de Purificação de PCR de limpeza rápida, GenScript). O ADN purificado foi de novo desnaturado com NaOH 3M e incubou-se durante 15 minutos a 37 ° C. A solução foi neutralizada por adição de acetato de amónio para uma concentração final de 10 M e o DNA foi precipitado com etanol a 95% e o sedimento foi ressuspenso em 50 ul de água destilada.

A amplificação por PCR do ADN convertido com bissulfito

reacções de amplificação continha 25 ug de ADN genómico tratado com bissulfito, 0,4 uM para a frente e os iniciadores listados na Tabela S2, 10 ul de 10 × Luz Cycler 480 SybrGreen I Mestre (Roche) reversa num volume final de 20 ul. A amplificação foi realizada num termociclador utilizando as seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 10 min, a amplificação durante 40 ciclos a 95 ° C durante 1 min, temperatura de recozimento durante 2 min 30 s, 72 ° C durante 1 min, e extensão final a 72 ° C durante 5 min. Como mostrado na Tabela S2, e fora aninhados conjuntos de iniciadores foram utilizados para várias sondas, a fim de melhorar a eficiência de amplificação. O ADN amplificado foi então submetido a fusão de alta resolução (GRH).

análise de fusão de alta resolução (GRH)

O ADN amplificado foi transferido para a luz Cycler 480 QPCR instrumento (Roche) que permite HRM. As amostras foram gradualmente aquecida desde 40 ° C durante 1 min a 60 ° C durante 15 s e finalmente o ADN foi fundido a 95 ° C durante 15 s. O derretimento do produto de PCR induz uma diminuição da fluorescência de SybrGreen desde SybrGreen como um corante intercalante de ADN está a ser libertado a partir de ADN de cadeia dupla na sequência de dissociação. O sinal de fluorescência é adquirido durante a fase de fusão e analisadas pelo software de Luz Cycler 480. A temperatura de pico de fusão de um fragmento amplificado de ADN é definido pelo ponto médio da fase de fusão em que a taxa de alteração na fluorescência é a maior. Este ponto de fusão depende da sequência e do comprimento do fragmento amplificado e é específica para cada produto. Como a seguir ADN metilado com bissulfito de conversão após a amplificação contém os pares de bases GC, a temperatura de fusão de uma versão não metilado que contém os pares de bases AT é diferente. O fragmento amplificado desnaturado funde a temperatura mais elevada do que quando não metilado e amostras de estado de metilação diferentes podem ser separados por comparação dos picos curva de fusão. Usando 0% e DNA metilado o controle de 100%, nós mostramos que as sondas testadas revelaram diferenças claras entre DNA não metilado e totalmente metilado. 0% de controlo metilado foi gerado utilizando o kit de amplificação do genoma completo (Sigma), ao passo que um controlo de 100% foi criado por

In vitro

reacção de metilação catalisada por SSSI metiltransferase na presença de um doador de metilo S-adenosil-L-metionina ( SAM). Derretendo picos curva em tumores HCC foram comparados com a média dos picos de fusão em tecidos normais adjacentes a partir de 7 indivíduos com HCC não-invasivo. Esta curva média foi chamado aqui como referência adjacentes normal (NorAdjRef).

pirossequencia�o

bisulfite específico convertido sequências do promotor foram amplificados com polimerase HotStar Taq DNA (Qiagen) usando primers biotinilados listadas na Tabela S2. As cadeias de ADN biotinilados foram pyrosequenced no instrumento PyroMarkTMQ24 (Biotage, Qiagen), como descrito anteriormente [25]. Os dados foram analisados ​​utilizando o software PyroMarkTMQ24.

extracção de ARN e quantitativa PCR em tempo real (QPCR)

O ARN total foi isolado utilizando TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com a o protocolo do fabricante. 1 ug de ARN total serviu como molde para a síntese de ADNc, utilizando 20 U de transcriptase inversa de AMV (Roche Diagnostics), como recomendado pelo fabricante. A reacção QPCR foi efectuada à luz Cycler 480 máquina (Roche) utilizando 2 ul de cDNA, 400 nM directo e inverso, os iniciadores listados na Tabela S2 e 10 ul de Luz Cycler 480 SybrGreen I Mestre (Roche) num volume final de 20 ul . A amplificação foi realizada utilizando as seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 10 min, a amplificação durante 60 ciclos a 95 ° C durante 10 s, temperatura de emparelhamento para 10 s, 72 ° C durante 10 s, e de extensão final a 72 ° C durante 10 min. A quantificação foi realizada utilizando uma curva padrão e analisados ​​pelo software 480 Roche LightCycler.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando não pareado dois lados

t

-teste ou Mann -Whitney

U

teste. O Mann-Whitney

U

teste foi utilizado para comparações entre os dois grupos, onde os tamanhos das amostras eram pequenas e, portanto, era difícil de verificar suposições de distribuição. Em cada caso, o ensaio é acompanhado por um gráfico de dispersão que mostra todos os valores utilizados no ensaio. Os valores médios são dadas ± S.D. Sempre que necessário,

P

-Valores são ajustados para vários testes usando correção de Bonferroni. Para comparações de quatro vs. quatro amostras (coorte de Bangladesh), foi também utilizado um teste de permutação, onde os dados foram embaralhadas 10.000 vezes e a estatística de teste foi recalculado para cada shuffle. O ambiente de software R para computação estatística foi utilizado para todas as análises estatísticas, exceto o teste de permutação onde as Estatísticas Reamostragem Add-in para o software Excel foi utilizado (Stan em branco, Charles Seiter, Peter Bruce e Estatísticas de reamostragem, Inc. 2000, o Instituto de Estatística educação, EUA).

resultados

Testes e identificação de candidato hypomethylated regiões em HCC por análise de HRM

O objetivo do nosso estudo foi identificar e otimizar regiões hypomethylated em HCC que poderiam diferenciar HCC do tecido normal usando HRM. Foram aplicados vários critérios que previmos irá aumentar a probabilidade de que as sondas são ubiquamente diferencialmente metilada em HCC. Primeiro, selecionamos sete genes (listadas na Tabela 1) que foram identificados em nossa tela anterior de genes hypomethylated em câncer de fígado usando imunoprecipitação metilado DNA (MEDIP) e hibridação de genoma-wide matrizes promotor de oligonucleotídeos. Em segundo lugar, os promotores de genes continha sondas com uma redução média de dobragem na metilação entre CHC e hepática normal superior ou igual a 2 e foram altamente estatisticamente significativa (

P

10E-4). Em terceiro lugar, a hipometilação de seus promotores também foi associada com a sobre-expressão em quase todos os pacientes que foram estudados sugerindo robustez e relevância funcional destas alterações desmetilação de ADN no carcinoma hepatocelular (Figura 1A-C). Em quarto lugar, a análise das suas funções com base em conjuntos de dados disponíveis publicamente, como Gene Ontology (GO), KEGG e NCBI revela processos biológicos e caminhos que são cruciais para a carcinogênese, como regulação do ciclo celular, adesão celular, sinalização célula-célula, a proliferação e diferenciação (Tabela 1). Em quinto lugar, os genes foram previamente associados com cancros humanos, em particular

MAGEA12

[16], [17], [18], [19] no entanto, apenas

DISCOS GRANDE (DROSÓFILA) proteína associada a HOMOLOG 5

(

DLGAP5

) e

MATRIX metalopeptidase 1