Abstract

Fundo

indicaram Dados recentes de que há pode ser uma desregulação do metabolismo endocannabinoid no cancro. Aqui nós investigamos a expressão da metabolização endocanabinóide enzima ácido graxo amida hidrolase (FAAH) em um tissue microarray bem caracterizada de pacientes diagnosticados com câncer de próstata na ressecção transuretral de problemas de esvaziamento.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

imuno FAAH (FAAH-IR) foi avaliada em núcleos não-malignas e tumores embebidos em parafina fixadas em formalina de 412 pacientes com câncer de próstata. CB

imuno receptor 1 (CB

1IR) marca estavam disponíveis para este conjunto de dados. FAAH-IV foi observada nas células epiteliais e paredes dos vasos sanguíneos, mas não no estroma. Tumor epitelial FAAH-IR foi positivamente correlacionada com a gravidade da doença no momento do diagnóstico (escore de Gleason, estágio do tumor,% da amostra que continham tumor) para casos com CB mid-range

pontuações 1IR, mas não para aqueles com alta CB

pontuações 1IR. Para os 281 casos que receberam apenas tratamento paliativo nos estágios finais da doença, um epitelial alta tumor FAAH-IR foi associado a uma sobrevida específica da doença pobres. A análise multivariada de Cox de riscos proporcionais de regressão indicou que FAAH-IR deu informação prognóstica adicional à prevista pelo CB

1IR quando um midrange, mas não uma alta CB

1IR valor de corte foi utilizado. A interleucina-4 (IL-4) do receptor de IR foi encontrada em células epiteliais de tumor e a incubação de células PC-3 e R3327 AT1 cancro da próstata com IL-4 aumentou a sua actividade FAAH.

Conclusões /Significado

tumor epitelial FAAH-IR é associado com gravidade e desfecho câncer de próstata em mid-range, mas não alta, CB

pontuações 1IR. A correlação com a CB

1IR no tecido tumoral pode estar relacionado a uma desregulação locais comum por um componente do microambiente do tumor

Citation:. Thors L, Bergh A, Persson E, Hammarsten P, Stattin P , Egevad L, et ai. (2010) amida de ácido gordo hidrolase em Câncer de próstata: Associação com a gravidade da doença e Outcome, CB

1 Receptor Expressão e regulação dos IL-4. PLoS ONE 5 (8): e12275. doi: 10.1371 /journal.pone.0012275

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Abril de 2010; Aceito: 27 de julho de 2010; Publicação: 19 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Thors et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores agradecer ao Conselho de Ciência sueca (Grant não 12158, medicina, CJ Fowler.); Sociedade Sueca de Câncer (Grant não CAN 2007/712, Anders Bergh.); o Fundo Lions Cancer Research na Universidade de Umeå /Fundo Cancer Research Norrland e dos Fundos de Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade Umeå (C. J. Fowler) para apoio financeiro. A fonte de financiamento para o anticorpo (o Dr. Mackie) foi conceder NIH DA11322. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a forma mais comum de câncer em homens. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer dos EUA (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/prostate), o número de novos casos de câncer de próstata nos Estados Unidos em 2009 foi de 192.280, eo número de mortes devido à doença foi de 27.360. As opções de tratamento variam de expectativa para a prostatectomia, o tratamento hormonal e radioterapia, dependendo da natureza do câncer.

Nos últimos anos, a evidência acumulada sugerem que o sistema endocanabinóide, que compreende o CB canabinóide

1 e CB

2 receptores, sua endógena ligantes anandamida e 2-araquidonoilglicerol, e suas enzimas sintéticas e de degradação, desempenha um papel importante na patogênese e possível tratamento de tipos de cancro, incluindo o cancro da próstata (por comentários recentes, veja [1] – [3 ]). Assim, por exemplo, os canabinóides produzir uma apoptose mediada pelo receptor CB em células de glioma, como resultado de uma produção sustentada da ceramida [4] e vários papéis relataram ambos os efeitos do receptor de CB-dependentes e independentes de de canabinóides sobre a viabilidade, e mobilidade invasivity de ambas as linhas de células de câncer de próstata andrógeno-sensíveis e insensíveis [5] – [11]

In vitro

, um tom endocanabinóide local é um fator importante controlar a doença maligna de células cancerosas da próstata. . Assim, a modulação dos níveis de endocannabinoids, por utilização de inibidores da síntese ou metabolismo endocannabinoid, resulta em uma mudança nas propriedades invasivas das células de cancro da próstata de um modo consistente com um efeito de protecção de endocannabinoids [8], [12]. A anandamida endocannabinoid é metabolizado pela enzima hidrolase gordo da amida do ácido (FAAH) e a sobre-expressão da enzima em células PC-3 resulta num fenótipo invasivo com um comportamento aumentado

In vitro

[12]. Esses autores concluíram que “a inibição da actividade da FAAH pelos inibidores específicos podem ser um alvo terapêutico para o tratamento do cancro da próstata” [12]. inibidores de FAAH, que não produzem o tipo de efeitos comportamentais centrais associados com canabinóides como Δ

9-tetra-hidrocanabinol [13], estão actualmente em desenvolvimento de medicamentos, principalmente com a dor como um alvo terapêutico, e o composto líder é na fase II de seu desenvolvimento.

Menos é sabido sobre o sistema endocanabinóide no tecido tumoral da próstata, mas em um estudo utilizando um grande número de pacientes com uma longa follow-up, que recentemente informou que a expressão de CB

1 receptores em tecido tumoral obtido no diagnóstico foi associada com a gravidade da doença e o prognóstico [14]. Assim, os indivíduos com uma CB

imuno receptor 1 (CB

1IR) acima ou igual à pontuação mediana para o conjunto de dados tiveram uma maior incidência de metástases ao diagnóstico, e uma proporção maior de casos com uma alta pontuação de Gleason (um indicador da gravidade da doença com base na morfologia dos dois tipos de tumores mais comuns na amostra [15]) do que os indivíduos com um CB

1IR abaixo da mediana do conjunto de dados. Além disso, para os indivíduos que tinham sido seguidos pela esperança até o aparecimento de metástases, um alto CB

1IR pontuação foi associado a uma sobrevida específica da doença menor [14]. No que diz respeito a FAAH, tem sido relatado que, em uma micromatriz de tecido comercialmente disponível, a partir de núcleos de tecidos de cancro da próstata tinha uma maior expressão da enzima do que a observada em tecidos normais [12]. No entanto, não existem dados sobre a relação entre a imuno FAAH (FAAH-IR) e a evolução da doença foi apresentado. Além disso, as razões possíveis para o elevado nível de FAAH-IV no tecido tumoral não foram investigados por esses autores. Em consequência, no presente estudo, investigamos a FAAH-IR na tissue microarray usado anteriormente por nós para caracterizar CB

1IR no tecido tumoral [14], e estudos realizados utilizando células cultivadas para ver se um componente conhecido do microambiente do tumor pode afectar a actividade de FAAH. Além disso, temos investigado se FAAH-IR está correlacionada com outras variáveis ​​patogênicos e prognósticos, tais como o número local estágio do tumor eo placar imunorreativo para o receptor do factor de crescimento epidérmico fosforilado (pEGFR).

Métodos

Ética Declaração

o comitê de Ética em Umeå University Hospital (Ethical Review Board Regional em Umeå, Suécia) aprovou o estudo e dispensou a necessidade de consentimento informado.

os pacientes

as, amostras embebidos em parafina fixadas em formalina utilizados no presente estudo foram coletadas no Hospital Central, Västerås, Suécia, entre 1975 e 1991 de um total de 412 pacientes diagnosticados com câncer de próstata em ressecção transuretral para as dificuldades da micção [16 ]. A presença de metástases foi determinada utilizando um varrimento ósseo logo após a ressecção transuretral. Os pacientes foram acompanhados até 2003. Para os 388 casos de tumor FAAH-IR podem ser marcados (veja abaixo), 281 foram seguidos por vigilante espera até o aparecimento de metástases (a abordagem de tratamento padrão na época). Os demais pacientes receberam tratamento hormonal, radioterapia ou prostatectomia radical. As pontuações de Gleason e a percentagem da amostra que continha tumor foram avaliadas em cada amostra. A causa da morte foi avaliada por avaliação dos registros médicos. Tissue microarrays (núcleos com um diâmetro de 0,6 mm) foram construídas utilizando um instrumento Beecher (Sun Prairie, WI, EUA). Cada lâmina tissue microarray (56 no total, geralmente com núcleos de 8 casos por lâmina) continham até oito (normalmente cinco) amostras de tecido de tumor (tanto áreas primárias e secundárias de Gleason foram incluídos) e até quatro (geralmente quatro) amostras de tecido não maligno de cada paciente [16].

a imuno-histoquímica

Os cortes foram desparafinados, re-hidratados e colocados em tampão de citrato de pH 6,0. Depois de ferver em uma panela de pressão, durante 60 min, as amostras foram colocadas em água e, em seguida, em tampão Ventana, após o que foram colocadas em um analisador automatizado Ventana (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) para o qual o anticorpo FAAH (diluição 1 /2000) e o sistema secundário (iVIEW DAB Detection Kit, Ventana Medical Systems, Inc.) foram adicionados. O anticorpo utilizado, um anti-FAAH de coelho produzido contra os últimos 102 aminoácidos da FAAH de rato, tem sido caracterizada em detalhe [17] e foi encontrado para produzir o padrão de coloração apropriado (coloração somatodendrítica de células principais) em tecido fixado em formalina a partir de hipocampo humano (dados não apresentados), consistente com os hipocampo de rato [18], [19]. (

1IR CB) marca

1 imunorreatividade receptor CB estavam disponíveis no banco de dados, e têm sido relatados em outros lugares [14].

Os núcleos individuais foram marcados sob o microscópio para FAAH-IR por um investigador (LT) que era cego aos dados clínicos para os pacientes. O sistema de pontuação utilizado foi essencialmente o mesmo que o utilizado anteriormente para CB

1IR [14]. Em resumo, para que o tecido epitelial, os núcleos foram pontuados para a intensidade imunorreactivo (0-3 onde 0 é ausente e 3 é elevada) e a distribuição no tecido epitelial (0, 10, 25, 33, 50, 67 ou 100% de a distribuição total para cada intensidade). A distribuição da intensidade mais comum foi definido como 100 menos a soma das outras intensidades. A distribuição fracionada em cada intensidade foi multiplicado com o placar intensidade e os valores somados para dar uma pontuação final para o núcleo. Assim, por exemplo, um núcleo com intensidades de 1 (10%), 2 (10%) e 3 (resto) (distribuição entre parêntesis) que recebem uma pontuação composta de 1 × 0,1 + 2 × 0,1 + 3 × 0,8 = 2,7 . Quando identificável no núcleo, o tecido epitelial luminal e basal foi avaliada separadamente. paredes dos vasos sanguíneos foram avaliados do mesmo modo, mas com uma distribuição simples (0, 50 e 100%). Ao longo da pontuação, os exemplos de núcleos marcados como 1, 2 e 3 estavam na mão para comparação como um “padrão interno”. Núcleos em que a estrutura ou a qualidade do tecido não era suficientemente boa, ou onde a coloração não era clara foram excluídos do estudo. Para cada medida, os valores médios para as pontuações compostas para cada paciente foram calculados e inseridos no banco de dados por um segundo investigador (CF). Como medida da fiabilidade das pontuações epiteliais tumorais, 67 núcleos (16 pacientes) foram marcados em duas ocasiões separadas pelo mesmo investigador. O coeficiente de correlação de Spearman para os escores de núcleo individuais entre este piloto eo estudo principal foi de 0,76 (n = 67, p 0,0001, 95% intervalo de confiança 0,63-0,85). O coeficiente de correlação intraclasse para medidas individuais (ICC (2,1), uma medida da reprodutibilidade do método de pontuação) foi de 0,67 (95% intervalo de confiança 0,51-0,78, p 0,001).

A interleucina-4 (IL-4) imunoreactividade dos receptores foi avaliada em fixadas com formalina, embebidos em parafina fatias de tecido utilizando um anticorpo monoclonal para o domínio extracelular do receptor recombinante humano de IL-4 (MAB230, R D Systems Inc., Minneapolis, EUA). A diluição de anticorpo foi de 1/200 e a imunorreacção foi detectado utilizando o sistema de detecção Ventana como acima. tecidos de linfonodo serviu como um controlo positivo.

A cultura de células

células cancerosas humanas da próstata LNCaP (passagem varia 32-38 e 14-19, respectivamente) PC-3 e, e R3327 AT células de câncer de próstata de ratos -1 (variação passagem 49-59) estavam disponíveis no Departamento. As células de PC-3 foram cultivadas em Ham F-10, 2 mM de L-glutamina, 10% de soro fetal bovino e 100 ml

-1 penicilina 100 g ml

-1 estreptomicina (PEST). As células LNCaP foram cultivadas em meio RPMI 1640, glutamina 2 mM, 10% de soro fetal de bovino e de pragas. R3327 células AT-1 foram cultivadas em meio RPMI 1640, 250 nM de dexametasona, 10% de soro fetal de bovino e de pragas. P19 de ratinho de células de carcinoma embrionário (intervalo de passagem 17-19) foram obtidos a partir da European Collection of Cell Cultures (Porton Down, Reino Unido). P19 células foram cultivadas em MEM alfa 22571 com 10% de soro fetal bovino, 1% de aminoácidos não essenciais e e pragas. As células foram cultivadas em 75 cm

2 frascos de cultura, a 37 ° C com 5% de CO

2 em pressão atmosférica humidificada. As células foram passadas duas vezes por semana e meio de cultura de células foi mudado três vezes por semana.

A interleucina-4 (IL-4) estimulação da actividade da FAAH em células de cancro cultivadas

As células foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

6 células por poço em placas de 6 poços. A seguir à incubação durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2, o meio de cultura de células foi mudado, a meio suplementado com IL-4, e incubadas durante um período adicional de 24 horas. As células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e em seguida recolhidas utilizando um polícia de borracha. Em gelo, as células foram ressuspensas em PBS, centrifugadas durante 5 minutos a 1000 x g e sedimento ressuspenso em tampão Tris 10 mM a pH 9. Os homogenatos foram armazenados a -80 ° C em alíquotas até serem usadas. O teor de proteína foi determinado usando albumina sérica bovina como padrão [20].

A atividade de FAAH foi medida como descrito por Boldrup et ai. [21]. Resumidamente, após a incubação de homogenatos com 2 uM de [

3H] AEA marcado na parte da molécula etanolamina (ensaio de pH 9), uma mistura de carvão vegetal (80 ul de carvão 300 ul de 0,5 M de HCl por tubo) foram adicionados e tubos foram colocados em gelo para parar a reacção. O carvão foi então sedimentado por centrifugação, 2500 × g durante 10 minutos, e alíquotas do sobrenadante foram transferidos para frascos de cintilação e teor de trítio foi determinada por espectroscopia de cintilação líquida com correcção de têmpera. Os valores do branco são definidas como o valor acumulado de trítio em ensaios realizados na ausência de homogeneizados.

extracção de ARN e a síntese de ADNc

células PC-3 e LNCaP foram plaqueadas a uma densidade de 1 × 10

6 células por poço em placas de 6 poços e tratadas com IL-4 como acima descrito. Para a análise de PCR, o ARN total foi extraído utilizando o Kit miRNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de ARN foi medida usando um instrumento Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA), e o ADNc foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total utilizando um estojo de síntese de ADNc com iniciadores aleatórios (cDNA de alta capacidade de inverter kit de transcrição; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para PCR semi-quantitativa, as amostras do mesmo grupo de tratamento foram reunidas (n = 6).

semi-quantitativo PCR

Os níveis de ARNm para CB humana

1, de FAAH e GAPDH foram analisadas utilizando um kit de PCR Taq núcleo (Qiagen, Hilden, Alemanha), um termociclador Biometra TProfessional (Biometra, Gottingen, Alemanha) e os seguintes iniciadores: hFAAH (197 pb), directo 5′-TGGAAGTCCTCCAAAAGCCCAG-3 ‘, reverso 5’ – TGTCCATAGACACAGCCCTTCAG-3 ‘, HCB

1 (165 pb), para a frente 5’AAGGTGACATGGCATCCAAAT-3′, reverso 5′-AGGACGAGAGAGACTTGTTGTAA-3 ‘, e hGAPDH (180 pb), para a frente 5’CAACTACATGGTTTACATGTTC-3′, reverso 5’- GCCAGTGGACTCCACGAC-3 ‘. As condições de PCR foram: desnaturação a 94 ° C durante 2 minutos, emparelhamento durante 40 segundos a 57 ° C (GAPDH) ou 60 ° C (de FAAH, CB

1) seguido de alongamento a 72 ° C durante 60 s; desnaturação em ciclos subsequentes, foi realizada a 94 ° C durante 40 s. Para FAAH e CB

1, as análises incluíram 35 ciclos, enquanto que 25 ciclos foram utilizados para GAPDH.

Quantitative PCR em tempo real

Além de PCR semi-quantitativa em amostras colectivas , a análise de amostras individuais foi realizada utilizando quantitativa PCR em tempo real. foram usados ​​tanto SYBR Green (FAAH, CB

1, GAPDH) e TaqMan (ß-actina) cinética. Para FAAH, CB

1 e GAPDH, os iniciadores descritos acima foram utilizadas em conjunto com alimentação mistura SYBR Green PCR Master (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), ao passo que ß-actina humana foi detectada utilizando um iniciador de pré-fabricados mistura -probe (Hs00357333_g1, Applied Biosystems) em conjunto com TaqMan Universal PCR master mix (Applied Biosystems). As amplificações foram realizadas num sistema ABI Prism 7900 HT sequência de detecção e de software (Applied Biosystems), e as amostras foram analisadas em triplicado. Ambos GAPDH e ß-actina foram utilizados como genes de manutenção, com resultados semelhantes (dados para ß-actina não mostrado). A expressão relativa de FAAH e CB

1was calculado a partir de

Ct

valores usando o método de curva padrão.

Western Blot

Por Western blot, amostras de proteína foram sujeitos a electroforese 10% de SDS – gel de poliacrilamida sob condições redutoras e as proteínas fraccionadas foram transferidas electroforeticamente para uma membrana Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas durante a noite a 4 ° C num agitador orbital em leite em pó a 5% não gorda, 0,05% de Tween-20 em PBS (PBS-T) antes da incubação com anticorpo primário de coelho policlonal contra FAAH (1:1000-1 :5000; o mesmo anticorpo, tal como utilizado na parte imuno-histoquímica do estudo) ou anticorpo policlonal de coelho contra actina primário (1:8000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). Os anticorpos primários foram diluídos em PBS-T 3% (FAAH) ou PBS-T 5% (actina) de leite em pó não gordo. Após incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Amersham Biosciences), as proteínas foram detectadas utilizando o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences). tamanhos moleculares das bandas de proteína foram determinadas por electroforese em paralelo de marcadores de peso molecular (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Suécia). As concentrações de proteína foram determinadas por BSA kit de ensaio de proteína (Pierce, Rockford, IL, EUA)

Compostos

A anandamida (etanolamina-1-

3H; atividade específica:. 2.2 TBqmmol

-1) foi obtido a partir de American Radiolabeled Chemicals Inc. (St. Louis, MO, EUA). anandamida não marcado e URB597 foram obtidos a partir de Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, EUA). Interleucina-4 foi obtido a partir de Sigma-Aldrich.

Estatísticas

Com excepção da Cox de riscos proporcionais de regressão e coeficiente de correlação intraclasse análises, que foram conduzidos utilizando software SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA), todos os cálculos estatísticos foram realizados utilizando o pacote estatístico incorporado no programa de computador GraphPad Prism 5, para o Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Para as análises de sobrevivência, um evento foi definida como morte por câncer de próstata e entrou no banco de dados como “evento = 1”. Morte por outras causas foi censurada, como foram os casos em que o paciente ainda estava vivo na data do último seguimento. Estas foram agrupadas como “event = 0”. Casos (n = 3), onde a evolução da doença era desconhecida foram excluídos da análise a sobrevivência. A duração da sobrevida livre de eventos é definido como o tempo desde o diagnóstico até a data de morte por câncer de próstata, a morte de outras causas, ou se nenhuma morte ocorreu, até a data do último seguimento.

Receiver operando characteristic (ROC) curvas foram utilizados para definir pontos de corte para FAAH-IV, que foram então utilizados para construir curvas de sobrevivência usando o método de Kaplan-Meier. Diferenças nos resultados entre os grupos foram testadas com o teste de log-rank. Cox de riscos proporcionais de análises de regressão foram realizadas para avaliar a influência da pontuação FAAH sobre o resultado no CB diferente

cutoffs 1IR. As diferenças na distribuição das variáveis ​​entre os grupos de pacientes foram analisadas pelo teste do qui-quadrado.

Para os leitores não familiarizados com os métodos estatísticos usados ​​para avaliar a influência da FAAH-IR sobre a evolução da doença, uma breve explicação do seu utilidade é garantido, particularmente no que diz respeito à escolha dos valores de corte para FAAH-IR. O teste ROC foi originalmente desenvolvido para ajudar na interpretação de sinais de radar, e traça o número de verdadeiros negativos (1- a fracção falso-positivo, designado por 1 – especificidade).

vs

verdadeiros positivos (sensibilidade) num dado ponto de corte valor (ou seja, para os casos com uma pontuação igual ou maior do que, o valor selecionado). A área sob a curva ROC pode então ser calculado. Para um teste com absolutamente nenhum valor diagnóstico, a curva será uma linha reta com uma área de 0,5. Um teste perfeito iria dar um valor de 1,0, de modo que o mais longe de 0,5 o valor, melhor será o teste. Para um teste com uma área sob a curva significativamente maior do que 0,5, um problema importante é a escolha do ponto de corte, o valor escolhido como um sinal de que o paciente pode ter a doença em questão. Se o valor de corte é ajustada baixa, em seguida, a sensibilidade será alta, mas haverá um grande número de falsos positivos. Se o valor de corte, é estabelecido alto, então o número de falsos positivos será menor, mas um grande número de verdadeiros positivos será desperdiçada. A escolha do ponto de corte é, assim, um trade-off entre a maximização do número de verdadeiros positivos encontrados e minimizar o número de falsos positivos. Escolha de corte depende da importância relativa da falta de verdadeiros positivos

vs.

Misdiagnosing verdadeiros negativos para a doença em questão, mas uma maneira útil de identificar um corte ótimo é determinar o ponto de corte com a distância vertical máxima entre o valor observado e o valor correspondente para um teste de diagnóstico com qualquer valor, calculado como o máximo de sensibilidade + especificidade -1. Este valor é denominado o índice de Youden, J, e temos usado este valor aqui para (J denominado

FAAH) FAAH-IR. Para comentários úteis sobre curvas ROC e a escolha de valores de corte ideais, ver [22] – [24]

No que diz respeito às análises estatísticas das curvas de sobrevivência, o método de Kaplan-Meier, onde diferenças no resultado entre os dois. grupos é testado com o teste log-rank, fornece um método útil (e visual) para avaliar diferenças em curvas de sobrevivência. A Cox de riscos proporcionais de análises de regressão do perigo “em função das variáveis ​​explicativas e coeficientes de regressão desconhecidos multiplicado por uma função arbitrária e de tempo desconhecido” (citação do artigo original de Cox [25]), ou seja, avalia a contribuição de diferentes potenciais fatores de risco sobre o ponto final medida (neste caso, a morte por câncer de próstata) sem fazer suposições sobre a curva de sobrevivência básica em si.

resultados

Distribuição de imuno FAAH em não- maligno e tumor de tecido

FAAH-IR foi marcado em núcleos de um total de 412 pacientes. Destes, os registos de seis pacientes não foram encontrados na base de dados, e para que os dados para estes pacientes não foram incluídos nas análises.

Um exemplo da FAAH-IR para o tecido não-maligno é mostrado na FIG. 1A. FAAH-IV foi observada nas células epiteliais, e nos vasos sanguíneos, assim como em células (linfócitos, possivelmente, que expressam FAAH [26]) a infiltração de estroma em alguns núcleos. Ao todo, 1247 núcleos de 377 pacientes foram marcados por FAAH epitelial não maligna. Destes, 733 núcleos a partir de 307 casos tinha basal definíveis: morfologia luminal e a FAAH-IR para estes casos foram pontuadas separadamente e utilizado nas análises. Além disso, 993 núcleos de 369 casos foram marcados por FAAH-IR nas paredes dos vasos sanguíneos. A distribuição cumulativa das pontuações nas células epiteliais luminais basais e é mostrado na Fig. 1B, onde é evidente que a mediana de FAAH-IR é maior nas células epiteliais basais que nas células luminais. De fato, dos 733 núcleos de gol, a pontuação FAAH-IR basal foi maior do que a pontuação luminal correspondente em 724 núcleos nas duas planilhas foram iguais em 9 núcleos. A pontuação luminal nunca foi maior do que a pontuação basal. O vaso sanguíneo FAAH-IR foi marcado de forma ligeiramente diferente, de modo que uma comparação direta dos valores não é relevante. No entanto, houve uma correlação significativa entre FAAH-IR basal e dos vasos sanguíneos FAAH-IR, mas não entre o luminal e dos vasos sanguíneos FAAH-IR (Tabela 1).

Painel A. Exemplo de FAAH-IR em um núcleo de tecido de próstata não maligna obtido na ressecção transuretral a partir de um doente com 75 anos de idade. Os asteriscos indicam os vasos sanguíneos, e o símbolo # indica células positivas FAAH, presumivelmente linfócitos infiltrantes. No painel C, o FAAH-IR num núcleo de tecido tumoral de um paciente de 64 anos é mostrado. As linhas no canto superior direito acima dos núcleos indicam 100 mm. O painel B mostra as frequências de pontuações cumulativas FAAH-IR para o basal e não-maligna (N) do tecido epitelial luminal (n = 307 em ambos os casos) e para o tecido do tumor (T) epitelial (n = 388). Os valores da mediana (intervalo interquartil entre parênteses) foram: basal (N), 2.625 (2,125-2,9); luminal (N), 1,25 (1-1,75); epitelial (t), 2,05 (1,8-2,3). Os valores médios foram significativamente diferentes umas das outras (p 0,001, teste de comparação múltipla de Dunn significativa seguinte teste de Kruskal-Wallis). Painel D mostra a relação do tumor epitelial FAAH-IR com a pontuação de Gleason (GS) no momento do diagnóstico. As pontuações de FAAH-IR foram divididos em quatro quadrantes que i se refere às pontuações entre 1,8 (n = 96), II entre 1,8 e 2 (n = 94), III, entre 2,05 e 2,25 (n = 99) e IV entre 2,3 e 3 (n = 99). A distribuição dos grupos GS foi significativamente diferente nos quadrantes (χ

2 = 27,03, df = 9, p 0,0005).

Um total de 1851 núcleos de 388 casos foram marcados para FAAH-IR nas células epiteliais de tumor. Para os vasos sanguíneos, 1201 núcleos de 360 ​​pacientes foram marcados. Um exemplo da coloração por um núcleo do tumor é mostrada na Fig. 1C e a distribuição cumulativa das pontuações epiteliais são mostrados na Fig. 1B, onde pode ser visto que a pontuação média foi significativamente mais elevada do que a pontuação luminal não-maligno, mas inferior à pontuação basal.

As amostras utilizadas aqui foram anteriormente investigados por nós no que se refere a expressão de epitelial CB

receptores 1 [14]. Para as amostras não-malignas, não houve correlação significativa entre a CB

pontuações 1IR e quer basal, luminal ou dos vasos sanguíneos FAAH-IR. Em contraste, uma correlação significativa entre o OC tumoral

1IR e o tumor epitelial e dos vasos sanguíneos de FAAH-IV foi observada (Tabela 1).

atividade da FAAH em linhas celulares de cancro da próstata é afectada pela interleucina-4

uma explicação para a constatação de que o tumor epitelial FAAH-IR é maior do que FAAH-IV em tecido normal epitelial da próstata [12] que é um constituinte do microambiente do tumor afecta a sua actividade. O t

H2 citocina interleucina-4 (IL-4), que tem sido relatado para regular FAAH e CB

1 receptores em linfócitos e células Jurkat [26] – [28], está envolvida a patogénese de vários cancro tipos, incluindo cancro da próstata (ver [29] – [35]). IL-4 receptores têm sido relatadas em ambas as células epiteliais tumorais e em linhas celulares de cancro da próstata em cultura [29], [36]. Foi confirmada a presença de IL-4 de IV no tecido da próstata do cancro epitelial (Fig. 2A), e verificou que a incubação de ambos os PC-3 de células humanas de androgénio-insensíveis e de rato Dunning R3327 células de cancro da próstata em-1 com IL-4 para 24 h produziu um aumento significativo na atividade da FAAH das células (Fig. 2B e C). Um resultado semelhante foi observado com células LNCaP do cancro da próstata humana (dados não mostrados). Este efeito da IL-4 não é único para as células de cancro da próstata, uma vez que também foi observada células de teratocarcinoma de rato P19 (Fig. 2D).

Painel A, IL-4 imunorreactividade do receptor numa amostra de tecido de tumor da próstata ( escore de Gleason 8). A linha na parte inferior esquerda da imagem representa 100 m. Os painéis B-D, o efeito de IL-4 sobre a atividade da FAAH de células PC-3 de cancro da próstata humano (B); rato R3327 AT-1 de células de cancro da próstata (C) e as células de teratocarcinoma de rato P19 (D). As linhas de células foram incubadas durante 24 h com 5 ng /ml de IL-4 e a atividade da FAAH em homogeneizados de células foi determinada utilizando 2 ^ M [

3H] anandamida como substrato. A actividade enzimática em todos os casos foi completamente bloqueada pelo inibidor FAAH URB597 selectiva. Os dados são médias e S.E.M., n = 4-5; * P 0,05, ** p 0,01, teste t emparelhado. Em painéis (E) e células PC-3 e LNCaP (f) foram incubadas com IL-4 (5 ng /ml) durante 24 h. Extracção de ARN, síntese de cDNA e análise de PCR foram realizadas como descrito na secção de “Métodos”. A análise de PCR Painel E. semi-quantitativa da expressão de ARNm em células LNCaP de FAAH PC-3 e. A expressão de ARNm de FAAH foi normalizada contra a GAPDH. A análise semi-quantitativa por PCR foi realizada usando amostras reunidas (n = 6). Painel F. quantitativo em tempo real A análise de PCR da expressão de ARNm de FAAH, normalizados contra GAPDH. Os dados de PCR quantitativas são visualizadas como meios (n = 6) e SEM, onde o grupo de controlo não tratado média é definida como 100%.

Em experiências subsequentes, os efeitos do tratamento com IL-4, mediante proteína FAAH e ARNm foram avaliados. O tratamento de células PC-3 LNCaP e com IL-4 durante 24 h não regulam a expressão de ARNm de FAAH, como avaliado tanto por PCR semi-quantitativa e quantitativa PCR em tempo real (Figura 2E, 2F). Numa experiência adicional, as células PC-3 foram tratados com IL-4 (5 ng /ml) durante 3 horas, para estudar possível regulação precoce de expressão da FAAH. Semelhante à experiência 24 h, no entanto, o tratamento de células PC-3 com IL-4 durante 3 h não regulam a expressão de ARNm de FAAH (dados não mostrados). Em contraste com a situação das células de Jurkat e linfócitos T, a expressão do BC

1 em células LNCaP não foi regulada por IL-4: a expressão relativa da CB

1 /GAPDH (% de controlos não tratados, meios ± SEM, n = 6) após 24 h de tratamento com veículo ou IL-4 foi de 100 ± 33 e 109 ± 20, respectivamente. As células PC-3 usados ​​no nosso laboratório não expressaram níveis detectáveis ​​de CB

1 ARNm (dados não mostrados).

As transferências de Western foram também análises preliminares realizadas usando os lisados ​​de células PC3 tratadas durante 24 h com veículo ou 5 ng /ml de IL-4. Para além da banda de peso molecular esperado, bandas adicionais foram vistos sugerindo que pode haver agregação de proteínas e algum colapso nos lisados, a modificação de proteínas pós-tradução pela células, e /ou que o protocolo de ensaio não foi totalmente otimizado, embora três foram usadas diferentes diluições do anticorpo primário. No entanto, nenhuma das bandas mostraram qualquer diferença óbvia na intensidade seguinte tratamento com IL-4, a carga de proteína a ser confirmado com manchas de actina (dados não mostrados)

FAAH-IV no tecido tumoral:. Correlação com a gravidade da doença diagnóstico

na Tabela 2, os coeficientes de correlação para as variáveis ​​tumor FAAH-IR e clínicos determinados no momento do diagnóstico estão listados.