Abstract

Fundo

O selenoenzyme tioredoxina reductase 1 tem um papel complexo relacionados com o crescimento celular. É induzida como um componente da resposta celular a oxidantes potencialmente mutagénicos, mas também parece proporcionar vantagens de crescimento para as células transformadas através da inibição da apoptose. Além disso, a selenocisteína, deficiente ou formas alquilados de tioredoxina redutase 1 também demonstraram oxidativa, actividade pro-apoptótica. Portanto, uma maior compreensão do papel da tioredoxina redutase em redox iniciado processos apoptóticos se justifica.

Metodologia

O papel da tioredoxina redutase 1 em células RKO foi avaliada por meio da atenuação endógena tioredoxina redutase 1 expressão com siRNA e, em seguida, quer induzindo uma tioredoxina redutase de selénio deficiente ou tratamento com desafios distintos redox incluindo, peróxido de hidrogénio, um lípido oxidado, 4-hidroxi-2-nonenol, e um óxido nítrico doar pró-fármaco. estatuto Tiorredoxina redox, viabilidade celular e atividade efetora caspase foram medidos.

Em células com atenuada tioredoxina redutase endógena 1, foi induzida uma forma selenocisteína deficiente integrado de forma estável da enzima

Conclusões /Significado mas não alterou quer o estado redox tiorredoxina ou a cinética de crescimento celular. O lípidos oxidados e o doador de óxido nítrico demonstrou citotoxicidade aumentada quando tioredoxina redutase 1 foi knocked-down; No entanto, o efeito foi mais pronunciado com o pró-fármaco de óxido nítrico. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que a atenuação da tioredoxina-sistema podem promover a apoptose de um modo dependente de óxido nítrico-

citação:. Edes K, P Cassidy, Shami PJ, Moos PJ (2010) JS-K , a citotoxicidade Óxido nítrico pró-droga, aumentou em células de cancro do cólon com Knockdown de Tiorredoxina redutase 1. PLoS ONE 5 (1): e8786. doi: 10.1371 /journal.pone.0008786

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 18 setembro de 2009; Aceito: 30 de dezembro de 2009; Publicação: 20 de janeiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Edes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado por uma USPHS Grant CA115616 (PJM). Reconhecemos também o uso de instalações nucleares apoiadas por CA042014 P30 concedido ao Instituto de Câncer Huntsman. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Moos é apoiado pelo NIH, mas a concepção e execução é o seu próprio. Dr. Shami é um dos fundadores da e possui ações da JSK Therapeutics, Inc. Dr. Cassidy e Ms. Edes declaram não haver conflitos de interesse em potencial.

Introdução

O sistema tiorredoxina de mamíferos consiste na redutase selenoproteína tioredoxina (TR), tioredoxina (Trx), e NADPH doador de electrões. O sistema TR-Trx participa em diversas reacções redox em células [1], de apoiar a síntese do ADN [2] para redox dependente de sinalização celulares vias [3] – [6]. Trx e TR pode facilitar o crescimento e /ou sobrevivência de células malignas como a sua expressão é elevada em alguns tumores [7], [8]. tioredoxina redutase actividade enzimática não se limita a tioredoxina, em vez disso, muitos substratos foram identificadas, incluindo; selenocompounds, ascorbato, lipoato, e lípidos oxidados [9] – [11]. No entanto, alguma função lípidos oxidados para inibir a actividade TR1 por reacção com o terminal C nucleofílica que inclui o resíduo Sec [12] – [14].

O selenocisteína adjacente (SEC) e cisteína (Cys) em resíduos o C-terminal de ATR mamífero são necessários para a actividade da redutase quando Trx é o substrato; no entanto, Sec deficiente TR1 podem ter bioquímicos [15] e biológicos [16] actividades distintas da Sec-suficiente TR1 que possam ser relevantes no cancro ou outra doença. Sec-deficiente TR1 demonstrou actividade pró-apoptótica em estudos avaliaram o papel de TR1 em interferão e a apoptose induzida por ácido retinóico, [17], bem como recente de dados mais apoiar que tem demonstrado sec-deficiente espécies TR1 (SecTRAPs designados) são por -se iniciadores potentes de apoptose em linhas celulares de cancro humano [16]. A apoptose nestes casos foram hipótese de ser mediada por aumento do estresse oxidativo nas células. Estes exemplos sugerem que a interrupção da extremidade C-terminal de TR1 resulta numa proteína com ganho de função que pode ser um agente pró-apoptótica útil se pudesse ser direccionadas para células malignas.

Neste estudo temos examinaram os efeitos sobre as células de cancro do cólon de dois cenários em que a actividade TR1 canónica (isto é, a capacidade de reduzir Trx) foi reduzido quer por tratamento de siRNA ou mutação dos resíduos de SEC e Cys C-terminal. Começamos por avaliar o estado redox de Trx em células de cancro do cólon RKO onde os níveis endógenos TR1 foram atenuados com siRNA. Nestas mesmas células deficientes no tipo selvagem TR1, que, em seguida, induzida a expresso um TR1 Sec-deficiente e descobriram que esta proteína alterada nem o estado redox Trx nem a cinética de crescimento celular. Apenas em células sob estresse oxidativo de tratamento com diamida nós encontramos diferenças em células TR1-comprimised. Isso nos levou a examinar os efeitos de TR1 knockdown em uma variedade de factores de stress oxidativo, incluindo espécies reativas de oxigênio, um lipídio eletrofílica e uma -prodrug óxido nítrico (NO). Os efeitos do esgotamento TR1 foram mais pronunciados em combinação com o último tratamento.

o NO tem um largo espectro de efeitos fisiológicos, incluindo efeitos pronunciados na sistemas vascular e nervoso [18], [19]. Também é promissora como um agente antineoplásico farmacológica devido à sua citotoxicidade; No entanto, a resposta clínica ideal requer novos mecanismos de entrega do NO para o tumor, em vez de administração sistémica, para evitar os efeitos adversos vascular [20].

O

2- (2,4-dinitrofenil) 1 – [(4-etoxicarbonil) piperazin-1-il] diazen-1-io-1,2-diolate (JS-K) é um pró-fármaco, concebida para libertar intracelularmente NÃO [21] efeitos generalizadas, evitando, por conseguinte, sobre a vasculatura. A libertação de NO a partir de JS-K é dependentes do metabolismo pela glutationa S-transferases (GSTs) e esta dependência pode proporcionar selectividade neoplásico adicional uma vez que as GSTs são frequentemente sobre-expressa em cancro [22]. JS-K tem demonstrado eficácia antineoplásica em ambas as linhas celulares de cancro humano, bem como sistemas de modelos animais [23].

NO pode ter efeitos diferentes em células. Funcionando como um oxidante, que pode reagir com iões metálicos, ou modificar proteínas directamente sobre os resíduos de cisteína que formam S-nitrosotióis. Esta modificação pode modular a função da proteína [24]. A gestão redox celular de nitrosilação cisteína é uma área activa de investigação, e o sistema de TR-Trx foi identificado como um regulador de este fenómeno [25]. Em particular, as proteínas apoptóticas foram identificadas como proteínas alvo modificado por nitrosilação [26]. Com efeito, a caspase efectora, caspase-3, é alvo de nitrosilação que é modulada por sistemas Trx mitocondriais [27] e citosólica. Portanto, o sistema NO e TR-Trx são componentes integrais em processos celulares de morte celular programada. No presente trabalho estendemos o estudo dessa interação para incluir os efeitos de TR1 sobre a atividade de um importante agente terapêutico do câncer candidato novo, JS-K.

Resultados

tioredoxina redutase de mamífero sem um segundo foi pensado para ter atividade mínima; No entanto, relatórios recentes sugerem que Sec deficiente tioredoxina redutase pode ter outras actividades redox. Assim, construiu-se uma linha celular indutivel onde se pode expressar um mutante C-terminal de TR1 que era resistente à siRNA knockdown. Medimos a expressão de TR1 através de Western blotting e medida a actividade de TR baseado na redução de insulina, bem como a redução do ácido lipóico (Figura 1). O siARN eficazmente derrubar o TR1 endógena por -70% e a indução da tetraciclina estavelmente integrado do mutante C-terminal foi de -75% do nível endógeno do TR1 (Figura 1A). Além disso, o knockdown resultou em ~ 70% de redução da actividade de TR, tal como medido pelo ensaio bioquímico de oxidação do NADPH com a TRX como o intermediário e insulina que serve no aceitador final de electrões (Figura 1B). Desde TR1 pode reduzir substratos alternativos para Trx

In vitro

, nós também avaliada a capacidade do mutante C-terminal de TR1 para reduzir o ácido lipóico em um ensaio com base celular (Figura 1C). Várias enzimas celulares pode reduzir lipoato mas fez observar uma diminuição ~ 40% de redução de lipoato em células RKO com TR1 endógena atenuados pelo siRNA e nas células que expressam o mutante C-terminal TR1.

As células foram expostas para ARNsi dirigido contra TR1 para um total de 96 horas, e um mutante de terminal-C-Sec deficiente TR1 foi induzida durante as últimas 24 horas. A) Análise de imunotransferência da expressão da proteína TR1 seguintes tratamentos siRNA e indução da TR1 mutante Sec-deficiente. B) actividade bioquímica TR medido nos lisados ​​celulares através da monitorização de oxidação de NADPH num ensaio que é dependente da Trx e usa a insulina é o aceitador electrónico final. A primeira barra do lado esquerdo representam a actividade do controlo (SI-precipitação) sem Trx adicionado à mistura de reacção, indicando o sinal de fundo. C) A atividade TR baseado em células como medida pela redução do ácido lipóico num ensaio colorimétrico utilizando o reagente de Ellman. A primeira barra do lado esquerdo representam a actividade do controlo (SI-precipitação) sem ácido lipóico adicionado à mistura de reacção. Os lisados ​​de células com TR1 derrubado mostram reduções significativas na atividade em comparação com o controle (si-Scramble) em ambos os ensaios (***, p 0,001).

Desde Trx é um substrato primário de TR1 e desde outra Sec-deficiente TR1 demonstraram estresse oxidativo, medimos o estado redox Trx para determinar se o mutante C-terminal de Sec-deficiente TR1 alterou o estado redox de Trx. A avaliação do estado redox Trx foi realizada através de alquilação com o ácido iodoacético, redução de Cys oxidado com DTT, e, em seguida, alquilação a iodoacetamida, tal como foi descrito [28]. Não há alterações no estado redox Trx foram observadas entre as células com endógena TR1, as células com TR1 knocked-down, e células com endógena TR1 knocked-down além de indução do mutante Sec deficiente C-terminal TR1 (exemplo de conjunto de dados na Figura 2 e resumo de várias experiências na Tabela 1). Se as células foram desafiadas com diamida 1 mM, não foram observadas alterações no estado redox de Trx, e a diferença entre as células tratadas Si-TR1 e o Si-precipitação foi evidente o que sugere que o ensaio detecta alterações no estado redox na sequência de um desafio oxidativo .

em células sem estimulação (deixou três faixas), a TRX é principalmente no estado reduzido, mesmo com TR1 knocked-down e o mutante C-terminal TR1 expressa. Com a estimulação diamide 1 mM durante 30 min (direita três pistas), as células com TR1 endógena demonstrar mais reduzida Trx do que as células com endógena TR1 knocked-down com siRNA.

Desde Sec deficiente TR1 demonstrou citotoxicidade melhorada em outros sistemas e assim uma possibilidade foi que as células com o indutível Sec-deficiente TR1 não estão a proliferar a uma taxa semelhante como com células TR1 endógena. Medimos a taxa de crescimento celular após siRNA knockdown e a indução da expressão do Sec deficiente TR1 através da contagem do número da população de células (Figura 3). O tempo de duplicação celular para todas as três condições foi ~24 horas, após um período de latência inicial. Portanto, este mutante Sec deficiente TR1 não pareceu alterar a cinética do crescimento das células RKO como não há diferenças significativas nas inclinações das curvas de crescimento foram medidos (0,35 ± 0,004 células /h para si-Scramble, 0,36 ± 0,006 células /h para SI-TR1, e 0,33 ± 0,008 células /hr para SI-TR1 além da indução do mutante C-terminal TR1).

um mexidos siARN foi utilizado como um controlo para medir a taxa de crescimento basal (preenchido quadrada) TR1 foi knocked-down por siRNA (círculo cheio) e com a indução da Sec-mutante deficiente, C-terminal TR1 (triângulo preenchido). Não foram observadas diferenças significativas nas taxas de crescimento como as linhas de sólidos utilizados para calcular as taxas de crescimento para essas condições são quase paralelos.

Uma vez que a expressão induzida da construção TR1 mutante C-terminal Sec deficiente fez não provocar uma alteração no estado redox de Trx, avaliou-se a resposta citotóxica de células RKO com TR1 endógena, bem como células, onde o TR1 foi atenuada com ARNsi de oxigénio reactivo e de azoto sob a forma de H

2O

2 , o lípido oxidado 4-HNE, ou o doador de nO JS-K (Figura 4). Viabilidade seguinte H

2O

2 exposição não foi diferente (Figura 4A); a exposição 4-HNE demonstraram uma modesta, ~ 2 vezes maior sensibilidade nas células com TR1 knocked-down com um LC

50 diferença de 10,6 ± 0,7 mM nas células com TR1 derrubado em comparação com 24 ± 3,4 M em as células com TR1 endógena (Figura 4B); o doador de NO, JS-K, demonstrou ~ 6 vezes maior sensibilidade nas células com TR1 atenuadas por siRNA com um LC

50 diferença de 3,1 ± 0,5 mM nas células com TR1 derrubado em comparação com 19 ± 2 M em as células com TR1 endógeno, tal como medido com um ensaio de MTT (Figura 4C).

células com endógena TR1 (Si-precipitação, quadrado a cheio), e com células TR1 batido para baixo por siARN (Si-TR1, círculo a cheio) foram comparados em doses equivalentes dos moduladores redox. A) As células RKO foram tratadas com concentrações crescentes de H

2O

2 e a viabilidade foi medida após uma exposição de 24 horas. Não foram observadas diferenças significativas. B) As células RKO foram tratadas com concentrações crescentes de 4-HNE e a viabilidade foi medida após uma exposição de 24 horas. As células Si-TR1 exibida ~ 2 vezes aumento da sensibilidade à HNE-4. células C) RKO foram tratadas com concentrações crescentes de JS-K e a viabilidade foi medida após uma exposição de 24 horas. As células Si-TR1 exibida ~ 6 vezes maior sensibilidade para JS-K.

Uma vez que o dador de NO promoveu uma diferença mais proeminente na viabilidade entre as células RKO com TR1 endógeno em comparação com as células com TR1 batido para baixo, a avaliação adicional do estado redox celular foram realizados para avaliar o mecanismo da citotoxicidade melhorada mediado pelo nO. Em primeiro lugar, com base nas diferenças significativas na viabilidade celular observada no ensaio de MTT, o estado redox Trx foi avaliada após 5 uM JS-K incubação. A JS-K tratada knockdown células TR1 exibida uma distribuição mais oxidada de estados redox Trx seguinte 90 min de incubação com o pró-fármaco NÃO (Tabela 2). Em seguida, uma avaliação mais generalizada do estado oxidativo das células foi avaliada após 5 uM tratamento JS-K durante 24 horas medindo a razão de GSH reduzidos para o total dos níveis de GSH. Não houve diferenças significativas na reduzida GSH ao total de GSH foram observados (Figura 5). Estes dados sugerem que uma alteração global no estado redox não foi observada, mas que seleccionam as proteínas pode ser alvejado.

GSH medições foram feitas após o tratamento com 5 um JS-K durante 24 hrs., E a razão entre a reduzida GSH para a GSH total foi medido. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos de tratamento.

Para determinar o mecanismo por trás das alterações na viabilidade celular, tal como determinado pelo ensaio de MTT, análise de imunotransf erência de caspase 3 e a proteína de reparação do ADN poli ADP ribose polimerase (PARP) foram avaliadas (Figura 6). Caspase 3 clivada é consistente com a iniciação de apoptose e a quantidade de clivagem de caspase 3 pareceu ser mais extenso quando TR1 foi knocked-down. PARP clivada também foi observado nestas experiências em uma maneira dependente da dose.

células RKO tratados com veículo, 1.5, ou 5 um JS-K durante 24 horas. A proteína foi separada por SDS-PAGE e detectadas com análise de imunotransf erência. Um aumento dependente da dose na PARP clivada e caspase 3 (CASP3) foi observada com material mais clivado no knockdown TR1. GAPDH foi avaliada como um controle de carga

foi observada evidência de iniciação de apoptose em ambos os 1,5 e 5? M JS-K na análise immunoblot.; por conseguinte, a viabilidade celular e citotoxicidade, onde a re-avaliados por 1,5 uM de incubação JS-K (em que as células continuam a aparecer 75% viáveis, figura 4) com base na actividade da protease, utilizando o ensaio MultiTox. A ensaios parecia ser mais sensível do que o ensaio de MTT, uma vez que, mesmo nesta dose baixa, JS-K resultou em citotoxicidade e /ou perda de viabilidade nas células TR1 knockdown (-45% viável) em comparação com as células com níveis endógenos significativa de TR1 (~68% viáveis, a Figura 7A e 7B). Em seguida, a actividade relativa da caspase-3/7 foi medida e consistente com os dados de citotoxicidade, houve um aumento significativo da actividade da caspase em células com TR1 bateu-para baixo (Figura 7C). Em experiências separadas, o inibidor de caspase competitiva amplo espectro, Z-Asp-CH

2-DCB, foi incluído durante a incubação com JS-K confirmando a actividade enzimática previamente observada era dependente da actividade da caspase.

células RKO tratada com 1,5 um JS-K durante 24 horas. foram avaliados para uma viabilidade), B) citotoxicidade e actividade da caspase-3/7 C). Em experiências separadas, as células foram incubadas com Z-Asp-CH

2-DCB, um amplo espectro, inibidor de caspase competitiva, para determinar que o ensaio da caspase foi efectivamente demonstrando actividade efectora da caspase (C). células RKO com TR1 bateu-se demonstrar significativamente maiores perdas na viabilidade, aumento da citotoxicidade e um aumento-3 caspase /7 actividade a seguir ao tratamento JS-K do que as células RKO com TR1 endógena (**, P 0,01; ***, p 0,001; †††, p . 0.001)

Discussão

Embora os níveis selenoproteína são geralmente dependentes de selênio e deficiência de selênio parece resultar em aumento do risco de mortalidade por câncer [29] , o sistema TR1 TRX pode ser incomum entre selenoenzimas na sua capacidade de promover o cancro [8], [30]. Com efeito, a TRX é frequentemente sobre-expressa em muitos tumores, pode ter propriedades anti-apoptóticos, e pode contribuir para algumas formas de resistência à terapia de [7], [31] – [34]. Deste ponto de vista, a inibição da TR1 é um excelente alvo para inibir a redução da tioredoxina, na presença de estresse oxidativo adicional. Além disso, vários agentes terapêuticos comumente utilizados, tal como a cisplatina, a ciclofosfamida, a doxorrubicina e parecem ter como alvo tioredoxina redutase, bem como de ADN [35] – [39]. Nossos resultados sugerem que a atenuação da TR1 é insuficiente para alterar o estado de crescimento de células, mas que o estresse redox adequado na sequência de atenuação da TR1 pode ser o meio mais eficaz de alcançar uma resposta citotóxica.

A atividade anti-apoptótica de Trx tem sido instaladas como fundamento lógico para identificar o sistema TR-Trx no cancro humano [40], [41]. A observação recente de que o sistema de TR-Trx modula a actividade da caspase-3 de um modo dependente-nitrosilação [27] sugere um papel importante para o sistema TR-Trx na actividade apoptótica mediado pelo NO. Neste trabalho, observamos também que o NO pró-droga, JS-K, aumenta a apoptose quando TR1 é derrubado com siRNA (Figuras 4 e 6). Este mecanismo é consistente com o aumento da actividade da caspase anterior mecanicista demonstrando dados em células de leucemia mielóide aguda [42]. Além disso, nenhum doador de aspirina demonstrou actividade sinérgica quando combinado com compostos contendo ouro que estão pensados ​​para alvo principalmente o sistema TR-Trx [43].

O papel de TR1 na apoptose tem sido objecto de investigação desde que foi identificado como um gene “desagradável” (ou seja, genes associados com a mortalidade induzida por IFN-retinóide, desagradável 12) em uma tela de genes relacionados com apoptose induzida por IFN-retinóide [17]. Mais recentemente, foi demonstrado que a proteína sem um resíduo TR1 Sec funcional devido a alquilação ou truncagem, quando introduzido nas células utilizando

BioPORTER

, a apoptose induzida por [16], [44]. No entanto, os mecanismos de apoptose mediada por TR-TR1 SecTRAPs permanecem desconhecidos. O mutante que TR1 utilizado, com o C-terminal Gly-Ser-Ser-Gly, não era uma tioredoxina redutase funcional como medido por redução de oxidação /NADPH de insulina, bem como a redução do ácido lipóico (Figura 1); No entanto, isso também não pareceu funcionar como um iniciador de apoptose, tal como descrito por SecTRAP Arner e colegas [16]. Semelhante a um relatório anterior [45], não fomos capazes de identificar alterações basais em Trx ou o estado redox celular, quando TR1 foi knocked-down com siRNA (Figura 2, Tabela 1), mas fez observar alteração do estado redox Trx após o tratamento JS-K ( Mesa 2). Além disso, a expressão deste mutante deficiente Sec-TR1 não alterou o estado oxidativo da Trx. Portanto, parece que nem todas as proteínas TR Sec deficientes promover estresse oxidativo e apoptose.

Segmentação TR1 para a terapia do câncer pode não ser sem efeitos adversos indesejáveis ​​se não for orientada para o tumor. Por exemplo, o supressor do tumor, p53, é um regulador importante do crescimento celular e apoptose, e TR1 melhora a função da p53, provavelmente por contribuindo equivalentes redutores através Trx ao regulador redox nuclear Ref-1 [12], [13], [46 ], [47]. Vários agentes terapêuticos comumente utilizados, tal como a cisplatina, ciclofosfamida e doxorubicina parecem ter como alvo TR1, bem como de ADN [35] – [39], mas, talvez, uma causa de alguns dos efeitos adversos observados com estes agentes terapêuticos comuns, pode ser o ” fora do alvo “inibição da TR1. Outro composto redox modulador que foi avaliado em ensaios clínicos de cancro, gadolínio motexafin, foi pensado para alvejar especificamente TR1 [7]. No entanto, o gadolínio motexafin parece ser um substrato para TR1 e gera espécies reactivas de oxigénio através desta interacção, bem como sendo um inibidor da ribonucleótido-redutase [48]. Se a atividade clínica deste composto é realmente devido a suas interações com TR1, ainda não está claro quais os tumores devem ser orientadas desde que este composto tem demonstrado resultados mistos em ensaios clínicos até à data [49] – [51], mas parece para manter determinada promessa como um sensibilizador de radiação [52], [53].

Mesmo com potenciais complicações da segmentação TR1 em cancros, os resultados aqui sugerem que a combinação de drogas abordagens, como o nO-doador, JS-K, pode ser mais eficaz se for combinado com agentes que têm como alvo TR1.

Materiais e Métodos

Materiais

Avançado DMEM, Glutamax, 5,5 ‘, 6,6’-tetracloro-1, 1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolyl iodeto carbocianina (JC-1, MitoProbe JC-1 Kit de Ensaio), 3- (4,5-dimethylthiaxol-2-il) -2,5-diphenyltretraxolium (MTT), da Hank solução salina equilibrada com Ca e Mg (HBSS), Tris-glicina 8% de gel e albumina de soro bovino foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). soro fetal de bovino foi comprado à Hyclone (Logan, UT). A linha de células RKO foi adquirido a partir de American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA). Os anticorpos monoclonais dirigidos contra a tioredoxina redutase (B-2, SC-28321, lote # J1304); Os anticorpos policlonais dirigidos contra a tioredoxina (FL-105, SC-20146, lote # A1907), e GAPDH (FL-335, SC-25778); anticorpos anti-ratinho e anti-coelho de burro policlonais conjugado com peroxidase de rábano foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos policlonais adicionais dirigidos contra a caspase 3 (9661), clivado da caspase 3 (9662), e PARP (9532) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Bovino padrão albumina de soro e de Coomassie Além disso Proteína Reagente eram da Pierce Biotechnology (Rockford, IL). comprimidos de cocktail inibidor de protease (Complete) foram adquiridas a partir de Roche (Indianapolis, IN). membrana de PVDF foi adquirido a partir da Millipore (Burlington, MA). O inibidor de caspase, Z-Asp-CH

2-DCB, foi a partir de Peptides International (Louisville, KY). reagentes de quimiluminescência de iluminação ocidentais eram da PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). JS-K foi sintetizado como anteriormente descrito [54]. Dimetilsulfóxido (DMSO) e tampões e sais comuns foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

cultura celular

células de cancro do cólon RKO foram utilizados como uma linha de células do cólon e representativa foram mantidas em DMEM suplementado com avançada 1% Glutamax e soro fetal de bovino a 2%. Anteriormente, descrevemos a mutagénese dirigida ao local do terminal C da TR1 entre Gly-Cys-sec-Gly por Gli-Ser-Ser-Gly além de uma mutação silenciosa no local de identidade siRNA para tornar este resistentes a siARN construção dirigida para o TR1 endógena. Nós subclonado neste TR1 mutado construir em pcDNA5 /FRT /TO e então inserido nas células RKO com pcADN6 integrado estavelmente /TR e pFRT /

lac

Zeo, render uma linha de células TR1 tetraciclina induzivel mutante. Estas mutações para TR1, bem como o siRNA utilizados para modular endógena TR1 foram previamente descrito [13]. Experimentalmente, as células foram plaqueadas a 2-3 x 10

5 células /poço em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com siARN dirigido a TR1 (Si-TR1) ou de controlo gerado pela cifragem a sequência SI-TR1 (Si-precipitação) durante 72 horas. Em seguida, as células foram tratadas ou estimuladas com tetraciclina durante 24 h tal como indicado.

A análise de imunotransferência

As células em placas de 6 poços foram colocados em gelo. O meio foi aspirado e as células foram então lavadas com 1 ml de PBS frio 1 × e o PBS é aspirado. Os lisados ​​celulares foram recolhidos como anteriormente descrito [13]. As concentrações de proteína foram determinadas usando Coomassie Além disso Protein Reagent (Pierce). A absorvância a 595 nm foi medida utilizando um Perkin-Elmer Victor

leitor de placas de 3V. Dez a 15 ug de proteína foram separados em qualquer géis de 8% de Tris-glicina (para TR1) ou geles de 10% de ureia nativa (para Trx), transferidos para uma membrana de PVDF, bloquearam-se com leite em pó a 10% não-gordo, incubadas com o anticorpo primário (1:200 para TR, 1:250 de Trx, 1:1000 tanto para a caspase 3 e caspase 3 clivada, PARP para 1:1000, e 1:500 para GAPDH) durante a noite a 4 ° C, lavadas 3 ×, incubadas com anticorpo secundário (1:5000) durante 45 min a 22 ° C, lavadas 3 ×, incubadas com reagentes de quimioluminescência, e exposta a filme de raios-x.

ensaios de actividade tioredoxina redutase

Cellular TrxR1 a actividade foi medida como foi anteriormente descrito [13]. Além disso, foi medida a redução de ácido lipóico semelhante a um ensaio anteriormente descrito [55]. Resumidamente, as células foram plaqueadas e tratadas tal como descrito. Em seguida, as células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e ressuspensas numa solução de 1 ml contendo glucose a 5 mM em PBS, com ou sem ácido lipóico 1 mM e 0,2 mM de DTNB com agitando suavemente a 37 ° C durante 15 min. As células foram centrifugadas e a amostra de sobrenadante foi diluído 1:01 com água e a absorvância foi medida a 412 nm. O controlo negativo foi meio sem células. O sedimento de células foi lavado com PBS, as células foram lisadas em tampão de lise e a proteína medido usando o ensaio de Bradford. O lipoate reduzida foi normalizada pelo teor de proteína celular.

estado redox de Trx

O estado redox de Trx foi realizada como descrito [28]. Resumidamente, as células foram lisadas em ureia 8 M tamponado com Tris a pH 8,9 contendo 30 mM de ácido iodoacético, sonicado, e incubadas durante 15 min a 37 ° C. A proteína foi precipitada com 10 volumes de acetona arrefecida em gelo-HCl 1N (98:2, vol /vol), centrifugou-se a 11000 × g durante 5 min a 4 ° C, lavou-se com acetona fria-HCl, ressuspenso em 95 ul de ureia tamponada contendo DTT 35 mM, incubada durante 30 min a 37 ° C, 7,5 mL de 200 mM de iodoacetamida foi adicionar a cada amostra e incubou-se durante 15 min a 37 ° C. A concentração de proteína foi estimada utilizando Coomassie Além disso Reagente proteína.

MTT ensaio

A viabilidade celular foi determinada utilizando um MTT como descrito anteriormente [56], que se baseia na redução de sal de tetrazólio por NADH em células viáveis ​​( Berridge

et al.

, 2005).

A glutationa quantificação

glutationa reduzida (GSH) e GSH total de foram medidos utilizando reagentes GSH-Glo (Promega). Aproximadamente 2,5 x 10

3 células que foram pré-incubadas com siARN dirigido a TR1 foram plaqueadas em placas de 384 branco faces bem, deixou-se aderir, e depois tratou-se com 0 ou 5 um JS-K durante 24 horas. Os meios foram removidos por centrifugação, o GSH foi reduzida directamente medido de acordo com as instruções de fabrico, e o GSH totais foi medida por incubação das células com 1 mM de TCEP para reduzir GSH oxidada. Este ensaio é um ensaio dependente de transferase de glutationa-S que utiliza GSH para gerar luciferina como um substrato para a luciferase para gerar luz. Luminescência foi medida usando um Perkin-Elmer Victor

leitor de placas de 3V.

MultiTox ensaio

medições de viabilidade e de citotoxicidade foram avaliadas por atividades de protease diferenciais usando o MultiTox-Fluor Multiplex Assay (Promega) . Este ensaio utiliza um substrato GF-AFC que é permeável celular para avaliar as células viáveis, e um substrato de bis-AAF-R110 que não é permeável a célula para avaliar a actividade de protease de células mortas. A fluorescência a partir destes substratos foram medidos usando um Perkin-Elmer Victor

leitor de placas 3V; a viabilidade substrato GF-AFC foi medida a 405 nm de excitação, 475 nm de emissão; e o substrato citotoxicidade bis-AAF-R110 foi medida a 485 nm de excitação, 535 nm de emissão.

a actividade da caspase ensaio

a actividade da caspase efectora foi medida usando a caspase-GLO 3/7 Ensaio ( Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Este é um ensaio em que um substrato DEVD péptido é clivado por caspases activas para libertar aminoluciferin como um substrato para a luciferase para produzir luz. Luminescência foi medida usando um Perkin-Elmer Victor

leitor de placas de 3V.

A análise estatística

1-way ANOVA foi utilizada para determinar a significância estatística entre as amostras (GraphPad InStat versão 3.06). teste de comparações múltiplas de Bonferroni post-hoc foi utilizada para estabelecer significância entre os grupos de tratamento com p 0,05 considerado significativo

.