Abstract

A obesidade, e em particular a obesidade visceral, tem sido associada com um risco aumentado de cânceres em desenvolvimento, bem como taxas mais elevadas da mortalidade após o diagnóstico. O impacto da obesidade em células estromais derivadas de tecido adiposo (ASC), que contribuem para a formação de estroma tumoral, é desconhecido. Aqui temos a hipótese de que a fonte visceral e a obesidade induzida por dieta (DIO) muda o fenótipo ASC, contribuindo para o tumor promover efeitos da obesidade. Descobrimos que ASC isolado de subcutânea (SC-ASC) e visceral (V-ASC) do tecido adiposo branco (WAT) de ratos magros (Le) e obesos (Ob) apresentaram semelhante de células mesenquimais marcadores de superfície expressão, e teve efeitos comparáveis ​​sobre ovário proliferação de células cancerosas e a migração. ASC derivado obesos e visceral proliferaram mais lentamente e exibiu diferenciação prejudicada em adipócitos e osteócitos

in vitro

em comparação com ASC derivado de WAT subcutânea de ratos magros. co-injecção intraperitoneal de células de cancro do ovário com ASC derivado obesos ou visceral, mas não magra SC-ASC, maior crescimento dos tumores intraperitoneais ID8, em comparação com os controlos. Obeso e V-ASC aumento da infiltração de células inflamatórias do estroma, incluindo células T CD3 + e F4 /80 + macrófagos. ASC obeso e visceral derivada, mas não magra SC-ASC, o aumento da expressão de factores quimiotácticos de IL-6, MIP-2 e MCP-1 quando cultivados com células tumorais. No geral, estes resultados demonstram que obesos e V-ASC têm um fenótipo único, com proliferação mais limitada e a capacidade de diferenciação, mas a expressão aumentada dos factores quimiotácticos, em resposta a células malignas que suportam a infiltração de células inflamatórias e o crescimento de tumores e disseminação de suporte.

Citation: Zhang Y, Nowicka A, Solley TN, Wei C, Parikh A, Tribunal L, et al. (2015) células estromais derivadas de tecido adiposo visceral e obesidade promover o crescimento dos cancros do ovário. PLoS ONE 10 (8): e0136361. doi: 10.1371 /journal.pone.0136361

editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, United States |

Recebido: 19 de maio de 2015; Aceito: 31 de julho de 2015; Publicação: 28 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Fundo de investigação do cancro do ovário (LT /MDACC /01.2011) e da American Cancer Society (RSG-14-159-01 ) de AHK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a obesidade aumenta o risco e /ou mortalidade de muitos cânceres, incluindo endométrio, cólon, pâncreas, e cancro do ovário [1-5]. O excesso de tecido adiposo visceral branco (WAT) tem sido demonstrado ser tóxico particularidade, aumentando o risco de mortalidade e independente do índice de massa corporal (IMC) em muitos cancros, incluindo cancro do ovário [5]. Uma série de mecanismos foram identificados para explicar a relação entre obesidade e câncer, tais como secreção de adipocinas, resistência à insulina e aromatização de hormonas esteróides para aumentar circulantes de estrogênio [6-8]. O tecido adiposo também contém uma população de células de tumor-trópico adiposos estaminais (ASC) que suportam a formação de vasculatura tumoral [9] [10]. Recentemente, relatou que ASC derivados do omento humano promover o crescimento ea vascularização de xenoenxertos de cancro do endométrio, em comparação com ASC derivados por via subcutânea [11]. No entanto, as diferenças na abordagem de isolamento ou de variabilidade individual pode ter impactado o fenótipo ASC. Além disso, estudos em modelos de xenoenxerto não recapitular os efeitos de células inflamatórias no microambiente do tumor, os quais são mais bem modelado num modelo singeneico. Omento, parte da gordura visceral, é o local mais freqüentemente envolvido de metástase do câncer de ovário. metástase Omental é uma questão particularmente crítica no cancro do ovário, que tem a maior taxa de recorrência e sobrevida menor entre os cânceres ginecológicos. O mecanismo subjacente a esta não é bem conhecido. Além disso, modelos sing�icos de disseminação intraperitoneal estão bem estabelecidos no câncer de ovário, mas não câncer endometrial. Portanto, para compreender o papel da ASC de diferentes locais anatomicamente: tecido adiposo subcutâneo e visceral, em cancro do ovário, foi investigada a efeito de obesidade induzida por dieta (DIO) sobre estas diferentes ASC e o seu papel no crescimento do tumor na zona abdominal pela usando um modelo murino intra-abdominal singeneicos de cancro do ovário.

In vitro

e

in vivo

ensaios foram utilizados para analisar ASC isolado de subcutânea (SC-ASC) e WAT visceral (V-ASC) de ratos magros (Le) e obesidade (OB) para caracterizar os efeitos da obesidade e do depósito adiposo e fenótipo ASC.

Materiais e Métodos

cultura celular

ASC foram cultivadas em meio essencial α-mínimo (α-MEM) contendo 20% de FBS, L-glutamina, penicilina e estreptomicina. células ID8 e IG10 foram generosamente fornecidos por Katherine Roby [12]. células ID8 e IG10 foram estavelmente transfectadas com genes de luciferase e vermelho-tomate vaga-lume com o uso de um método lentiviral [13] (pFULT vector foi gentilmente cedido pelo Dr.Jennifer Prescher). As células cultivadas que foram rotineiramente testadas quanto à viabilidade com exclusão de azul de tripano e mantida alta viabilidade ( 95%). Para

in vivo

experimentos, a fração de minuto de células mortas foi predominantemente removido por lavagem antes de tripsinização.

Isolamento de SC-ASC e V-ASC

ASC foram isolados a partir WAT subcutâneo e visceral WAT de camundongos C57BL /6 fêmeas alimentados com dieta de baixa gordura (LFD) ou dieta rica em gordura (DFH), durante 15 semanas. HFD e LFD foram adquiridos a Research Diet INC. WAT subcutânea foi feita a partir do tronco posterior e WAT visceral foi feita a partir de depósitos retroperitoneais e das gónadas. WAT foi sujeito a ruptura mecânica, seguido de 0,5 mg /mL de colagenase tipo I (Worthington Biochemical) e 50 U /ml de dispase (Becton Dickinson) a digestão de acordo com protocolos publicados [11]. WAT digerido foi centrifugado a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante contendo adipócitos foi removido. O sedimento celular resultante foi ressuspenso em α-MEM contendo FBS a 20% e filtrada através de 100 um filtro celular (Becton Dickinson) e, em seguida, através de coadores de células de 40 mícrons.

Caracterização de SC-ASC e ASC-V

Todos os ASC foram expandidas

in vitro Comprar e aqueles início subculturas foram utilizados para caracterizar com o uso de citometria de fluxo para a expressão dos seguintes marcadores de superfície celular: CD34, CD31, CD45, CD29, CD11b, CD73 , CD90, CD105 e (Becton Dickinson). estudos de diferenciação celular foram realizadas como descrito anteriormente [14]. Para a diferenciação de adipócitos, células confluentes em 6 poços ou 24 poços da placa foram cultivadas em meio de indução adipogênica, meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Mediatech) suplementado com 10% FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, 10 ug /ml de insulina, 500 uM de 3-isobutil-1-metilxantina (Sigma-Aldrich), 1 uM de dexametasona (Sigma-Aldrich), e 200 ^ M indometacina (Sigma-Aldrich). Depois as células foram mantidas em meio de indução durante 72 horas, o meio foi mudado para meio de manutenção adipogênica, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, e 10 ug /mL de insulina durante 24 horas. Este processo de 72 horas de indução e de manutenção de 24 horas foi repetido duas vezes. Depois as células de indução de terceiros foram colocados em meio de manutenção para um total de 10 dias de incubação. meio de manutenção foi mudado duas vezes por semana. As células foram em seguida fixadas em formalina 10% durante 10 min seguido por 60% de isopropanol. Oil Red O (Sigma-Aldrich) a coloração foi aplicado a visualizar vacúolos lipídicos vermelhos. Para a diferenciação de osteoblastos, as células confluentes em placas de 6 poços foram cultivadas em NH OsteoDiff Médio (Miltenyi) durante 3 semanas, com o meio mudado duas vezes por semana. Após 3 semanas, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e fixadas com metanol a 100% pré-arrefecido. As células foram coradas com alizarina Red S. cinco imagens representativas de cada poço (três poços para cada ASC) foram tomadas por Leica DMI6000B microscópio e analisados ​​pelo Informe de software: regiões de alizarina vermelha ou Oil Red O coradas foram definidos em 4-6 imagens, e o software de reconhecimento foi aplicado para todas as imagens. A coloração em pixels foi quantificada para cada imagem, e a percentagem de coloração foi calculada e média de todas as imagens para uma percentagem final.

qPCR ensaio

mRNA do Ob /Le derivado SC- ASC ou V-ASC em dias diferentes durante a indução da adipogénese foi isolado utilizando TRIzol e convertido em ADNc utilizando SuperScript III Transcriptase reversa (Invitrogen). análise de RT-PCR quantitativo foi realizado com base em iniciadores TaqMan /Universal PCR Master Mix plataforma (Invitrogen) usando o ABI 7900 e software da estação de trabalho de SDS 2.4 (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EUA) e 2 ^ -delta Ct valor foi utilizado para a análise [15]

ensaio de proliferação

e ID8 IG10 células foram plaqueadas a uma densidade de 500 células por cavidade em um BD Falcon placa de 96 poços sozinho ou marcado com luciferase em 1: 1. co-cultura com ASC cedo passadas. Após 24 horas, a expressão da luciferase foi medida em 0,15 mg /ml de D-luciferina. Após 1 hora de incubação a 37 ° C, a luminescência foi medida com um espectrofotómetro (Fluostar Omega, o BMG Labtech). O meio foi então substituído, e as medições foram repetidas a cada dois dias até que as células confluência alcançado.

ensaio de migração

meio condicionado (CM) a partir do início passadas subcutânea ou ASC visceral de WAT obeso ou magro foi recolhido a partir de uma placa de 6 poços, que foi revestida com 300.000 células por cavidade com meio isento de soro durante 48 horas. ID8 IG10 e migração foi analisada em CM ASC em um transwell de 24 poços (Corning Inc.) com poros de 8 ^ m. CM foi colocada na porção inferior do Transwell e ID8 na porção superior do Transwell. Cada CM foi ensaiada em triplicado. O número de células que tinham migrado para a parte inferior do Transwell foi medida após 8 horas por coloração membranas com um Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific) e, em seguida, remover mecanicamente as células residuais sobre a membrana superior. As células presas na parte inferior da membrana foram dissociadas a partir da membrana usando 2% deoxycholicacid. A densidade óptica da suspensão resultante foi detectada por um leitor de placas de ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) (BioTek Instruments) a 590 nm numa placa de 96 poços [16].

ensaio de formação de esferóides

Um total de 40.000 passadas precoce ASC ou células de cancro do ovário foram plaqueadas em 2 mL de meio de ensaio esferóide (MEM com 0,1 mg /ml de gentamicina, 1% de penicilina /estreptomicina, 10 mL de B27, 10 ug de FGF, e 10 ug de EGF da Gibco) em placas de baixas de ligação para os 5 dias e recolhido como ar-spheriod médio (esferóide-CM). culturas esferóides foram iniciada por sementeira 100 cancerosas ou ASC células em 100 uL de meio constituído por 50% de células de cancro ASC ou esferóide-CM e meio de ensaio esferóide regular de 50% em placas de 96 poços. Catorze dias mais tarde, 7,5 mL de MTT (brometo de Methylthiazolyldiphenyl-tetrazólio) foi adicionado a cada poço. As esferas foram contadas manualmente com diâmetro de pelo menos 50um para excluir as células individuais ou detritos. Cada amostra foi repetido em 8 poços.

ensaios Luminex

O CM esferóide acima descrito foi analisado para a angiogénese /ou crescimento de citocina /quimiocina factor de painel incluindo IL-6, SDF-1, MCP- 1, TNF-a, IL-10, MIP-1a, 1b, MIP-2, e o VEGF com Luminex 100 usando um kit de MAP Milliplex (Merck Millipore Corp., Billerica, MA, EUA). Os dados foram processados ​​por um software gerenciador de Bioplex.

In vivo

estudos

As experiências com animais foram realizados de acordo com a MD Anderson Animal Care Institucional e protocolo Use Comitê-aprovado (120.914.932). Todos os ratinhos foram alojados e tratados de acordo com as normas institucionais. Rato estirpes C57BL /6 foram de Jackson Lab. Para a indução DIO [17], HFD D12492 (60 kcal% de gordura) e LFD D12450B (10 kcal% de gordura) Dietas de trabalho, foram utilizados. Todos os ratos nas nossas experiências foram de 2-4% de isoflurano para anestesiar e a profundidade da anestesia foi monitorizada pela taxa respiratória e ausência de reflexo de retirada de pata pitada. Para avaliar o efeito da obesidade sobre o cancro um total de 10

6-luciferase expressa ID8 em 200 ul de PBS foram injectados por via intraperitoneal (IP) em HFD ou LFD ratos, e os tumores foram cultivadas durante 10 semanas a obesidade para o crescimento do tumor. A fim de investigar adicionalmente a diferentes efeitos de ASC derivado visceral e subcutâneo derivado ASC sobre o cancro, ratos magros 6 semanas de idade foram anestesiados como anteriormente e injectados por via intraperitoneal com 1 x 10

6 células ID8 que expressam luciferase e 1 x 10

6 primeiras passagens da SC-ASC ou V-ASC de ratos obesos ou inclinar-se para o abdome (5 ratos por grupo). sinais de luciferase foram medidas para determinar o tamanho do tumor por IVIS Imaging System série 200 (Xenogen Corporation) duas vezes por semana, após 4 dias, e as imagens foram analisadas utilizando o software de estar de imagem (Caliper Life Sciences). Em torno do dia 50, os ratinhos foram sacrificados por overdose de inalação de isoflurano, ascite foram recolhidas, e nódulos tumorais próximos do estômago foram recuperados a partir de ratos sacrificados. A ascite foram centrifugadas, e a lise das células vermelhas do sangue (eBioscience) foi utilizado para remover as células vermelhas do sangue nos sedimentos celulares; isto foi seguido por 10 mL de a-MEM com 20% de FBS durante a neutralização. As células de ascite foram armazenadas a -80 ° C e depois foram analisadas por citometria de fluxo para a composição celular. Imunofluorescência, em secções de tecido embebidas em parafina e fixado em formalina foi realizada após a recuperação de antigénios, lavagem com 0,2% de Triton X-100, e o bloqueio em soro livre de bloco de proteína (DAKO); isto foi seguido por incubação com anticorpos primários (4 ° C, 12 horas) e anticorpos secundários (temperatura ambiente, 1 hora) em PBS contendo 0,05% de Tween-20. Os anticorpos primários utilizados foram os seguintes: Coelho anti-Ki-67 (Thermo Scientific, 1: 200), Biotinylated GSL I-isolectin B

4 para vasos tumorais de coloração (Vector, 01:50), rato anti-F4 /80 (Abcam, 1: 100), de rato anti-CD3 (Abcam, 1: 100) e de coelho anti-perilipin (Cell Signaling Technology, 1: 100). burro secundário Alexa 488-conjugado (1: 150) de IgG era de Invitrogen, Cy3-conjugado (1: 300) de IgG era de Jackson ImmunoResearch, e estreptavidina-Cy3 (1:20) era de Invitrogen. Os núcleos foram corados com Hoechst 33258 (Invitrogen).

MicroCT Digitalização em ratos SC-WAT e V-WAT

Para determinar o volume do tecido adiposo subcutâneo e visceral, que usamos MATLAB (Mathworks, Natick, MA) para criar um programa interno. scans microCT foram adquiridos utilizando (scanner) e tomada em (kVp, mA, FOV, espessura de corte). CT imagens para cada rato foram importados como uma série de imagens DICOM. A região de interesse (ROI) para a determinação de volume adiposo limitou-se ao abdómen. Por conseguinte, os limites superiores e inferiores do ROI foram definidas a partir do fundo do diafragma para a face superior das cabeças femorais. A seguir, extraiu manualmente contornos elípticos dentro da musculatura abdominal estendendo-se posteriormente ao corpo vertebral de modo que o tecido adiposo visceral foi contida dentro da elipse e tecido adiposo subcutâneo estava fora da elipse. As elipses foram desenhadas no topo, quartil superior, médio quartil inferior, e fatias de fundo do ROI. Durante este processo, foi possível determinar a localização óptima e tamanho da elipse, de modo a separar o tecido adiposo visceral e tecidos adiposo subcutâneo, tanto quanto possível. O programa então linearmente interpolado estes contornos para o restante das fatias, separando eficazmente o ROI em 2 regiões. A área delimitada pela elipse contido na cavidade abdominal, que incluiu o tecido adiposo visceral e órgãos. A área fora da elipse continha tecido adiposo subcutâneo.

Finalmente, o programa de cálculo de volume de tecido adiposo por contando automaticamente o número de voxeis que corresponde ao tecido adiposo, e multiplicando por o volume de cada voxel. adiposo subcutâneo consistiu de tecidos entre – 50 e 150 da unidade Houncefield (HU) e adiposo visceral consistiu de tecidos entre -50 e 200 HU. As faixas foram selecionados com base na análise visual da distribuição HU em tecidos adiposos.

A aquisição de imagens e análise de dados

As imagens foram adquiridas pelo Vectra Automated Multispectral Imaging System (Perkin Elmer) e analisados ​​por Inform software: regiões de interesse foram definidas em 4-6 imagens, e o software de reconhecimento foi utilizado para classificar todas as imagens. Fluorescência de interesse em pixels foi quantificada para as diferentes categorias de tumor de cada imagem, e a percentagem da fluorescência da categoria do tumor o alvo foi calculada a média e a partir de todas as imagens de um tumor para uma percentagem final. Pelo menos 10 imagens por slide foram quantificados. Três tumores foram analisados ​​a partir de cada um dos grupos experimentais ID8. A análise estatística foi realizada com o teste de Mann-Whitney, bicaudal.

A citometria de fluxo

ASC ou células de tumor ou ascite foram novamente suspensas em PBS suplementado com 2% FBS (10

6 células /100 ul /reacção de coloração). 1 ug de cada anticorpo foi adicionado à suspensão de células e incubaram-se a 4 ° C durante 30 minutos. populações de células marcadas foram então analisados ​​por Gallios citômetro de fluxo (Beckman Coulter) LSRII (BD Bioscience) com Kaluza ou software FlowJo. a aquisição da amostra foi acompanhada com o uso do controle sem mácula, de cor única com detalhes, e controlos isotípicos para determinar o apropriado tensões, compensações, e posicionamento dos portões para aquisição de dados. células de ascite foram pré-gated para excluir detritos, aglomerados de células, células polimorfonucleares contaminantes, células vermelhas do sangue, e as células mortas com base na coloração com DAPI. composições celulares foram analisados ​​com base na Texas Red (Texas canal vermelho) e os seguintes clones de IgG: APC-anti-CD34 (RAM34), PE-Cy7-anti-CD31 (MEC 13,3), APC-Cy7-CD45 (30-F11) ou Texas Red, PE-Cy7-anti-CD11b, e APC-F4 /80, e os controles isotípicos correspondentes (BD Biosciences). Isotipos e as posições dos hematopoiético caracterizada anteriormente e as populações endoteliais nas parcelas [18,19] foram usadas para definir cortes portão.

Análise estatística

Para a análise de

in vivo

dados, tamanho do tumor medido como intensidade luminescente foi transformado por logaritmos base 10 para aproximar normalidade para o modelo linear. Um modelo de efeito misto linear com medidas repetidas foi utilizada para avaliar as diferenças entre os grupos (Le-V-ASC, Le-SC-ASC, Ob-V-ASC, Ob-SC-ASC, e ID8 apenas) em vários pontos de tempo. Nosso modelo final incluiu o efeito fixo de grupo (5 grupos), e dia (a interação entre grupo e dia não foi significativa), efeito aleatório de ratos aninhados dentro do grupo, e medidas repetidas com a primeira ordem auto estrutura de covariância regressivo. Foi examinada a normalidade dos resíduos pelo plot normal quantil-quantil (parcela Q-Q) [20]. A análise do

in vitro

de dados foi realizada utilizando SAS 9.3 (Gary, NC). Os resultados in vitro foram relatados como médias +/- erro padrão da média.

valores

P foram obtidos por meio do teste de Mann-Whitney bicaudal. O teste de log-rank foi utilizado para comparar o tempo para detecção da doença, utilizando uma imagem luciferase.

Resultados

A obesidade aumenta o crescimento dos cânceres de ovário ID8

Para determinar se a obesidade tem um efeito directo sobre o crescimento do cancro do ovário murino, foi utilizado um modelo de murídeo singenésicos de cancro do ovário em ratinhos C57BL /6 que são propensos a DIO. Ratinhos C57BL /6 fêmeas foram alimentados com uma dieta rica em gordura (60% das kcal de gordura) ou uma dieta de baixo teor de gordura (20% das kcal de gordura). Após 4 meses, os ratos alimentados com uma dieta rica em gordura tinham quase duas vezes o peso corporal dos camundongos alimentados com a dieta de baixo teor de gordura (média de peso corporal, 37,6 g vs. 22,6 g) (Fig 1A). Para determinar se os ratinhos com DIO tinha aumentado WAT visceral, bem como WAT subcutânea, o volume de WAT visceral foi medida com verificações microCT. Os ratinhos DIO com continha mais do que um volume de 16,7 vezes mais elevada de gordura visceral e 6,5 vezes maior volume de gordura subcutânea que os ratos magros (Figura 1B). Os ratinhos foram, em seguida, com 1 x isografted 10

6 ID8 células cancerosas do ovário do pirilampo que expressa luciferase por via intraperitoneal. Aos 11 dias, a actividade de luciferase era significativamente maior em ratinhos com DIO do que em ratos magros (Fig 1C e 1D), o que demonstra que a obesidade induzida por dieta acelera tumores ovarianos ID8.

A, ratinhos C57BL /6 foram alimentados com uma HFD ou LFD para 4 meses. N = 10 por grupo. Os ratos que foram alimentados com uma HFD teve maior peso corporal do que os ratos que foram alimentados com uma LFD (peso corporal médio, 37,6 g vs. 22,6 g). B, tomografias de HFD ou ratos LFD (HFD: significa WAT ​​visceral: 7,2 cm

3 e significa SC WAT 6,6 cm

3; LFD: significa WAT ​​visceral: 0,4 cm

3 e significa SC WAT 1.0 cm

3) e distribuição HU de gordura visceral e subcutânea de HFD ou ratos LFD. asteriscos amarelos indicam gordura visceral, e asterisco vermelho indica gordura subcutânea. as linhas verticais indicam os vales vermelhos superior e inferior que definem o intervalo HU correspondente ao tecido adiposo. As barras de erro, SEM. ***,

P Art 0.001 (Student

t

teste). C, Representante HFD e LFD ratos com sinais de luciferase de tumores. Os ratinhos foram i.p. isografted com 1 x 10 6 células de tumor que expressam luciferase ID8

. Os tumores foram medidos por detecção de sinais de luciferase dentro lado abdominal de ratinhos. D, Diet obesidade induzida acelerada ID8 tumores ovarianos. O crescimento do tumor em ratos HFD e LFD por 11 dias.

Isolamento e caracterização de ASC de adiposo subcutâneo e visceral de ratos magros e obesos

Para determinar se os efeitos da obesidade foram mediados pela ASC , foram isoladas e caracterizadas SC-ASC e ASC-V de ratinhos livres de tumor alimentados com uma HFD ou LFD, como descrito acima. ASC foram isolados de acordo com protocolos anteriormente publicados [11]. Morfologicamente, SC-ASC e V-ASC de camundongos obesos ou magra exibiram um fenótipo mesenquimal semelhante (Fig 2A). expressão do marcador da superfície celular foi caracterizado em triplicado com citometria de fluxo após células foram passadas 3 vezes (S1 figo e S1 Tabela). Todos ASC foram negativas para CD31 endotelial marcador, monócitos marcador CD11b, e hematopoiéticas CD45 linhagem marcador. marcador mesenquimais, CD29 foi expressa em todas as linhas 4 ASC, enquanto os marcadores mesenquimais CD90 e 105 estavam presentes na maioria dos SC-ASC e Le-V-ASC, mas menos freqüente em Ob-V-ASC. Estes resultados demonstram que não houve evidência de contaminação com células não-mesenquimais linhagem de tecidos adiposos e que a SC e Le-V-ASC tinha expressão do marcador de superfície celular similar. Ob-V-ASC foram anotadas a ter menos expressão de CD90 e 105 que são característicos da MSC. Em seguida, para determinar se SC-ASC e ASC-V a partir de ratinhos obesos ou magras manter a mesma taxa de crescimento, foram realizados ensaios de proliferação celular. Magra SC-ASC (Le-SC-ASC) proliferaram mais rapidamente do que ASC de outras fontes (

P Art 0,05, S2 Fig).

A, Morfologia de células aderentes que mostra semelhança entre SC-ASC e V-ASC de ratos obesos e magros. barra de escala, 1 Hm. B, Adipogênese da SC-ASC e V-ASC. As células diferenciadas foram coradas com óleo vermelho O e-quantificada por percentagem de pixels de óleo vermelho-O em imagens. As barras de erro, SEM. **,

P Art 0,01 (teste de Mann-Whitney). barra de escala, 100μm.C, Osteogenesis da SC-ASC e V-ASC. As células diferenciadas foram coradas com barras de erro S. vermelho de alizarina, SEM. **,

P Art 0,01 (teste de Mann-Whitney). barra de escala, de 100 um. D, a análise de RT-PCR quantitativa de níveis de ARNm para os genes de punção de diferenciação de adipócitos e lypolysis normalizadas para expressão de ARN 18s na ASC indicado na linha de base e 14 dias após a indução da adipogénese. barra de erro:. SEM

In vitro

ASC diferenciação

Para determinar se SC-ASC e V-ASC de multipotency ratos exibem obeso ou magro

in vitro

, adipócitos e de linhagem osteócito ensaios de diferenciação foram realizadas como relatado anteriormente (Fig 2B e 2C) [11]. quantificação de adipócitos foi baseado em Oil Red O coloração das gotículas de gordura após a indução da adipogénese. SC-ASC formado mais gotículas lipídicas Oil Red O-positivos do que V-ASC. (Fig 2B,

P Art 0,01). Osteogenesis foi detectado com a utilização de coloração com vermelho de alizarina para detectar fosfatase alcalina, indicativa de diferenciação dos osteoblastos (Figura 2C). Osteogenesis foi também mais robusto para a SC-ASC do que para V-ASC (

P Art 0,01), com uma tendência para a obesidade prejudicando potencial de diferenciação osteogênica. Combinados, estes resultados sugerem que a SC-ASC tem multipotency maior do que V-ASC e que ASC derivados de WAT obesas têm potencial de diferenciação mais limitada do ASC derivados de WAT magra.

A fim de determinar se a fonte de tecido e obesidade impactado programação adipogênica, expressão de adipócitos (adipsina, leptina, GLUT4), a lipólise (ATGL) e chave que regula a adipogénese factor de transcrição (PPAR-γ) foram perfilado na ASC na linha de base e após 14 dias de indução dos adipócitos (Figura 2D). Descobrimos que Le-SC-ASC foram submetidos a indução de 30 vezes do gene regulador de adipogensis crítica, PPAR-γ após a indução de adipócitos, ao contrário de ASC de outras fontes. O nível de PPAR- γ ainda era alta após a diferenciação no grupo Ob-V-ASC, mas tinha poucas manchas de óleo-Red-O (Fig 2C). Isto pode ser devido ao aumento da lipólise, o que se reflecte em maiores níveis de expressão em ATGL Ob-V-ASC. genes adipócitos incluindo adipsina, leptina e GLUT4 foram expressos em níveis muito mais elevados em Le-SC-ASC, de acordo com nossa observação de que SC-ASC diferenciadas mais robusta em adipócitos. ATGL regulação gene lipólise foi maior no ASC derivado visceral obesos.

In vitro

análise da ASC e câncer de ovário co-culturas

Para determinar se ASC têm um efeito mitogênico direto em células malignas, analisamos a proliferação de linhas celulares derivadas de cancro do ovário ID8 e IG10 C57

ex vivo

. células ID8 IG10 e marcado com luciferase foram co-cultivadas com ou sem ASC. proliferação de células tumorais foi monitorizada com a utilização de imagiologia de luciferase. ASC de todas as fontes teve um efeito pró-proliferativo modesto sobre ID8 e IG10 células (S3A e S3B FIG). Para determinar se ASC afetar o potencial invasivo de células de cancro do ovário, foi realizado um

ex vivo

migração através ensaio Boyden Câmara Transwell. ASC de todas as fontes, em comparação com células ovarianas sozinho, aumentou a migração de células ovarianas (

P Art 0,01). (S3C e S3D Fig)

células de cancro do ovário malignos agregado e forma esferóide -como estruturas em fluido de ascites, que pode facilitar a metástase omental [21]. Descrevemos previamente que a medula óssea MSC derivadas melhorar a formação de esferóides de cancro da mama [22]. Quando ASC foram cultivadas como esferóides em 100 células banhado por poço sem células tumorais, Ob-V-ASC formado significativamente mais esferas que ASC de todas as outras fontes (Fig 3A). Para determinar o efeito da ASC sobre a formação de esferóides do cancro do ovário, e ID8 IG10 células foram cultivadas como esferóides com ou sem ASC esferóide-CM. células ID8 formados significativamente mais esferóides em todos ASC-esferoide-CM de células ID8 sozinho (Fig 3C,

P

0,05). células IG10 formados significativamente mais esferóides quando cultivadas com Ob-V-ASC esferóide-CM (Figura 3B e 3D). Em resumo, a obesidade e a fonte de tecido parecem afectar a formação de ASC esferóide, e suporte de IG10 esferóides de células derivadas do cancro do ovário.

As células foram plaqueadas a uma densidade de 100 células em 100 ul total, em placas de 96 poços e cultivadas durante 14 dias. As células foram então coradas com MTT, e esferóides foram contadas manualmente. Cada experiência foi realizada em triplicado. A, Quantificação de esferóide ASC em meio regular. B, Comparação de IG10 formação esferóide em vários ASC esferóide-CM. Imagens representativas mostrado na ampliação de 10x. barra de escala, de 100 um. C, Quantificação de ID8 ensaio esferóide em diferentes ASC esferóide-CM. (Mostrado são a média ± SEM, ***,

P Art 0,001, Student

t

teste, dois atados.). D, Quantificação de IG10 ensaio esferóide em vários ASC esferóide-CM. (Mostrado são a média ± SEM, *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01, ***,

P Art 0,001, Estudante

t

teste, duas caudas).

Efeito da ASC derivado WAT obesos e magros no

no crescimento vivo

de câncer de ovário

Para investigar o

in vivo

efeitos da fonte de tecido e obesidade na ASC no cancro do ovário, ASC foram co-injectados com células de tumor que expressam luciferase ID8 em fêmeas magra ratinhos C57BL /6 por via intraperitoneal (proporção 1: 1, 10

6 /cada). O crescimento do tumor foi monitorizado com imagiologia de luciferase. Níveis mais elevados de actividade de luciferase foi detectada em ratinhos injectados com Ob-SC-ASC, Le-V-ASC e Ob-V-ASV, em comparação com ratinhos injectados com células ID8 isoladamente (Quadro 1 e Figura 4A-4D). O crescimento do tumor em ratinhos injectados com Le-SC-ASC foi semelhante ao crescimento do tumor em ratinhos que receberam células de ID8 sozinho. Ob-SC-ASC promoveu o crescimento de tumores mais do que Le-SC-ASC (

P

= 0,049). Ob-SC-ASC e Ob-V-ASC teve efeitos promotores de tumor semelhantes (

P

= 0,84). Em adição, os tumores em ratinhos injectados com Le-SC-ASC foram detectadas mais tarde do que os tumores em ratinhos injectados com a ASC de outras fontes (

P

= 0,024, Fig 4C).

ASC eram co-injectado com células de tumor que expressam ID8 luciferase em ratinhos C57BL /6 por via intraperitoneal (proporção 1: 1, 10

6 /cada). N = 5 por grupo. A, Comparação de carga tumoral medido pela expressão de luciferase no lado abdominal entre os grupos Le-SC-ASC Ob-SC-ASC e. barra de erro: 90% de intervalo de confiança. B, Comparação de carga tumoral medido pela expressão de luciferase no lado abdominal entre os grupos Le-V-ASC Ob-V-ASC e. barra de erro: 90% de intervalo de confiança. C, Comparação de iniciação do tumor entre os grupos. D, medição de sinal de luciferase de lado abdominal nos ratos no dia 46.

Efeito da ASC no microambiente do tumor

Para determinar o efeito da ASC na in-vivo proliferação de células tumorais, foi quantificado o número de células Ki-67-positivas no interior dos tumores ID8 com utilização de imunofluorescência (Figuras 5A e S4). O número de pixels que representam positivos frequência de células para o Ki-67 foi maior em tumores ASC injectado, mas não foram diferentes entre os grupos obesos e magros (Figura 5A e 5B). Os tumores do grupo Ob-SC-ASC continha sinais ligeiramente mais elevados do que o grupo Ki67 Ob-V-ASC (P 0,05) (Figura 5A e 5B). Nós já anteriormente demonstrado que a ASC apoiar a formação de vasculatura em xenoenxertos endometriais [11]. Para determinar se estes efeitos sobre a vascularização do tumor ASC são modificados pela obesidade e fonte de tecido, secções de tumores foram coradas com GSL B4 I-isolectina, que se liga especificamente às células endoteliais (Fig 5A). Vascularização foi maior em todos os tumores ASC injetado em comparação com ID8 tumores sozinho com um número significativamente maior de vasos em cima do co-injeção de Ob-SC-ASC de Le-V-ASC ou Ob-V-ASC (

P

0,01, Fig 5B)

análise por imunofluorescência de tumores recolhidos no dia 49 após os ratos foram sacrificados.. 0,05;