Abstract

A formação de metástases hepáticas em pacientes com câncer colorretal é a principal causa de morte do paciente. As terapias atuais dirigidas a metástases hepáticas de câncer colorretal tiveram um impacto mínimo sobre os resultados dos pacientes. Portanto, é necessário o desenvolvimento de estratégias alternativas de tratamento para metástases hepáticas. No presente estudo, demonstramos que apolipoproteína humana recombinante (a) kringle V, também conhecido como rhLK8, induziu o volume de negócios por apoptose de células endoteliais

in vitro

através da via da apoptose mitocondrial. A interacção de rhLK8 com a proteína regulada por glucose 78 (GRP78) podem estar envolvidos na indução de apoptose, porque a inibição de GRP78 por anticorpos específicos de GRP78 ou siRNA knockdown inibiu a apoptose rhLK8-mediada de veia umbilical humana células endoteliais

em vitro

. Em seguida, para avaliar os efeitos de rhLK8 na angiogénese e metástase, um modelo experimental de metástases do fígado foi estabelecida através da injecção de uma linha celular de cancro colo-rectal humano, LS174T, em baços de ratinhos nus BALB /c. A administração sistêmica de rhLK8 suprimiu significativamente a metástase do fígado a partir de células de câncer colorretal humanos e melhora da sobrevida de acolhimento em comparação com os controles. A combinação de rhLK8 e 5-fluorouracilo aumentou substancialmente estes benefícios de sobrevivência em comparação com a terapia sozinha. observação histológica revelou indução significativa da apoptose entre as células endoteliais associadas ao tumor em metástases do fígado de ratinhos tratados com rhLK8 em comparação com ratinhos de controlo. Colectivamente, estes resultados sugerem que a combinação de quimioterapia com rhLK8 convencional pode ser uma abordagem promissora para o tratamento de doentes com metástases hepáticas de cancro colorrectal com risco de vida

citação:. Ahn JH, Yu HK, Lee HJ, Hong SW, Kim SJ, Kim JS (2014) a supressão de metástase do cancro do fígado colorrectal por apolipoproteína (a) Kringle V em um rato modelo nua através da indução de apoptose em células de tumor-Associated endoteliais. PLoS ONE 9 (4): e93794. doi: 10.1371 /journal.pone.0093794

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 10 de dezembro de 2013; Aceito: 07 de março de 2014; Publicação: 03 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ahn et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado financeiramente pela Green Cross Corporation, uma bolsa da Coreia do Saúde 21 R D Project, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia (A050905), uma subvenção do Programa de Iniciativa KRIBB Research, e por um Básico Programa de Pesquisa em ciência através da Fundação de Pesquisa Nacional da Coreia financiado pelo Ministério da Educação, ciência e Tecnologia (2012R1A1A2007994). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é o terceiro câncer mais comum ea segunda causa de morte por câncer nos Estados Unidos. Estima-se que, no ano de 2013, cerca de 142.820 novos casos de cancro colorectal foram diagnosticados e 50.830 pacientes morreram com esta doença [1]. Aproximadamente 25% dos pacientes apresentam doença metastática no momento do diagnóstico. Os restantes 75% são tratados cirurgicamente com a cura como o objetivo [2], mas mesmo com ressecção completa da doença eventualmente reaparece em 50% desses pacientes. O fígado é o principal local de metástases nos doentes com cancro colo-rectal, antes e depois da remoção cirúrgica do tumor primário, e a formação de metástases hepáticas constitui uma das principais causas de morte por doença [3]. A cirurgia é o tratamento primário para metástases isoladas, mas apenas 20-25% dos pacientes são adequados para ressecção [4], e recorrência após a cirurgia é frequente. Por isso, é urgentemente necessário o desenvolvimento de uma nova modalidade de tratamento para esta doença com risco de vida.

A angiogénese é o desenvolvimento de novos vasos capilares a partir de vasos sanguíneos pré-existentes. Uma vez que a angiogénese é necessária para o crescimento expansivo e metástases de tumores primários, o processo angiogénico é considerada como um alvo promissor para novas terapias contra o cancro [5], [6]. Numerosos inibidores de angiogénese, tais como angiostatina e endostatina, que exibem eficácias significativas contra uma variedade de tumores, incluindo o cancro colorrectal metastático em configurações pré-clínica, foram identificados [7], [8]. A aprovação do bevacizumabe (Avastin), um anticorpo monoclonal humanizado contra o fator de crescimento endotelial vascular, pelos Estados Unidos Food and Drug Administration em 2004 como uma terapia de primeira linha para câncer colorretal metastático validado ainda mais a ideia de que o bloqueio da angiogénese é uma estratégia eficaz para o tratamento do cancro colo-rectal humano.

a metástase é um processo altamente complexo que consiste numa série de passos, incluindo intravasamento de células tumorais a partir do local primário para o sangue ou a circulação linfática, a sobrevivência das células no sangue circulatório sistema, colonização de um órgão secundário, iniciação e manutenção do crescimento e o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos para o tumor metastático [9], [10]. Qualquer um destes passos de metástase pode ser um alvo terapêutico porque a falha de qualquer uma etapa de perturba toda a cascata metastática. No entanto, no momento em cânceres colorretais primários são detectados, as metástases hepáticas subclínicas ou clinicamente relevantes já ocorreram [11]. Assim, tendo como alvo as etapas posteriores de metástase, tais como o desenvolvimento de nova vasculatura, é promissor porque este processo não pode ter ocorrido no momento do diagnóstico de cancro colorrectal. Além disso, esta etapa é considerado menos eficaz do que os passos anteriores, tais como intravasamento, a sobrevivência na circulação, e colonização inicial no sítio secundário. Biologicamente processos ineficientes podem ser direcionados facilmente porque menos células terão de ser alvejado. Tendo em conta estas considerações, a terapia anti-angiogénico, que tem como alvo principalmente o crescimento dependente da angiogénese de metástases, é uma estratégia terapêutica clinicamente acessível e biologicamente relevante para a metástase do fígado.

apolipoproteína (a) [apo (a) ] é um componente glicoproteína de lipoproteína (a) humana e tem sido relatada a ser associada com o desenvolvimento de aterosclerose e doença coronária do coração [12]. A apo (a) consiste de domínios kringle repetidas que se assemelham estreitamente ansa de plasminogénio 4, seguido por sequências que são homólogas aos domínios kringle 5 e protease de plasminogénio [13]. O papel fisiológico (s) da apo (a) os domínios kringle permanecem pouco compreendidos. No entanto, em linha com o papel sugerido de kringles como inibidores gerais de crescimento dos vasos sanguíneos [14], a evidência atual sugere que full-length ou formas truncadas de apo (a) kringles inibir a angiogênese, tanto

in vitro

e

in vivo

e suprimir o crescimento tumoral em modelos animais [15], [16], [17]. Nós também têm demonstrado que a apo recombinante (a) kringle V, chamado rhLK8, inibe a migração de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)

In vitro

, em parte, pela interferência com a activação de quinases e a adesão focal subsequente formação de fibras de stress de actina /adesões focais [18]. rhLK8 também inibiu a neovascularização do pintinho membranas coriolantóicas e infiltração capilar na tampões de Matrigel

in vivo

. Recentemente, foi demonstrado que a administração sistémica de rhLK8 em combinação com um agente quimioterapêutico, paclitaxel, pode atenuar o crescimento de células de cancro da próstata humano PC-3mm2 na próstata e da tíbia de ratinhos nus [19]. Observou-se que o tratamento com rhLK8, especialmente em combinação com um agente quimioterapêutico, induz a apoptose em células endoteliais associadas ao tumor, seguindo-se a apoptose das células tumorais vizinhas. No entanto, o mecanismo bioquímico pelo qual exacta rhLK8 induz a apoptose em células endoteliais permaneceram desconhecidos.

No presente estudo, nós investigamos o mecanismo de apoptose induzida por rhLK8 nas células endoteliais associadas ao tumor e testou-se se o tratamento rhLK8, em combinação com quimioterapia, suprime a metástase hepática cancro do cólon. Descobrimos que rhLK8 induz a apoptose em células endoteliais através da via de apoptose mitocondrial

in vitro.

Sua interacção com a proteína regulada por glucose 78 (GRP78) na superfície da célula endotelial pode desempenhar um papel crucial neste processo. Também demonstramos que rhLK8, especialmente em combinação com a quimioterapia convencional, suprimiu significativamente a metástase do fígado através da indução da apoptose das células endoteliais associadas ao tumor in

in vivo

, resultando em sobrevivência melhorada hospedeiro em um modelo animal experimental de metástases do fígado.

Materiais e Métodos

expressão e purificação de rhLK8 e seus derivados

O

Saccharomyces cerevisiae

estirpe BJ3501 foi transformada com um vector de expressão para a

rhLK8

, que foi construído para expressar rhLK8 como uma proteína de fusão com uma sequência de sinal do factor α sob o controlo da levedura

Gal

um promotor e subsequentemente processada para ser secretada para o meio de cultura [20]. rhLK8 proteínas foram purificadas até à homogeneidade a partir do sobrenadante da cultura de

S. cerevisiae BJ3501

expressando rhLK8, como previamente descrito [21]. rhLK8 proteínas purificadas foram armazenadas em tampão contendo NaCl 100 mM e 150 mM de L-glicina (pH 4,2).

O fragmento de ADN que codifica a proteína rhLK8 fundido a um epítopo de hemaglutinina (HA) no terminal C (rhLK8 -HA) foi amplificado por dois ciclos de reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os seguintes iniciadores: rhLK8-frente (5′-TTT GAA TTC CAT ATG GAC CAG TGC ATG TTT GGG AAT GGG-3 ‘) e HA1-inversa (5 ‘-CAC ATC ATA AGG GTA AGA GCC CCC GCC AAA TGA AGA GGA TGC ACA GAG AGG-3′) para o primeiro ciclo utilizando o vector rhLK8-expressão como modelo e rhLK8-forward e HA2-reverse (5’-GGA TCC TCA AGA CCC AGA ATA GGC ATC TGG CAC ATC ATA AGG GTA AGA GCC CCA-3 ‘) para o segundo ciclo de PCR utilizando o produto do primeiro ciclo como molde. O fragmento rhLK8-HA de ADN amplificado foi clonado no vector de expressão procariótico pET-15b (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), o qual foi então usado para transformar

Escherichia coli

BL21 (DE3). A expressão do transgene foi induzida de acordo com as instruções do fabricante. rhLK8-HA foi expressa como uma proteína de 6 × marcada com His, e a proteína solúvel foi purificada por afinidade usando sistemas de cauda de His no PET (Merck KGaA), de acordo com as instruções do fabricante.

Análise de Apoptose por coloração com Hoechst 33452

humano de células endoteliais da veia umbilical confluentes (HUVEC; Lonza, Walkersville, MD, EUA), as culturas foram incubadas em EBM-2 (Lonza meios) suplementado com FBS a 1% e várias concentrações de rhLK8 (0,1-5 ^ M) na presença ou ausência de 3 ng /de factor de crescimento de fibroblastos básico ml (bFGF). Após um período de incubação de 12 ou 24 horas, as células foram coradas com Hoechst 33452 (500 ng /ml, Sigma, St. Louis, MO, EUA) durante 30 min a 37 ° C, e a apoptose foi avaliada por condensação da cromatina nuclear utilizando um microscópio de fluorescência (Olympus BX51, Olympus, Center Valley, PA, EUA) [22]. campos microscópicos aleatórios foram examinados para cada condição experimental e determinou-se a percentagem de células que foram submetidas a apoptose em cada campo.

Western Blotting de proteínas relacionadas com apoptose

As células foram lisadas em Triton lise tampão [137 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 10% glicerol, 1% de Triton X-100, e Tris-HCl 20 (pH 8,0)] contendo inibidores de protease. Uma alíquota de cada lisado foi separado por SDS-PAGE utilizando géis de polimerizado a partir de acrilamida a 4-20% em tampão Tris /glicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e imunotransferência foi realizada com anticorpos contra pro-caspase-3, pro-caspase-9 ( Cell Signaling, Beverly, MA, EUA), caspase-3 clivada e pro-caspase-8 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). As amostras eluídas de experiências de co-imunoprecipitação também foram sujeitos a SDS-PAGE, e as proteínas de electroforese foram transferidos para membranas de nitrocelulose. Cada membrana foi incubada com anticorpos de ratinho anti-GRP78 (BD Biosciences; 1:1,000) ou de coelho anti-His anticorpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA; 1:1,000) e em seguida com conjugado com peroxidase anti-rato ou anticorpos anti-coelho (KPL, Gaithersburg, MD, EUA; 1:5,000).

Proteínas Fracionamento de citosólico e Membrane-bound

frações citosólica e membrana foram preparados pela permeabilização da membrana plasmática seletivo com digitonina, seguido por solubilização de membranas [23]. Resumidamente, as células foram tratadas com 0,05% de digitonina em tampão isotónica A [10 mM HEPES, NaCl 150 mM, MgCl 1,5 mM

2, e 1 mM de EGTA (pH 7,4)] contendo inibidores de protease [1 mM de 4- (2- aminoetil) benzenossulfonilo cloridrato de fluoreto, 0,8 uM de aprotinina, 50 uM de bestatina, 15 uM de e-64, 20 uM de leupeptina, e 10 uM de pepstatina a] durante 2 min à temperatura ambiente. As células permeabilizadas foram recolhidos a 4 ° C. Após centrifugação a 15.000 x g durante 10 min, o sobrenadante (fracção citosólica) e o (fracção de membranas) pelete foram recolhidos separadamente. Para libertar as proteínas à membrana e organelos ligados a, o sedimento foi ainda extraída com gelo frio 1% de Nonidet P-40 em tampão A contendo inibidores de protease durante 60 min a 4 ° C. Ambas as fracções citosólicas e de membrana foram analisadas por transferência de Western utilizando anticorpos contra o citocromo C (BD Biosciences).

Construção do vector de expressão para a proteína regulada Glicose-78 (GRP78) e transientes Transfecção para Células HEK293

O

gene GRP78

foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores seguintes: para a frente (5′-TTT TTT GGA TCC ATG AAG CTC TCC CTG GTG GCC-3 ‘) e reverso (5’-TTT TTT GCG GCC GCT CTA CAA CTC ATC TTT TTC TGC-3 ‘), e, em seguida, clonado em pcDNA3.1-myc-His (vector de expressão eucariótico -) b (Invitrogen). transfecção transiente de células HEK-293 com os reagentes

GRP78

vector de expressão foi realizada utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), colhidas por raspagem, e foram centrifugadas durante 5 min a 500 x g. As células recolhidas foram lisadas utilizando um tampão IP (NaCl 150 mM, Tris-HCl a 50, pH 7,6) contendo 1% de NP-40, e os extractos celulares foram analisados ​​por transferência de Western.

Co-imunoprecipitação de rhLK8- proteínas de ligação

células HEK293 transfectadas com

GRP78

vectores de expressão foram recolhidas e extraídas com tampão de lise (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 1% de NP-40, 1 x inibidor da protease, e uma fluoreto de fenilmetilsulfonilo mM, pH 7,6). Os extractos de células foram misturados durante a noite a 4 ° C com 10 ug de anticorpo monoclonal anti-HA, 2 ug de rhLK8 marcada com HA, e de proteína G-agarose (Sigma). Os imunoadsorventes foram recuperados por centrifugação durante 5 min a 700 x g, lavou-se três vezes, e centrifugado (5 min a 700 x g) em tampão IP (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 0,1% de NP-40, pH 7,6). Os sedimentos foram ressuspensos em 30 ul de tampão de carga de SDS-PAGE (Sigma) e analisadas por transferência de Western.

Transfection siRNA

HUVEC foram tratadas com tripsina, contadas, e diluiu-se em EGM- antibiótico-livre 2 médio a 2,5 × 10

5 células /ml para transfecção com Dharma

FECT

1 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HUVEC foram plaqueadas em placas de 100 mm e incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 durante a noite. Um mililitro de 2 uM de ON-TARGETplus SmartPool siRNA (Thermo Fisher Scientific) contra

GRP78

diluído em 1 × tampão de siARN (tubo-1) e Lei

FECT

1 (tubo-2) diluída com meio isento de soro, foram colocadas em tubos separados, incubaram-se durante 5 min à temperatura ambiente, misturados em conjunto, e, em seguida, incubadas durante 20 min à temperatura ambiente. As misturas foram incubadas de siRNA e Lei

FECT

1 foram diluídas em 8 ml de meio isento de soro e subsequentemente adicionada à placa de 100 mm, com monocamadas de HUVEC. Após 24 h, o meio de transfecção foi substituído por meio completo contendo FBS e factores de crescimento. Dois dias após a transfecção, HUVECs foram divididas, e no 4º dia em que foram colhidas ou replated para outras experiências.

Análise de rhLK8 vinculação a GRP78 na HUVECs por citometria de fluxo

Para medir a ligação de rhLK8 à proteína GRP78 na superfície de células HUVEC, rhLK8 foi marcado com FITC utilizando um kit de marcação com FITC (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. HUVECs que tinham sido transduzidas com ARNsi mexidos ou ARNsi específicos de grp78 foram tratadas com tripsina e tripsina neutralizada por uma solução de neutralização (Lonza). 5 × 10

5 HUVECs foram coradas utilizando anticorpos rhLK8 ou GRP78 marcados com FITC durante 1,5 h a 4 ° C, lavadas com PBS 3 vezes, e analisadas por citometria de fluxo com um calibre de FACS (BD Biosciences).

Modelo animal para fins experimentais fígado Metástase

atímicos BALB /c ratinhos nus foram anestesiados por uma injecção intraperitoneal (ip) de cetamina /xilazina (Sigma). O baço foi então exteriorizado através de uma incisão no flanco lateral esquerdo. Aproximadamente 3 × 10

5 LS174T células de carcinoma colorectal humano (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) em 100 ul de solução salina equilibrada de Hank foram injectados no parênquima do baço utilizando uma agulha de calibre 27. O peritônio e pele foram fechados em duas camadas com grampos metálicos. A partir do dia da inoculação das células tumorais, os ratos tiveram i.p. diariamente administrações de 2, 10 e 50 mg /kg rhLK8 durante duas semanas. Além disso, o controlo e rhLK8 (2, 10 ou 50 mg /kg), tenha sido tratada com ratinhos foram utilizados em experiências de sobrevivência (n = 10 /grupo de cada).

Para investigar a eficácia terapêutica do tratamento em combinação com rhLK8 uma quimioterapia convencional, os ratinhos injectados com células LS174T foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n = 5 por grupo) e tratados como se segue: (1) ip diária administração de veículo (100 mM de NaCl, 150 mM de L-Glicina, pH 4,2); (2) por via i.p. injecção de 5-fluorouracilo (5-FU; 8 mg /kg /dia) durante os primeiros cinco dias após a injecção interna do baço; (3) i.p. diariamente injecção de rhLK8 (10 mg /kg); e (4) diariamente por via i.p. administração de rhLK8 (10 mg /kg) e por via i.p. injecção de 5-FU (8 mg /kg /dia) durante os primeiros cinco dias após a injecção interna do baço. De controlo e rhLK8 tratados com ratos também foram usadas em experiências de sobrevivência (N = 10 murganhos por grupo) ou foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação 2 semanas após o tratamento, em que os fígados de tempo foram recolhidos, pesados ​​e analisados ​​para determinar a superfície número de nódulos de tumor ou foram submetidas a análise histológica e exame imuno-histoquímico.

Ética Declaração

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de Ética animal do Instituto Mogam Biotechnology Research ou a Coreia do Instituto de Pesquisa de Biociências e Biotecnologia (KRIBB-AEC-13011) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Cuidados administrados aos animais estava em conformidade com as orientações para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health.

Histologia e imunohistoquímica

Para contar nódulos intra-hepáticas, o tumor- fígados de rolamento foram dissecadas, fixadas com formalina a 10% tamponada neutra a noite, embebidos em parafina e seccionados em fatias de 4