Abstract
Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) é um importante regulador da angiogênese. expressão de VEGF está-se regulada em resposta a estímulos micro-ambientais relacionados ao fornecimento de sangue pobre como hipóxia. No entanto, a regulação da expressão de VEGF em células de cancro não está limitado a resposta ao stress, devido ao aumento do volume da massa do tumor. mediadores lipídicos em particular prostaglandina derivados de ácido araquidônico (PG) E
2 são reguladores de expressão VEGF e angiogênese no câncer de cólon. Além disso, o aumento da osmolaridade que é gerado durante a absorção de água e fezes consolidação do cólon parece activar as células cancerosas do cólon e promover PGE
2 geração. Tal estimulação fisiológica pode fornecer sinalização para promoção de câncer. Aqui investigámos o efeito da exposição a um meio hipertónico, para emular ambiente do cólon, sobre a produção de VEGF por células do cancro do cólon. O papel da PGE
2 geração e MAPK activação concomitante foi abordada pela inibição farmacológica específica. A linha celular de cancro do cólon humano Caco-2 exposta a um ambiente hipertónica respondeu com VEGF marcado e PGE
2 de produção. produção de VEGF foi inibida por inibidores selectivos de ERK 1/2 vias e p38 MAPK. Para abordar o papel regulador da PGE
2 sobre a produção de VEGF, Caco-2 As células foram tratadas com CPLA
2 (ATK) e inibidores da COX-2 (NS-398), que bloqueiam completamente PGE
2 geração . As células Caco-2 foram também tratados com uma
antagonista não selectivo do receptor de PGE2. Cada tratamento aumentou significativamente a produção de VEGF induzida por estresse hipertônica. Além disso, a adição da PGE
2 ou EP selectiva
2 agonista do receptor de células activadas Caco-2 inibiu a produção de VEGF. O papel inibitório autócrino para PGE
2 parece ser selectivo para hipertónica ambiente uma vez que a produção de VEGF induzida por exposição a CoCl
2 foi diminuído pela inibição concomitante da PGE
2 geração. Os nossos resultados indicam que o VEGF estimula a produção de hipertonicidade em linhas celulares de cancro do cólon. Também PGE
2 desempenha um papel inibitório sobre a produção de VEGF por células Caco-2 expostos ao estresse hiperosmótica através EP
2 activação
Citation:. Gentile LB, Piva B, Diaz BL (2011) hipertônica O estresse induz a produção de VEGF na linha celular de cancro do cólon humano Caco-2: papel inibitório da Autócrino PGE
2. PLoS ONE 6 (9): e25193. doi: 10.1371 /journal.pone.0025193
Autor: Ben C. B. Ko, Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 17 de dezembro de 2010; Aceito: 30 de agosto de 2011; Publicado: September 28, 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Gentile et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasil) e Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, Brasil) (a BLD) e um Ministério da Saúde (Brasil) PhD comunhão (para LBG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasculatura preexistente é um processo central no desenvolvimento da maioria dos tumores sólidos, especialmente aqueles. Este processo é chamado de angiogénese e é regulado pelo balanço de sinais bioquímicos negativos e positivos. Os vasos sanguíneos recém formados são responsáveis pelo fornecimento de oxigénio e nutrientes para a massa de tumor em crescimento e uma via de disseminação de células cancerosas metastáticas. O VEGF é a mais proeminente regulador positivo da angiogénese devido à sua capacidade para recrutar células endoteliais para locais hipóxicas e para estimular a proliferação de este tipo celular, promovendo a diferenciação de estruturas vasculares [1]. expressão de VEGF está correlacionada positivamente com resultado negativo em pacientes com câncer. No cancro do cólon, a expressão do VEGF está correlacionada com o aumento do potencial metastático [2], enquanto que a expressão do seu receptor é um marcador de sobrevivência pós-operatório mais curto [3].
expressão do VEGF é regulada para cima em resposta à micro estímulos ambientais relacionados com o fornecimento de sangue pobre como hipóxia [4], acidose [5] e baixos níveis de nutrientes [6]. Em tumores, diminuição dos níveis de S
2 conduz para a estabilização de HIF-1α, uma subunidade do factor de transcrição HIF-1, e subsequente activação transcricional de genes que apresentam um elemento de hipóxia-sensível (HRE) nos seus promotores, tais como VEGF . No entanto, o VEGF regulação da expressão em células de cancro não está limitado à resposta ao estresse devido ao aumento do volume da massa de tumor. Vários outros factores têm sido mostrados para induzir o VEGF, tais como espécies de oxigénio reactivas [7] – [9], factores de crescimento [10], [11], citocinas [12], e mediadores lipídicos [13] – [16]. prostaglandinas derivadas de ácido (PG) E araquidónico
2 é um importante regulador da expressão de VEGF e a angiogénese em vários tipos de cancro diferentes e em cancro do cólon em particular. Exógeno PGE
2 induz a estabilização de HIF-1α [13] e a expressão de VEGF [17], em linhas celulares de cancro do cólon. VEGF e COX-2 expressão e angiogénese tumoral são positivamente correlacionados em amostras de cancro do cólon [18] – [20]
No entanto, a hipóxia não é o único estímulo estresse externo que ativa respostas celulares em câncer de cólon.. O conteúdo continuamente em mudança de lúmen intestinal expor células epiteliais normais e cancerosos para uma infinidade de estímulos. Tal estimulação fisiológica pode fornecer sinalização para promoção de câncer. De facto, o aumento da osmolaridade que é gerado durante o processo de absorção de água do cólon e consolidação fezes [21] – [23], parece activar as células cancerosas do cólon e promover a COX-2 e PGE
2 geração, mas não activa intestinais normais células [24]. Nosso objetivo neste estudo foi determinar o efeito do estresse hipertônica sobre a produção de VEGF por Caco-2 linha de células de cancro do cólon. O papel potencial da PGE autócrina
2 e MAPK vias de sinalização na modulação da geração de VEGF também foi analisada.
Métodos
Reagentes
O cloreto de sódio (NaCl) foi obtido a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) e dissolvido em água estéril para uma concentração de solução de estoque a 2 m. O IPLA
2 inibidor, Bromoenol lactona (BEL), a CPLA
2 /IPLA
2 inibidor, Arachidonyl Trifluoromethyl cetona (ATK) e prostaglandina E
2 foram adquiridos da Cayman Chemical Co. ( Ann Arbor, MI) e diluiu-se em etanol em conformidade com as instruções do fabricante. Os inibidores de COX-2, NS-398 (Cayman); p38, SB202190; JNK, SP600125; MEK1 /2, U0126 (todos de BIOMOL, Plymouth Meeting, PA) foram diluídos em DMSO (Sigma). Os anticorpos monoclonais para ensaios de immunoblot eram anti-COX-2 de IgG de ratinho (clone 33) a partir de BD Transduction Laboratories e anti-GAPDH (clone 6C5) IgG de ratinho a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), diluído a 0,003 ug /ml. A cabra ligado a HRP IgG anticorpo secundário anti-rato de Santa Cruz Biotechnology foi usado em 0,1 g /mL.
cultura celular e tratamentos
Caco-2 (ATCC HTB-37, presente de Dr. José Morgado Diaz, Instituto Nacional de Câncer, Brasil) a linha celular foi mantida em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 44 mm de NaHCO
3, 1 mM de NaH
2 PO?
4.H
2O, piruvato de sódio 1 mM, HEPES 10 mM, solução de vitaminas MEM, MEM solução de aminoácidos essenciais e não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 55? M β-mercaptoetanol, 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (todos os reagentes de cultura de células a partir de Invitrogen). A linha de células IEC-6 (Rio de Janeiro Cell Bank, Brasil) foi mantida em DMEM suplementado com FBS a 5% e 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram mantidas em frascos de cultura (crescimento celular área de superfície 25, 75 e 150 cm
2). As células foram recolhidas por 0,25% de tripsina e 0,38 g /L de EDTA em HBSS sem Ca
++ e Mg
++ e 5 × 10
5 células /poço foram semeadas em placas de 6 poços de fundo plano (área de 9,03 cm
2 /bem, Techno plásticas produtos, Suíça). 1,9 mL de meio de cultura DMEM suplementado fresco foi adicionado aos poços de cultura com ou sem inibidores farmacológicos e as células foram incubadas durante 15 min (30 min para os inibidores de quinases MAP) a 37 ° C. Todas as células receberam a mesma quantidade de veículo, por conseguinte, a concentração final foi inferior a 0,1% de DMSO ou etanol e não alterou a activação das células. As células foram estimuladas com a adição de 0-100 L de solução 2 M de NaCl. DMEM foi adicionado ao poço para completar o volume final de 2 ml. osmolaridade final do meio, após a adição de 100 mM de NaCl foi de aproximadamente 540 mOsm, em comparação com 367 mOsm de forma isosmótica. osmolaridade meio foi empiricamente determinado pelo método de congelamento, utilizando um osmómetro (Advanced Instruments Inc., Norwood, MA). Para minimizar a variação nos experimentos cinéticos o tempo total na cultura após o plaqueamento foi o mesmo para todos os pontos de tempo analisado.
Determinação da PGE
2 e VEGF no sobrenadante
A PGE
2 por linha de células Caco-2 foi determinada por EIA em sobrenadante de cultura de acordo com as instruções do fabricante (Cayman) e como descrito anteriormente [25]. Resumidamente, o meio de cultura foi colhido 24 horas após a activação celular por stress hipertónico e centrifugado a 250 x g durante 5 minutos para remover as células flutuantes e congeladas a -70 ° C. PGE
2 níveis foram ensaiadas utilizando um anticorpo monoclonal de PGE
2 kit EIA. Após o desenvolvimento da placa foi lida a 405 nm num leitor de placas (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A produção de VEGF por linha de células Caco-2 foi determinada por meio de ELISA no sobrenadante da cultura de acordo com as instruções do fabricante (R D Systems, Reino Unido). Resumidamente, o meio de cultura foi colhido 24 horas após a activação celular por stress hipertónico e centrifugado a 250 x g durante 5 minutos para remover as células flutuantes e congeladas a -70 ° C. os níveis de VEGF foram testadas utilizando um VEGF humano DuoSet (R D Systems, Reino Unido). Depois de placa de desenvolvimento foi lida a 450 nm num leitor de placas (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
análise Immunoblot
As células foram recolhidas com um raspador de células (COSTAR) e 100 ul de SDS a 10% foi adicionado por poço da placa de cultura celular de 6 poços. 100 ul de 2 × tampão de carga (1,4 M β-mercaptoetanol, 184 mM de base Tris, 80 uM de bromofenol azul, 3% de glicerol, 8% SDS, pH 6,8) foi adicionado ao lisado celular. Os lisados celulares foram imediatamente aquecida a 100 ° C durante 5 minutos antes da sonicação a 30% de amplitude e 30 J de energia de alta intensidade do processador ultra-sónico. As amostras foram resolvidas por electroforese em SDS-PAGE em gel de poliacrilamida a 10% a 29 mA /gel durante 1 h. As proteínas separadas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Santa Cruz) e bloqueadas em leite em pó magro a 5% em 1 x TBS (Tris 10 mM; NaCl 150 mM, pH 7,4) durante 12 h para COX-2 de rotulagem, ou por dois h para todos os outros anticorpos à temperatura ambiente. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos primários diluídos em TTBS (TBS com 0,2% de Tween 20) e 0,05% de azida de sódio durante 2 horas à temperatura ambiente para a COX-2 ou 12 horas a 4 ° C durante outros anticorpos. Após marcação com anticorpos secundários anti-IgG ligado a HRP, as proteínas foram analisadas utilizando ECL Ocidental Analysis System Blotting (Amersham Biosciences).
A análise estatística
Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM) de experiências realizadas em triplicado. Gráficos e Western blots apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes. As comparações múltiplas entre grupos foi realizada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett ou de Bonferroni (Prism versão 4.03, Graphpad Software, Inc., La Jolla, CA). Os símbolos
+ e * representam
p
valores. 0,05 grupo quando comparado ao grupo controle não-estimulada ou estresse hipertônica /CoCl
2 estimulada respectivamente
Resultados
estresse hipertônica induz a produção de VEGF por Caco-2 e PGE
2 modula a produção de fator angiogênico neste estresse ambiental
estresse hipertônica estimula a produção de VEGF por Caco-2 após 24 horas de activação ( Figura 1A), seguindo a mesma resposta à dose e decurso de tempo (dados não mostrados) de PGE
2 geração sob as mesmas condições de estimulação [24]. Como PGE
2 foi descrito para desempenhar um papel na angiogénese e VEGF verificou-se se a produção de PGE
2 foi regulação da produção de VEGF por células Caco-2 durante a estimulação com meio hipertónico. Inibição da PGE
2 por tratamento com CPLA
2 (ATK) (Figura 1B) ou COX-2 (NS-398) inibidores (Figura 1C) aumento da produção de VEGF. Este fenómeno foi revertido pela adição de PGE
2 para o meio de cultura celular (Figura 1D), indicando um papel específico para a PGE
2.
(A) células Caco-2 foram estimuladas com 10 -100 mM de NaCl durante 24 h antes da análise da produção de VEGF. produção de VEGF foi determinada por meio de ELISA em sobrenadantes de 2-Caco células estimuladas com o stress hipertónico (100 mM de NaCl) durante 24 h após pré-tratamento com inibidores de CPLA
2, ATK (B); COX-2, NS-398 (C), ou PGE
2 (D). As células HCT116 foram estimuladas com 100 mM de NaCl durante 24 h após pré-tratamento com inibidores de CPLA
2, ATK (E); COX-2, NS-398 (F). +, *
P 0,05
, para células não estimuladas ou células estimuladas, respectivamente. **
P 0,05
, quando comparada com células tratadas com NS-398. barras do gráfico mostram meios ± SEM de amostras em triplicado.
Para verificar se a inibição da produção de VEGF por Caco-2 estimulada com o estresse hipertônica foi uma consequência da PGE
2 ação e não uma consequência da acção inespecíficos de drogas farmacológicas utilizadas nos experimentos, foi realizado o mesmo experimento em HCT116, uma linha de células de câncer de cólon que não expressam COX-2 e não produz níveis detectáveis de PGE
2 sob estresse hipertônica. Não foram observadas quaisquer alterações na produção de VEGF, excluindo a possibilidade de interferência dos inibidores farmacológicos (Figuras 1E e F). Esses resultados mostraram que PGE
2 produzido por Caco-2 activado pelo stress hipertônica tem uma ação inibitória autócrina sobre a produção de VEGF.
EP
2 receptor desempenha um papel na regulação da produção de VEGF através PGE
2 em Caco-2 estimulada com o estresse hipertônica
Para determinar qual é o mecanismo de ação da PGE
2 na regulação da produção de VEGF no estresse hipertônica, Caco-2 foram ativados com hipertônica meio durante 24 horas e tratou-se com AH6809, um antagonista do receptor EP. Verificou-se a inibição da sinalização do receptor de EP causou um aumento da produção de VEGF (Figura 2A). Em seguida, para identificar qual o receptor específico está envolvido neste fenómeno Caco-2 foram estimuladas com meio hipertónico e tratou-se com ATK e receptores EP agonistas. A CPLA
2 inibidor (ATK) removeu a interferência da PGE
2 produzida pelas células de câncer de cólon e receptores de PE foram ativados agonistas apenas por exogenamente adicionado. Por conseguinte, a Figura 2B mostra que o tratamento com VEGF aumenta a produção de ATK e quando PGE
2 ou 16,16-dimetil PGE
2, um agonista do receptor de EP bandeja, foram adicionados ao meio deste efeito foi revertido, reforçando que EP a activação do receptor tem um efeito inibitório sobre a produção de VEGF. Aumento da produção de VEGF por inibição endógena da PGE
2 foi também invertida por butaproste, um agonista de receptores EP2 específica (Figura 2B). A activação com EP1, 17-fenil-trino-PGE
2, ou EP3, sulprostone, agonistas não teve qualquer efeito no aumento da produção de VEGF. Desde expressão EP4 parece estar ausente em células Caco-2 [26], nossos resultados indicam que endógena PGE
2 modula a produção de VEGF induzida por estresse hipertônica através da ativação de EP2
(A) Caco-2. As células foram estimuladas pelo stress hipertónico (100 mM de NaCl) durante 24 h após pré-tratamento com PE e DP antagonista dos receptores, 6809 AH (A); com inibidor de CPLA
2, ATK (10 uM); PGE
2; receptores EP agonista, 16,16-dimetil Prostaglandina E
2; EP1 e EP3 agonista dos receptores, 17-fenil trinor prostaglandina E
2; EP2 do receptor agonista, e butaproste agonista do receptor EP3, sulprostona (B); ou com um inibidor de PKA, H-89. PGE
2 e os seus análogos foram usados a 0,1 uM. produção de VEGF foi determinada por meio de ELISA em sobrenadantes de células Caco-2. +, *
P 0,05
, quando em comparação com células não estimuladas ou células estimuladas, respectivamente. **
P 0,05
, quando comparada com células tratadas com ATK. barras do gráfico mostram meios ± SEM de amostras em triplicado.
EP2 é um receptor de tipo rodopsina acoplado a Gs e medeia os aumentos no acampamento [27]. Assim, nós testamos se PKA desempenhado um papel na PGE
2 efeitos mediados através EP2 durante o estresse hipertônica. Inibição da PKA H-89 por aumento da produção de VEGF por 2-Caco células expostas a forma hipertónico (Figura 2C). Reforçando a via inibitória potencial envolvendo PGE
2-EP2-AMPc-PKA.
Papel do sistema endócrino PGE
2 na CoCl
2 induzida pela produção de VEGF
Nós também verificou se PGE
2 teve um papel na regulação da produção de VEGF sob uma condição simulatory padrão. Para activar a via do factor-hipoxia induzida (HIF) e simular a hipoxia, as células Caco-2 foram activadas com CoCl
2. Após 24 horas de estimulação com CoCl
2, Caco-2 apresentaram acentuada produção de PGE
2 (Figura 3A) e aumento da expressão de COX-2 (Figura 3B). Outras experiências foram realizadas após adjunção de 1 mM de CoCl
2 para o meio após 24 horas de activação. Além disso, CoCl
2-estimuladas PGE
2 geração está dependente de COX-2, uma vez que foi completamente inibida por NS-398 (Figura 3C).
células Caco-2 foram estimuladas com 0,1- 1 mM de CoCl
2 durante 24 h antes de PGE
2 e a produção de VEGF (A e D, respectivamente) e análise da COX-2 a expressão da proteína (B). PGE
2 e VEGF pelas células Caco-2 foram estimuladas com 1 mM de CoCl
2 durante 24 h após pré-tratamento com inibidor de COX-2, NS-398 (C e E, respectivamente). produção de VEGF pelas células Caco-2 estimuladas com 0,1-1 mM de CoCl
2, durante 24 h (D). PGE
2 e VEGF produção foram determinados por ELISA em sobrenadantes de células Caco-2. expressão de COX-2 e GAPDH em sedimentos celulares foi analisada por Western blotting. +, *
P 0,05
, quando em comparação com células não estimuladas ou células estimuladas, respectivamente. barras do gráfico mostram meios ± SEM de amostras em triplicado.
Semelhante a estimulação estresse hipertônica, celular CoCl
2-activado também produziu VEGF (Figura 3D). No entanto, autócrino PGE
2 parece ter um efeito oposto nesta condição uma vez que a produção de tratamento NS-398 inibiu o VEGF (Figura 3E). Esses resultados indicam que a PGE
2 tem um papel autócrina estimuladora sobre a produção de VEGF em CoCl
2 activação.
Papel das MAPKs na produção de VEGF pelas células Caco-2
Para determinar Se a produção de VEGF foi regulados diferencialmente em células Caco-2 para além do potencial papel autócrino de PGE
2, que virou-se para a identificação de vias de MAPK envolvidos. Uma vez que foi mostrado acima para um papel de ERK 1/2, JNK e p38 em PGE
2 geração [24] e para evitar o problema potencial que isto representa para interpretar os resultados, os experimentos foram realizados na presença de 1 uM de NS-398. A inibição farmacológica da ERK 1/2 e p38 vias indicado um papel comum na activação quer por estresse hipertónica ou CoCl
2 (Figuras 4A e B). papel JNK foi mais restrito, como SP 600125 produção de VEGF marcadamente inibida induzida por CoCl
2 de ativação enquanto não afetou a produção de VEGF induzida por estresse hipertônica (Figuras 4A e B).
Os inibidores da JNK, SP600125 ; p38, SB202190; e MEK 1/2, U0126 foram adicionados antes da estimulação com o stress hipertónica (NaCI 100 mM) (A) ou 1 mM de CoCl
2 (B) durante 24 h. células Caco-2 foram pré-tratadas com 1 uM de NS-398 para evitar endógena PGE
2 de produção em todas as amostras. produção de VEGF foi determinada por meio de ELISA em sobrenadantes de células Caco-2. +, *
P 0,05
, quando em comparação com células não estimuladas ou células estimuladas, respectivamente. barras do gráfico mostram meios ± SEM de amostras em triplicado.
Discussão
O papel da PGE
2 no desenvolvimento do câncer é geralmente descrito como um fator autócrino capaz de modular muitos aspectos da a biologia celular do cancro, em particular os de origem epitelial [28], [29]. PGE
2 foi mostrado para aumentar a proliferação, capacidade metastática e a produção de factores pró-angiogénicos [17], [30], [31]. No entanto, esses estudos geralmente carecem de informação sobre os estímulos que irá conduzir a cascata do ácido araquidónico e, finalmente, PGE
2 geração além da expressão induzida de COX-2. Nós demonstramos recentemente que um meio hiperosmótica pode induzir COX-2 expressão e PGE
2 geração em Caco-2 células cancerígenas do cólon [24]. Mais importante ainda, hiperosmolaridade pode desencadear o passo limitante na PGE
2 geração ativando CPLA
2-α e induzir a libertação de ácido araquidónico livre. células epiteliais intestinais normais não apresentaram produção de PGE
2 sob o mesmo estímulo hiperosmótica. Tendo identificado um estímulo fisiológico relevantes para células cancerígenas do cólon, investigamos o efeito do meio hipertônica sobre a produção dos principais factores pró-angiogénicos, VEGF, eo potencial influência autócrina da PGE
2.
Exposição de Caco-2 para células de forma hipertónico levou a uma produção significativa de VEGF. Conforme demonstrado antes que esta produção de VEGF ocorreu em paralelo com a PGE
2 geração. PGE
2 é descrito como um potente indutor de VEGF com base em experiências em que a sobre-expressão de COX-2 aumentaram a produção de VEGF por linhas de células do cólon e do cancro da mama. Além disso, esta produção de VEGF foi inibida por inibidores selectivos da COX-2. Por isso, procurou investigar a influência autócrina da PGE
2 geração em 2-Caco células estimuladas por meio hipertônico. Surpreendentemente, a inibição de qualquer um CPLA
2 ou COX-2, por ATK ou NS-398, respectivamente, aumentou ainda mais a produção de VEGF. Este efeito pode ser atribuído à inibição de PGE
2 geração como a restauração da PGE
2 níveis de adição exógena reverteu a produção de VEGF aos seus níveis originais em ATK tratada células Caco-2. As células HCT-116 também pode ser activado por meio de hipertónica para produzir VEGF. No entanto, as células HCT116 nem expressa COX-2, nem produzir PGE
2 [31], apesar de as células sendo ativada ou não. Assim, a falta de efeito da ATK e NS-398 em HCT116 exclui quaisquer potenciais efeitos pontuais alvo destes inibidores [32].
PGE
2 atua sobre um grupo de receptores acoplados à proteína ( GPCRs). Há quatro GPCRs respondendo a PGE
2 subtipos designados EP1, EP2, EP3 e EP4, levando a via de sinalização distinta e efeito biológico geral [27]. Para determinar a dependência da PGE
2 efeitos autócrinos sobre a sinalização do PE, foi utilizado um antagonista não específica de todas as quatro receptores EP, AH 6809. O tratamento com AH 6809 imitou o efeito de inibição da produção de VEGF por PGE
2, indicando que a PGE
2 sinais através dos seus receptores de membrana plasmática para regular negativamente a produção de VEGF induzida por forma hipertónico. O subtipo particular envolvido parece ser EP2 como agonista selectivo, butaproste, é capaz de substituir totalmente para PGE
2. Pelo contrário, nem EP1 nem EP3 agonistas tratamentos apresentaram o efeito inibitório sobre a produção de VEGF. EP2 parece par com o aumento dos níveis de cAMP e subsequente activação de PKA, como a inibição da PKA por H-89 reproduz os efeitos da inibição da PGE
2 geração ou ação. É importante notar que as experiências foram realizadas com PGE
2 e seus análogos, em concentrações que eram compatíveis com os níveis produzidos endogenamente. Efeitos na produção de VEGF por células cancerígenas do cólon têm sido atribuída a PGE
2, utilizando concentrações de até 100 mm [13] que excedem em muito a quantidade de PGE
2 realmente necessário para ativar seus receptores [27] ou o que é produzido na massa tumoral [33].
Demonstrou-se a activação de AMPc-PKA EP2-GSK-3-via de sinalização conduz à diminuição da fosforilação de beta-catenina, permitindo a sua translocação e activação de Tcf /Lef dependente da transcrição (para uma revisão, ver [34]) de genes envolvidos no cancro, tais como COX-2 e VEGF. No entanto, em nosso modelo de estresse hipertônica, EP2 ativação da via de sinalização faz com que a repressão da produção de VEGF. Para melhor compreender a regulação desta via em que o stress hipertónica investigou o papel de GSK-3in esta activação com a utilização de SB216763, um competidor a GSK-3 e α β inibidor (50-5000 nM, dados não apresentados). O tratamento aumentou a produção de VEGF, indicando que o efeito inibitório de EP2 na produção de factor angiogénico não é dependente desta cinase. Uma possibilidade para o efeito distinto de activação EP2 no estresse hipertônica é que este regulamento está ocorrendo através do acampamento. Alguns estudos têm mostrado AMPc pode inibir a produção de citoquinas através da inibição de Ras-dependentes sinais pela PKA, inactivando sinalização MEK /ERK ou, bloqueando a fosforilação da MAPK p38 [35] – [37]. Como ERK via /p38 MAPK está envolvida em nossa produção modelo de indução de VEGF, tais descobertas podem ser indicativos de o mecanismo pelo qual a sinalização EP2 está bloqueando a produção de VEGF no estresse hipertônica.
Para determinar se o papel inibitório da PGE
2 pode ser estendido a outros estímulos, foram utilizados CoCl
2 para induzir a estabilização de HIF-1α e imitar a resposta à hipóxia [13]. Como mostrado para a estimulação hipertónico, CoCl
2 induzida por PGE
2 geração era dependente de COX-2. O
geração PGE 2 também foi acompanhada pela produção de VEGF. A indução da produção de VEGF por CoCl
2 foi mostrado antes em fibroblastos humanos [38], a linhagem de pulmão de células de cancro [39], epitélio da retina [40], as linhas de células de glioma [41], as linhas celulares de cancro da próstata [42] e em astrócitos [43], no entanto não houve nenhuma tentativa para investigar o potencial de produção de PGE
2 ou os seus efeitos autócrinos. A inibição de COX-2 inibiu a produção de VEGF induzida por CoCl
2, indicando um papel estimulador para PGE
2 e que o efeito autócrino de PGE
2 é dependente do tipo de estímulos utilizado.
meio hipertônica induz a ativação de várias quinases MAP que podem estar envolvidos na regulação da expressão de VEGF [24]. Uma vez que estas quinases MAP também estão envolvidos na estimulação
actividade 2-α CPLA e produção de PGE
2, que eliminado o efeito inibidor de PGE
2 antes de tentar analisar o seu papel na produção de VEGF. Caco-2 As células activadas por forma hipertónico, na presença de NS-398 mostram claramente uma dependência acentuada em p38 e assim por diante menos ERK 1/2 para produzir VEGF. produção de VEGF CoCl
2-induzida por células Caco-2 mostrou sensibilidade perfil semelhante ao MAP quinase com a excepção de uma redução acentuada pelo inibidor de JNK. Os papéis distintos para via JNK indicam que a produção diferenças em meio hipertônica e CoCl
2 induzida por VEGF de ir além da sensibilidade à autócrina efeitos inibitórios da PGE
2. Ele está atualmente sob investigação, se essas diferenças de sinalização pode ser responsável pelos efeitos distintos de PGE
2 sobre cada tipo de estímulos.
Uma das características do modelo atual para a regulação da angiogénese no tumor em massa, particularmente no cancro do cólon, consiste na regulação da função das células endoteliais pelas células cancerosas. Por conseguinte, o papel da PGE
2 na angiogénese é limitado a uma estimulação autócrina da produção de factores pró-angiogénicos pela célula tumoral. Embora interessante, este modelo não compreende os estímulos externos potenciais envolvidos na expressão de COX-2 e VEGF produção nem situações em que a célula que expressa a COX-2 e a produção de PGE
2 é outro do que a célula cancerosa. Por exemplo, o crescimento ectópica de HCT116 e HT29, células que não expressam a COX-2 ou produção de PGE
2, é dependente da expressão de COX-2 por células endoteliais e estromais [44]. COX-2 expressão em modelos de ratos com polipose adenomatosa familiar,
Min
[33], [44] e Apc
Δ716 [45] ratos, é restrita a células estromais e intersticiais. As diferenças na dependência JNK e autócrina PGE
2 efeito inibitório sobre a produção de VEGF pela mesma linha de células de cancro do cólon são uma indicação clara de como o modelo também deve levar em conta que estas células são expostas a diferentes estímulos microambiente.
Reconhecimentos
os autores gostariam de agradecer ao Dr. Karen A. Bell por seus comentários sobre o manuscrito.