PLOS ONE: 3-Dimensional Cultura Sistemas de Anti-Cancer Profiling Composto e high-throughput screening Revelar Aumentos na citotoxicidade EGFR Inhibitor-Mediated Comparado a monocamada Cultura Systems

Abstract

3-dimensional modelos de cultura (3D) têm o potencial para fazer a ponte entre a cultura de células em monocamada e

in vivo

estudos. Para beneficiar a descoberta de drogas anti-câncer a partir de modelos 3D, são necessárias novas técnicas que permitem seu uso em high-throughput (HT) rastreio formatos ajustados. Nós estabelecemos métodos de cultura 3D miniaturizado robustos o suficiente para telas HT automatizadas. Aplicou-se estes métodos para avaliar a sensibilidade de linhas de células epiteliais normais da mama e tumorigénicas contra um painel de drogas de oncologia quando cultivadas como monocamadas (2D) e esferóides (3D). Nós identificamos duas classes de compostos que exibem citotoxicidade preferencial contra as células cancerosas sobre as células normais quando cultivadas como esferóides 3D: agentes de metas de microtúbulos e do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) inibidores. Além disso melhorar mediante o nosso modelo 3D, diferenciação superior dos valores de EC50 nas telas de prova de conceito foi obtido por co-cultura das células de cancro da mama com fibroblastos humanos normais e células endoteliais. Além disso, observou-se a sensibilidade seletiva das células cancerosas no sentido de quimioterápicos em condições de co-cultura 3D, ao invés de monocamadas de co-cultura como 2D, destacando a importância das culturas 3D. Finalmente, examinámos os mecanismos putativos que conduzem a potência diferente exibida por inibidores de EGFR. Em resumo, os nossos estudos estabelecem robustos modelos de cultura 3D de células humanas para a avaliação de agentes de células HT-selectiva de tumores. Esta metodologia está prevista para fornecer uma ferramenta útil para o estudo das diferenças biológicas dentro condições de cultura 2D e 3D em formato HT, e uma importante plataforma para a descoberta de drogas anti-câncer romance

Citation:. Howes AL, Richardson RD , Finlay D, Vuori K Sistemas (2014) 3-Dimensional Cultura para Anti-Cancer Profiling Composto e high-throughput screening Revelar aumentos na citotoxicidade EGFR Inhibitor-Mediated em relação à cultura Sistemas de monocamada. PLoS ONE 9 (9): e108283. doi: 10.1371 /journal.pone.0108283

editor: Chryso Kanthou, da Universidade de Sheffield, Reino Unido

Recebido: 01 de novembro de 2013; Aceito: 27 de agosto de 2014; Publicação: 23 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Howes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada pela subvenção ARRA (1 RC1 EB011780-01) “throughput screening alta em esferóides 3D humanas epiteliais, endoteliais e células do estroma” (Vuori, PI) a partir de HHS-National Institutes of Health-National Institute of BioImaging e Bioengenharia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores observam que um ou mais dos autores estão atualmente empregados por uma empresa comercial (Tanabe Research Laboratories). Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O desenvolvimento e utilização de sistemas modelo que recapitular arquitetura tumor sólido humano e biologia são essenciais para melhor compreender a patofisiologia de células de tumor, e para ajudar na descoberta de novas terapias anticancro. Como resultado, têm sido desenvolvidos modelos para reflectir o microambiente de tumores sólidos. culturas esferóides 3D pode recapitular interacções célula-célula, as interacções célula-matriz, de nutrientes e oxigénio, e os gradientes de polaridade célula que tem falta de cultura monocamada 2D tradicional [1], [2]. culturas 3D também conter zonas heterogéneas de proliferação, e células moribundas quiescentes, que são do mesmo modo encontradas em tecido tumoral humano e que apresentem diferentes níveis de sensibilidade aos tratamentos anti-tumor [1], [3]. Assim, modelos de cultura celular 3D trazer um valor significativo para a descoberta de drogas e processo de desenvolvimento como um potencial ponte prática entre o tradicional

in vitro

culturas em monocamada e caro

In vivo

estudos com animais [4], [ ,,,0],5], [6].

O tratamento corrente para a maioria dos cancros humanos inclui os agentes quimioterapêuticos que são tóxicas contra as células em divisão, resultando frequentemente em numerosos efeitos secundários. A aprovação de terapias molecularmente-alvo, como o imatinib inibidores da proteína cinase, gefitinib e lapatinib, ter confirmado a promessa de que os agentes que visam especificamente as células cancerosas, em vez de todas as células em divisão resultar em menos efeitos colaterais.

quando são realizados estudos de citotoxicidade contra as células cancerosas, as células são tipicamente cultivadas como uma monocamada, em que os contactos célula-célula e sinais microambiente faltam e as condições de cultura não pode, portanto, reflectir o

in vivo

situação para a citotoxicidade e /ou resistência a droga. Para contornar esses problemas técnicos, culturas 3D estão sendo formadas e analisados ​​em uma variedade de formatos interessantes [7], [8], [9], e co-culturas estão sendo reconhecidos como sistemas valiosas para prever as respostas de drogas

in vivo

para um número de doenças diferentes [10], [11], [12]. Um convite à apresentação de complexos modelos de cultura 3D especificamente para o cancro da mama [13] destaca a importância do trabalho por Reid

et al.

Para medir as mudanças de transcrição em culturas monotípicas 3D usando imagens de alto conteúdo [14], bem como do nosso estudo aqui onde se medir a viabilidade das células em de alto rendimento (HT) passíveis co-culturas em 3D que demonstram a utilidade de co-culturas em 3D para a identificação de agentes anti-tumorais com selectividade robusto para células tumorais em relação às células normais.

Aqui, nós utilizamos uma versão modificada do esferóide multicelular “gota em suspensão” técnica [15] e optimizaram-la em placas de fundo redondo de alta densidade que foram tratados com hidrogeles para inibir a ligação de células, permitindo a formação de esferóides individuais de tamanho reprodutível através de vários tipos de células humanas diferentes. A necessidade de modelos HT-propícios para a investigação do cancro foi recentemente revisto [16]. Dos cinco métodos mais importantes para a produção de esferóides de dimensão uniforme; isto é, hidrogel de quitosano de co-cultura, os micropoços de PDMS de fundo em V, os dispositivos de microfluidos, de duas camadas de corpos embrióides, e as gotas de suspensão poços múltiplos (revisto em [3] e [17]), nós concluímos que o multi-poços pendurado modelo da gota é o mais HT-propícios devido ao custo, atendendo aos requisitos de manuseio de líquidos, e resultando na reatividade menos cruz com compostos administrados. Em nossos estudos, geramos culturas 3D de células normais e tumorigênicos epiteliais de mama adequados para leituras de viabilidade celular robustas em telas primárias e confirmação hit secundário. Os esferóides também foram encontrados para ser passível de técnicas tradicionais bioquímicos e celulares biológicas (por exemplo immunoblotting e imunocoloração), permitindo estudos mecanicistas. Assim, usando o mesmo formato experimental, estamos agora em condições de comparar diretamente as células normais em células tumorais em cultura 3D.

No presente estudo, comparamos a sensibilidade de linhagens de células normais e tumorais epiteliais de mama para o 89 compostos clinicamente relevantes nos do National Cancer Institute (NCI) oncologia Aprovado Coleção de drogas (ADC) [18]. Como esperado, observou-se a citotoxicidade significativa para ambas as linhas celulares normais e tumorais com um número de fármacos, mas também identificados agentes de direccionamento de microtúbulos e inibidores do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), tal como as principais classes de compostos que exibiram citotoxicidade preferencial contra as células tumorais sobre células normais quando cultivadas em 3D. Nós também gerado co-culturas em 3D de células epiteliais de tumor da mama humano com estromal e as células endoteliais e comparadas àquelas de co-culturas em 3D do estroma e as células endoteliais. A biblioteca ADC foi novamente rastreada utilizando estas co-culturas, desta vez sobre quatro concentrações e com robustez melhorada do ensaio. Os resultados destas telas de prova de conceito indicaram que as culturas em 3D e co-culturas podem ser ferramentas valiosas para a identificação de drogas clinicamente úteis, incluindo agentes molecularmente-alvo com selectividade para as células de tumor em relação às células normais que têm o potencial para reduzir colaterais deletérios -Efeitos frequentemente observadas com agentes citotóxicos.

Materiais e Métodos

compostos e reagentes

a oncologia Aprovado Coleção de drogas (ADC) foi obtido a partir do Programa Therapeutics desenvolvimento do Instituto Nacional do Câncer . A recolha inclui 89 drogas, todas mantidas a 10 mM em 100% de DMSO. Para mais informações, consulte: http://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/oncology_drugset_explanation.html [18]. Hoechst 33342 foi adquirida a Invitrogen (H3570), vinblastina e vinorelbina a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), e lapatinib, gefitinib, dasatinib, e Tirfostina AG1478 de LC Labs (Woburn, MA).

as células e

células Anticorpos

MCF-10A, células BT-474, e fibroblastos de prepúcio humano (Hs.58) foram obtidas da ATCC. As células MCF-10A foram cultivadas em DMEM 50/50 /F12, 5% de ESF, 1 ug /ml de hidrocortisona, de 5 ug /ml de insulina, 5 ng /mL rhEGF, e penicilina, estreptomicina, glutamina e suplementos (PSG). As células BT-474 foram cultivadas em meio RPMI com FCS a 10% e fibroblastos humanos (HF) foram cultivadas em DMEM com FCS a 10% e PSG. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram obtidos a partir de Lonza (Walkersville, MD) e cultivadas em endotelial basocelular da Lonza Médio (EBM-2) suplementado com EGM-2 singlequots (CC-3124). O anticorpo CD31 (clone JC70A) foi obtido a partir de Dako North America, Inc. (Carpinteria, CA) (# M0823) e utilizado a uma diluição de 1:50, o anticorpo vimentina (V2122-11E) a partir de US Biológica (1:200 diluição ), o anticorpo β-actina (clone AC-40) a partir de Sigma (1:5000 diluição para IB) e o anticorpo HER2 (554,299) da BD Biosciences (1:1000 diluição). O anticorpo fosfo-HER2 (6B12 clone) (1:100 diluição para IF, 1:1000 para IB), anticorpo fosfo-EGFR (D7A5 clone) (1:100 diluição para IF, 1:1000 para IB) e EGFR total de anticorpo (C74B9 clone) (1:1000 para IB) foram todos comprados a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA).

condições de cultura celular em 2D ou 3D

MCF-10A, BT 474, fibroblastos humanos ou células HUVEC foram mantidas como culturas em monocamada em meios descritos acima. Para gerar culturas em miniatura em 3D para HTS, as células foram semeadas a um número de células observado para formar um único esferóide de forma consistente, uniformemente arredondado. As células BT-474 foram semeadas a 3000 células /poço (em meio RPMI + 10% de FBS + forma PSG) as células MCF-10A a 1000 células por poço (50/50 em DMEM /F12, 5% de ESF, 1 ug /ml e hidrocortisona, de 5 ug /ml de insulina, 5 ng /mL rhEGF, PSG) em pratos de fixação ultrabaixo de fundo redondo de 96 cavidades (Corning # 7007). Ao longo de um período de 48 horas esferóides auto-montadas a partir das células semeadas, um esferóide (de -250 microns de diâmetro) por poço. Esferóides superiores a 200 microns em diâmetro foram encontrados para ter células hipóxicas localizadas no interior do esferóide [hypoxyprobe usando o reagente de detecção, NPI Inc. (dados não mostrados)]. A viabilidade das células que compõem os esferóides foi verificada utilizando ATP como uma leitura e as células foram encontrados para manter a viabilidade por, pelo menos, cinco dias após o plaqueamento, sem ter de alterar a forma ou adicionar suplementos. Para HTS culturas em 2D, revestidos por cultura, de fundo plano de placas de 96 poços de tecido comum (Corning # 3595) foram utilizados para crescer células, no mesmo meio e em concentrações celulares mesmos como observado acima.

Para co-culturas em 3D, as células tripsinizadas foram contadas e misturados em conjunto para ser semeadas em placas de 96 poços de fixação ultrabaixo de fundo redondo (Corning # 7007). Tal como indicado nas legendas, ou o número total de células foi mantida a 3000 células por cavidade, ou 3000 células BT-474 foram semeadas em conjunto com 1500 EFH e /ou células HUVEC. Como observamos com os esferóides monotípicas, as co-culturas também espontaneamente formado um esferóide por poço durante o período de incubação de 48 horas. Por análise dos níveis de ATP, os esferóides de co-cultura eram viáveis ​​durante 5 dias sem uma mudança do meio ou adição de suplementos. Todas as co-culturas foram mantidas em uma mistura 01:01:01 de RPMI: DMEM: EGM-2 meio completo. As co-culturas foram plaqueadas em 2D a mesma proporção de células no mesmo meio misto, mas em placas de 96 poços de cultura de tecidos de fundo plano (Corning # 3595). Quarenta e oito horas após o plaqueamento, foram utilizadas as células em 2D ou 3D para os ensaios de citotoxicidade, rastreio, ou imunocoloração, como descrito em secções subsequentes Métodos.

Ensaio de Citotoxicidade

As células foram plaqueadas como descrito para o 2D ou cultura 3D, e depois tratou-se com compostos em que a concentração indicada durante 48 horas. Para quantificar ATP celular como uma medida de viabilidade, 50 ul de reagente CellTiter GLO (Promega) foi adicionado a cada poço. As placas foram agitado orbitalmente durante 15 minutos à temperatura ambiente, para facilitar a lise. Além disso, os esferóides foram triturados seis vezes para promover a lise completa. Bem conteúdos foram transferidos para uma placa branca de fundo de 96 poços e lidas num leitor de placas Bio-Tek luminescência.

análise de imunofluorescência de secções esferóides

esferóides foram fixados durante 1 hora em formalina de zinco , lavadas em PBS e, em seguida congelada em OCT (Takeda) para o seccionamento criostato. Dez micron secções foram montadas em lâminas e coradas com anticorpos primários adequados durante 1 hora a 37 ° C. Após três lavagens exaustivas em TBS 1X + 0,2% de Tween-20, as lâminas foram incubadas com anti-rato Alexa 488 (Invitrogen) em 1:500 de diluição, anti-coelho Alexa 594 (Invitrogen) em 1:750 diluição e Hoechst 33342 em uma diluição 1:10,000 durante 1 hora a 37 ° C. As lâminas foram lavadas e montadas com Vectashield (Vector Laboratories).

Microscopia e renderização 3D

Brightfield ou imagens fluorescentes (10x) foram obtidas por um microscópio AI Observer Zeiss com fotométricos CoolSnap HQ

2camera. Confocal (BD CARVII) de corte óptico foi realizada em z-série capturado em 4 passos micron, e, em seguida, submetido a desconvolução 3D através Autoquant (Media Cybernetics) de software, e visualizado no visor do 4D Metamorph (MDS Analytical Tech).

protocolos de rastreio

a oncologia Aprovado Coleção drogas obtidos do Instituto Nacional do Câncer foi usado nas telas. Para telas primárias único ponto de concentração, as células BT-474 foram semeadas a 3000 células /poço (em meio RPMI + 10% de FBS + forma PSG) e as células MCF-10A a 1000 células por poço (50/50 em DMEM /F12, 5% ESF, 0,5 ug /ml de hidrocortisona, de 5 ug /ml de insulina, 5 ng /mL rhEGF, PSG) em 96 poços placas Corning # 3595 (para 2D) ou Corning # 7007 (para 3D). placas de diluição foram feitas diluindo os compostos 01:01 com 50% de meio /50% DMSO para se obter uma concentração final de 5 uM por poço. Quarenta e oito horas após o plaqueamento, as células foram tratadas com a biblioteca de compostos. Após 48 horas de incubação composto, as células foram lisadas com 50 ul CellTiterGLO (Promega) de reagente com 15 minutos de agitação orbital à temperatura ambiente. 75 uL de solução foi transferida para placas Greiner Lumitrac e lida num leitor de placa BioTek luminescência.

Para as telas de co-cultura, utilizou-se o rastreio de série de diluição primária. As células foram semeadas em placas de 96 poços a 1500 HF + 1500 células HUVEC por poço, durante a fibroblastos humanos e células endoteliais humanas (HF + HE) co-culturas (em meio EGM-2 completo), ou 750 HF + 750 HUVEC + 1500 BT-474 para os BT-474 + HF + ele co-culturas (em 1:01 RPMI + 10% FBS + PSG: meio EGM-2 completa). As células semeadas em Corning # 7007 fundo redondo, placas ultra-baixas de fixação formado um único esferóide 3D por poço, enquanto as células semeadas em Corning # 3595 fundo plano, de tecido placas tratados com cultura anexados como uma monocamada 2D. Após 48 horas de incubação para permitir a formação de esferóides ou a ligação de células, as células foram tratadas utilizando um manipulador de líquidos estrela com 1 mL do composto. Aqui, a colecção de drogas de oncologia aprovada foi usada para preparar placas mestres através de diluição com DMSO utilizando um manipulador de líquidos ESTRELA a 10 mM, 1 mM, 100 uM e 10 uM placas Stock de tratar as células com quatro diferentes concentrações finais (100 uM, 10 uM, 1 uM e 0,1 uM). Lapatinib foi adicionado a cada placa de diluição de um controlo positivo, para se obterem concentrações finais em poços de 10 uM, 1 uM, 0,1 uM e 0,01 uM. Quarenta e oito horas mais tarde, 50 ul de CellTiterGLO reagente (Promega) foi adicionado em cada poço utilizando uma Multidrop Combi. As placas foram agitadas durante 15 minutos, para estimular a lise das células. lise esferóide foi ainda auxiliado por mistura de 100 ul de volume utilizando o manipulador de líquidos STAR, e, em seguida, 75 ul foi transferido para uma placa de 96 cavidades Greiner Lumitrac para leitura de luminescência num leitor de placas Envision PE. Para as placas de monocamadas, 75 ul foi transferido para as placas Greiner Lumitrac por poço, e também ler sobre o PE Envision.

Resultados e Discussão

Triagem de culturas 3D revela seletividade de células tumorais com certeza classes de drogas

para determinar se as células humanas cultivadas em cultura 3D oferecido um benefício sobre culturas 2D para a identificação de compostos anti-tumorais com maior seletividade para células tumorais do que células humanas normais, nós otimizamos as condições para crescer e epiteliais de mama tela células em dois formatos multi-poços diferentes. Para formar esferóides 3D, foram utilizados 96 poços de fundo em U placas de fixação ultra-baixos. Isto encorajou as células adicionadas a cada poço para se agregar em conjunto e formam um único esferóide, uma vez que não podia aderir às superfícies de poços (Figura 1A). 2D monocamadas foram cultivadas em tecido normal tratado com cultura, placas de 96 poços de fundo plano (Figura 1B). Mais importante, as células de cancro da mama epitelial (BT-474) e células não transformadas epiteliais da mama (MCF-10A) foram tratadas e definido da mesma maneira nos dois formatos multi-poços diferentes, minimizando outras variáveis ​​que podem afectar a potência do fármaco. As células foram plaqueadas, tratou-se 48 horas mais tarde com uma concentração final de 5 uM de composto (a partir de oncologia droga aprovado pela biblioteca Colecção do NCI), e testadas quanto ao teor de ATP mais 48 horas mais tarde (Figura 1C). O ponto 48 h tempo após plaqueamento foi escolhido com base no tempo necessário para formar esferóides para atingir compacidade e reprodutível (com base no diâmetro esferóide) em cada poço. A 48 horas ponto de tempo após o tratamento com fármaco foi identificado como sendo o tempo óptimo para observar a morte celular induzida por drogas, como as mudanças de meio adicionar despesa adicional para ensaios HT e incubações mais longas resultou em células não tratadas exibem a morte celular devida ao esgotamento de nutrientes médias e acumulação de resíduos de produtos.

a, um esferóide por poço foi formada em 96 poços placas de fixação de fundo redondo ultra-baixos. micrografias de campo claro de típicos esferóides BT-474 e MCF-10A são mostrados de 48 horas após o plaqueamento,

bar,

200 microns. B, as culturas de monocamada 2D foram criados utilizando o mesmo número de células como nas placas de fundo redondo (3000 células /poço para BT-474 ou 1000 células /poço para MCF-10A) na parte inferior plana, de cultura de tecidos revestidas placas de 96 poços . imagens de fluorescência são mostrados de monocamadas de 48 horas após o plaqueamento, coradas para actina (vermelho) e DNA (azul) típico BT-474 e MCF-10A,

bar

, 200 microns. C, esquemática de design de tela.

Os resultados iniciais deste ecrã prova-de-conceito foram analisados ​​comparando os compostos que produziram um “hit” positiva (definida como a diminuição do conteúdo de ATP em 50% ou mais em comparação com células tratados com veículo) nas células tumorais BT-474 em comparação com as células MCF-10A. Como seria de esperar para os compostos de citotoxicidades conhecidas, a taxa de sucesso era elevada para ambas as linhas celulares, com 29% e 25% de compostos que se verificou ser batidas em células BT-474 e MCF-10A, respectivamente, em 2D, 3D ou ambos condições de cultura. Comparando-se os compostos identificados como remate nas duas linhas de células diferentes em, pelo menos, em uma das condições de cultura, houve poucos compostos que parecem ser selectivos para as células BT-474 sobre as células MCF-10A (dados não mostrados). No entanto, como as condições de cultura 3D são esperados para refletir com mais precisão arquitetura tumor, que incidiu sobre os compostos que foram hits sob ambas as condições de cultura 2D e 3D em células tumorais, mas apenas sob condições de cultura 2D em células normais, sugerindo efeitos preferenciais em células tumorais em culturas 3D. Estes sucessos incluem compostos contra receptores de EGF, tais como gefitinib e lapatinib, e o dasatinib largo espectro de inibidor de cinase molecularmente alvo.

experiências de resposta à dose foram então realizadas para confirmar os resultados do ecrã primário e para identificar os valores de EC50 , a concentração à qual o composto reduz a viabilidade celular em 50%, para os compostos seleccionados de cada tipo de células cultivadas em 2D e 3D (Tabela 1, Figura 2). Nas células MCF-10A, os resultados do rastreio primário foram confirmadas por lapatinib, gefitinib, e dasatinib (Tabela 1, Figura 1A); sob condições 3D, as células MCF-10A foram relativamente insensíveis a estes compostos (EC50 5 uM). As células MCF-10A crescidas como monocamadas em 2D, por sua vez exibiram valores de EC50 5 fiM após o tratamento com lapatinib ou dasatinib. Como no ecrã primário, as células BT-474 demonstrou sensibilidade (EC50 10? M), sob ambas as condições de cultura para estes compostos (Tabela 1, Figura 2A), e, portanto, uma selectividade para as células BT-474 sobre as células MCF-10A observou-se sob condições de cultura 3D, com o valor de EC50 para lapatinib 1 M em células BT-474 e 9,8 uM em células MCF-10A (Tabela 1). Os valores de EC50 calculados para gefitinib e dasatinib foram ligeiramente acima de 5 uM (6-8 uM), que pode ser devido ao diferente fonte de compostos utilizados para os ensaios de resposta à dose confirmativos em relação ao ecrã primário (ADC biblioteca do NCI contra LC Labs; NCI formato de biblioteca permite a utilização composto para rastreio primário, unicamente).

a, as curvas de resposta à concentração foram geradas a partir BT-474 ou as células MCF-10A definidos e tratou-se em triplicado com lapatinib, gefitinib, ou dasatinib como descrito em materiais e Métodos, e percentagem de viabilidade foi calculada a partir das leituras de luminescência que representam o conteúdo de ATP e normalizadas para as células de controlo tratados com veículo. B, as curvas de resposta à concentração foram geradas a partir de células fixadas e tratadas em triplicado com vinblastina ou vinorelbina BT-474 ou células MCF-10A. Todas as curvas são dados representativos de pelo menos duas experiências realizadas em triplicado.

microtúbulos segmentação vinblastina e vinorelbina dos agentes também tinha marcado como “hits” positivos em nossa tela principal, demonstrando ligeira selectividade para as células BT-474 sobre as células MCF-10A sob condições de cultura 3D. Os resultados obtidos com a vinblastina e vinorelbina no ecrã primário não foram prontamente confirmada em estudos de dose-resposta, no entanto (Tabela 1, Figura 2B). Enquanto vinblastina fez mostram uma maior selectividade para as células BT-474, especialmente quando crescidas como culturas em 3D, os valores de EC50 que foram todos observados 5 uM (Tabela 1, Figura 2B, painel da esquerda). Nas experiências de concentração-resposta, vinorelbina foi de facto uma batida nas células BT-474, mas não nas células MCF-10A em cultura em 3D (Tabela 1, Figura 2B, painel da direita). No entanto, em condições de cultura 2D, observou-se valores de EC50 5 mm para ambas as linhas de células, embora não identificamos vinorelbina como um “hit” para as células MCF-10A na tela principal. Para verificar se todas as anomalias são devidas a problemas de permeabilização que também confirmou que pequenas moléculas de corante fluorescente, de tamanho semelhante a muitos medicamentos, na verdade, pode penetrar no núcleo do esferóide (dados não mostrados).

Tomados em conjunto, o nosso estudos demonstram que é possível identificar compostos tumorais selectivos através da aplicação de uma estratégia que utiliza a informação de ambos os ecrãs de citotoxicidade 2D e 3D. Devido ao facto de o nosso estudo de prova de conceito envolve uma biblioteca que consiste de compostos bioactivos conhecidos, as diferenças observadas na sensibilidade entre as células epiteliais normais e cancerosas podem não necessariamente ser suficientemente grande para assegurar que seria útil num cenário de HTS. Uma tela imparcial com um maior biblioteca pequena molécula provavelmente irá produzir resultados diferentes e potencialmente mais informativas. Além disso, e tal como demonstrado pelos nossos estudos de acompanhamento, a HTS tradicionais que testa compostos em uma única operação de concentração pode ser sobrecarregado por falsos positivos e falsos negativos e requer amplos testes de acompanhamento. Um novo paradigma, HTS quantitativos (qHTS), gera curvas de concentração-resposta para os compostos de teste em uma única experiência e provavelmente vai aliviar esses problemas e pode ser um método de escolha para a triagem rápida de compostos anti-cancro novos [19].

modelos de co-cultura de normais vs. células cancerosas apresentam diferentes sensibilidades de drogas em 3D vs. 2D

para melhorar ainda mais sobre os nossos métodos de rastreio, procurou-se determinar se as células cancerosas humanas cultivadas como co 3D culturas a com células tais como fibroblastos e as células endoteliais de suporte pode ser mais útil na identificação de alvo (e, em geral, menos tóxicos) compostos. Colocámos a hipótese de que a co-cultura das células de tumor com fibroblastos e células endoteliais poderiam influenciar o microambiente de cultura a 3D e, portanto, influenciar a sensibilidade ao fármaco. O microambiente do tumor, incluindo factores do estroma, tais como fibroblastos e as células endoteliais, desempenha um papel importante na progressão do tumor e formação de metástases [20]. No tecido normal, as células epiteliais são segregados a partir do estroma por interacção com a membrana basal. Na co-cultura aqui descritos, células BT-474 interagiram directamente com os fibroblastos e células endoteliais, como pode ser observada em cancros da mama avançado, como carcinoma ductal invasivo [6], e estes sistemas de cultura podem, por conseguinte, melhor imitar o microambiente tumoral de cancros avançados . Muitos investigadores utilizar a membrana basal ricos em laminina extraído de Engelbreth-Holm-Swarm rato sarcoma (Matrigel) para promover o crescimento de células em 3D [3], [5] ou em modelos de xenotransplante, mas à custa de este reagente seria proibitivo para uma tela HT e pode potencialmente interferir com certas leituras do ensaio. Assim, o nosso modelo que utiliza fibroblastos humanos e células endoteliais para suportar o crescimento de células epiteliais de tumor em 3D foi desenvolvido como uma alternativa de custo eficaz e prático.

Nós utilizamos o nosso sistema modelo para comparar co-culturas contendo tumoral células de co-culturas sem células tumorais. A linha de células BT-474 foi co-cultivadas em 2D ou 3D (Figura 3A, superior esquerda e direita, respectivamente) com fibroblastos humanos normais e células endoteliais humanas normais (BT-474 + HF + HE). Curiosamente, observou-se que durante a co-cultura em 3D, os tipos de células repetidamente auto-montados em uma estrutura em que as células tumorais BT-474 um núcleo rodeado de os fibroblastos e células endoteliais. Estas células de tumor contendo co-culturas foram comparadas com 2D ou 3D (Figura 3A, esquerda e direita, respectivamente, inferior) co-culturas contendo apenas os fibroblastos humanos normais e células endoteliais (HF + HE). As células endoteliais CD31 positivo apareceu como formações de navios-like nas culturas HF + HE semelhante ao que foi previamente relatado em co-cultura 3D com fibroblastos da pele e HUVECs [21].

A, imagens de imunofluorescência de co-culturas fixadas e coradas 2D (painéis esquerdos) e fixados, seccionados e corados 3D (painéis da direita) corados para o CD31 marcador de células endoteliais (verde), a vimentina proteína rica em fibroblastos (vermelho), e todos os núcleos das células (azul),

bares,

200 microns. As principais a maioria dos painéis são o BT-474 + HF + ele co-culturas, semeados com 1.500 BT-474 + 750 + 750 fibroblastos células endoteliais por poço. Os painéis de fundo são os HF + ele co-culturas, semeado com 750 fibroblastos + 750 células endoteliais. B, esquemático do protocolo de triagem de quatro concentração no BT-474 + HF + HE e células HF + HE cultivadas em 3D ou 2D. C, os valores de Z ‘gerada a partir de uma ou duas placas de 96 poços previstos, incubadas e tratadas como descrito para a tela para o 2D BT-474 + HF + HE células (painel superior esquerdo), células 2D HF + HE (canto superior direito painel), BT-474 3D + HF + HE células (painel inferior esquerdo), as células 3D HF + HE (painel inferior direito).

a tela do BT-474 + HF + HE e culturas HF + HE foi realizada ao longo de quatro concentrações diferentes de biblioteca ADC do NCI, resultando em concentrações finais em poços de 100, 10, 1 e 0,1 uM (Figura 3B). Devido ao grande número de placas de 96 poços necessários para a tela em quatro concentrações diferentes, mais automação foi utilizada do que no ecrã anterior de monotípicos culturas de células MCF-10A e BT-474. Para assegurar que o ensaio foi suficientemente robusto para o rastreio semi-automatizado, os valores de z ‘foram calculadas para ambas as condições de co-cultura em 2D e 3D para quantificar a reprodutibilidade estatística do ensaio com base no meio da máxima e sinais mínimos recebidos em cada poço através de múltiplas placas. Este cálculo padrão é realizada para assegurar que cada poço dá um resultado semelhante (quimioluminescência indicando teor de ATP e, portanto, a viabilidade para esta tela) de tal modo que quando os compostos são adicionados, uma diminuição significativa na quimioluminescência é provável que seja um resultado do efeito dos compostos sobre a viabilidade celular e não apenas a variação entre os poços individuais. Observaram-se valores z ‘superior a 0,7 em todas as condições de co-cultura (Figura 3C), demonstrando assim um excelente desempenho para rastreio de alto rendimento.

Os resultados a partir de tela de co-cultura foram analisados ​​por meio de um de dois abordagem em camadas. Em primeiro lugar, as batidas foram definidos como compostos que produzam 50% de viabilidade em qualquer um dos quatro concentrações testadas, em qualquer das condições de cultura. Com um baixo nível de rigor tal, 57 dos 89 compostos foram encontrados como “hits” no ecrã primário (dados não apresentados); novamente um resultado compreensível com base na natureza da biblioteca. Em segundo lugar, as curvas de resposta à concentração foram geradas para cada composto em cada condição de cultura, e os valores de EC 50 foram atribuídos, onde aplicável. Nós minado os dados de EC50 para identificar compostos que apresentaram maior toxicidade para as co-culturas de células de câncer (BT-474 + HF + HE) do que as co-culturas normais celulares (HF + HE), quando cultivadas em 3D, com a justificativa de que a nossa objectivo a longo prazo é a de utilizar estas culturas para identificar agentes terapêuticos anti-tumorais novos com toxicidade selectiva para o tecido do tumor, enquanto poupam o tecido normal. Doze compostos exibiram uma maior selectividade para a BT-474 3D + HF + HE células do que as células 3D HF + HE (Tabela 2), incluindo, mais uma vez, um número de compostos que têm como alvo receptores de tirosino quinases ou microtúbulos.

Nós, seguido da tela co-cultura primária com um ensaio de concentração-resposta secundária para confirmar os doze sucessos listados na Tabela 2. os compostos foram cherry-colhidos a partir das placas de biblioteca mestre preparados para a tela, e usado para executar experiências de concentração-resposta ao longo do mesmo curso de tempo (48 horas de tratamento). [25].

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