Abstract

Phenethyl isotiocianato (PEITC) é um componente quimiopreventivo do cancro promissor de vegetais crucíferos comestíveis com

in vivo

eficácia contra câncer de próstata em roedores experimentais. Câncer resposta quimiopreventivo para PEITC é caracterizado pela sua capacidade de inibir várias vias de sinalização oncogénicos, incluindo factor nuclear-kB, Akt, e o receptor de androgénio. O presente estudo demonstra, pela primeira vez, que o tratamento PEITC activa a sinalização Notch em maligno, bem como células da próstata humana normal. A exposição de células humanas de cancro da próstata (LNCaP, PC-3, DU145 e) e uma linha celular epitelial humana normal da próstata (PrEC) para PEITC resultou na clivagem (forma activa) de Notch1 e Notch2, e o aumento da actividade transcricional de Notch. Em células LNCaP PC-3 e, o tratamento PEITC causada indução de ligandos Notch Jagged1 e Jagged2 (PC-3), a sobre-expressão de componentes do complexo y-secretase Presenilin1 e Nicastrina (PC-3), o enriquecimento nuclear de clivada Notch2, e /ou para cima Regulamentação do

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, e /ou

Jagged2

mRNA. PEITC apoptose induzida em LNCaP e PC-3 de células foi significativamente atenuado pela interferência de ARN de Notch2, mas não por inibição farmacológica de Notch1. Inibição de PC-3 e LNCaP migração celular resultante da exposição PEITC foi significativamente aumentada por knockdown de proteína Notch2 bem como a inibição da activação farmacológica de Notch1. expressão nuclear da proteína Notch2 clivado foi significativamente maior em PC-3 a partir de xenoenxertos de ratinhos tratados com PEITC e próstatas dorsolateral de ratinhos TRAMP PEITC alimentados em comparação com respectivo controlo. Porque sinalização Notch está implicada na transição epitelial-mesenquimal e metástase, o presente estudo sugere que o efeito anti-metastático de PEITC pode ser aumentada por um regime de combinação envolvendo um inibidor Notch

Citation:. Kim SH, Sehrawat A, Sakao K, Hahm ER, Singh SV (2011) Notch Ativação por Phenethyl isotiocianato Atenua seu efeito inibitório sobre a migração celular do cancro da próstata. PLoS ONE 6 (10): e26615. doi: 10.1371 /journal.pone.0026615

editor: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de julho de 2011; Aceito: 29 de setembro de 2011; Publicação: 24 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta investigação foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer RO1 concessão CA101753-08. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Regras práticas e seguras para a quimioprevenção do câncer de próstata são clinicamente atraente por causa da alta mortalidade associada a esta doença maligna em homens americanos [1]. produtos vegetais, incluindo componentes de frutas e legumes, continuam a atrair a atenção para a descoberta de novos agentes quimiopreventivos do câncer [2]. isotiocianato de fenetilo (PEITC) é um tal agente quimiopreventivo do cancro promissor abundante em vegetais crucíferos comestíveis tais como agrião [3]. Evidência para efeito de proteção de vegetais crucíferos e seus componentes, incluindo PEITC, contra câncer de próstata deriva de estudos observacionais de base populacional, bem como exames de laboratório [3] – [9]. Por exemplo, um estudo de caso-controle de base populacional sugerem uma associação inversa entre a ingestão de vegetais crucíferos eo risco de câncer de próstata [4].

In vivo

quimiopreventivo eficácia de PEITC contra câncer de próstata foi agora estabelecida em um modelo de rato transgénico (Transgenic Adenocarcinoma do modelo de próstata do rato; daqui em diante abreviado como TRAMP) [5], [6]. Alimentação de 3 mol PEITC /g dieta diminuiu significativamente incidência, bem como carga (área afetada) de câncer mal diferenciadas na próstata dorsolateral de ratos TRAMP [6]. resposta quimiopreventivo do cancro para PEITC não se restringe ao cancro da próstata como a inibição da carcinogénese química ou a supressão do desenvolvimento do cancro espontânea de outros locais (

por exemplo

, pulmão, cólon, e do esófago) por esse componente alimentar tem também sido documentada [7] – [9]. Além disso, o crescimento de xenoenxertos de cancro da próstata subcutânea em ratinhos atímicos foi significativamente retardado pela administração de PEITC ou o seu

N

conjugado -acetylcysteine ​​[10] – [12]. Notavelmente, a administração oral PEITC aumentada resposta pró-apoptótica para docetaxel

in vivo

em xenoenxertos de cancro da próstata [13].

Segurança, biodisponibilidade, seletividade para células cancerosas, e capacidade de atingir múltiplos caminhos oncogênicos são desejáveis atributos de um agente quimiopreventivo do câncer clinicamente útil. Research, até agora indica que PEITC atende a todos esses critérios. Em primeiro lugar, PEITC é bem tolerada pelos roedores experimentais [6] – [9]. Em segundo lugar, as determinações farmacocinéticos indicam excelente biodisponibilidade de PEITC [14], [15]. Em terceiro lugar, PEITC também mostra selectividade para as células cancerosas em causar apoptose e autofagia [11], [16], [17]. Finalmente, PEITC é capaz de suprimir a múltiplas vias de sinalização oncogénicas que são hiperactivo em cancro humano da próstata [18], incluindo factor nuclear-kB (NF-kB) [19], Akt [20], transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3 .) [21], e receptor de andrógeno [22]

o presente estudo se estende estas observações [19] – [22] e examina o efeito do tratamento PEITC na activação de Notch1 e Notch2, que pertencem a uma família de receptores transmembranares envolvidos no desenvolvimento e metástase [23] do cancro da próstata, cancro da próstata, utilizando células humanas de cultura (LNCaP, PC-3, LNCaP-C4-2, e DU145), uma linha de células epiteliais de próstata humana normal (PrEC), PC- 3 xenoenxertos de controle e ratos tratados com PEITC [13], [16], e próstata dorsolateral de controlo e ratinhos TRAMP PEITC alimentados [6].

Resultados

PEITC tratamento aumenta os níveis de clivada Notch1 e Notch2 em células de câncer de próstata

activação Ligand-dependente de Notch é clivagem exigindo complexa pela γ-secretase complexo [23], [24]. receptores Notch são activadas por ligação dos seus ligandos adjacentes (

por exemplo

, Jagged1 e Jagged2), que é pensado para induzir uma alteração conformacional no receptor de Notch, resultando numa exposição de um local de clivagem S2 para factor de necrose tumoral-α enzima conversora de [23], [24]. Subsequentemente, os receptores de Notch sofrer outra clivagem mediada pelo complexo γ-secretase num local situado dentro do domínio transmembranar entalhe [24]. resultado líquido deste clivagem é a libertação do domínio intracelular de Notch para o citoplasma, que, em seguida, transloca-se para o núcleo para regular a expressão do gene alvo [23], [24]. Nível de Notch1 proteína clivada foi aumentado por tratamento com PEITC em ambos LNCaP (Fig. 1A) e células PC-3 (Fig. 1B) embora com diferentes cinéticas e intensidade. Pelo contrário, o tratamento PEITC causou um aumento robusto e sustentado do nível de proteína Notch2 clivado em ambos LNCaP (Fig. 1A) e PC-3 linhas de células (Fig. 1B), especialmente no dose de 5 | iM. Com base em dados de interferência de ARN Notch2 mostrado posteriormente, a banda mais baixa no western blot Notch2 mostrado na Fig. 1B é não específico. Efeito do tratamento sobre a expressão da proteína PEITC Jagged1 e Jagged2 foi diferente entre LNCaP e PC-3 células. -Tratada PEITC linha celular LNCaP geralmente exibiram uma diminuição dos níveis de proteínas e Jagged1 Jagged2 (Fig. 1a). Em nítido contraste com LNCaP, transiente (Jagged1) ou sustentada (Jagged2) indução da expressão da proteína Jagged era claramente visível no PC-3 células tratadas com PEITC (Fig. 1B). respostas diferenciadas também foram perceptíveis a respeito efeito do tratamento PEITC em proteínas Presenilin1 e nicastrina entre LNCaP e as células, especialmente no ponto de tempo de 8 horas PC-3.

Immunoblotting para Notch1 clivada, clivada Notch2, Jagged1, Jagged2, Presenilin1 , Nicastrina e utilizando lisados ​​de (A) LNCaP, (B) PC-3, e (C) células de LNCaP-C4-2 após 8-, 16-, ou 24 horas de tratamento com dimetil sulfóxido (DMSO) ou PEITC (2,5 ou 5 uM). Seta no painel B identifica clivado Notch2, a banda inferior é não específica com base em resultados de ARNip mostrados na Fig. 4A. As manchas foram retirados e re-sondadas com anticorpo anti-actina. Imunotransferência para cada proteína foi feita pelo menos duas vezes, utilizando lisados ​​preparados independentemente. Números acima de banda representam mudanças nos níveis de proteína em relação ao correspondente controlo tratado com DMSO.

PC-3 de células linha, que é andrógeno-independentes, é relativamente mais agressivo em comparação com células LNCaP andrógeno-sensível no que diz respeito a proliferação,

in vivo crescimento

no modelo de xenotransplante e migração celular. Questionamos se a resposta diferencial dos LNCaP

contra

PC-3 células para alterações PEITC mediadas em componentes de sinalização Notch estava relacionada com fenótipo independente de androgénios. Nós abordado esta questão usando uma variante independente de andrógeno de células LNCaP (LNCaP-C4-2). Resposta de células LNCaP-C4-2 para alterações PEITC mediada por proteínas de sinalização Notch foi geralmente semelhante ao observado nas células LNCaP parentais (Fig. 1C). Em conjunto, estas observações indicaram que enquanto que as células PC-3 e LNCaP diferencialmente responderam a alterações PEITC mediadas por ligandos no entalhe e complexo γ-secretase, a clivagem das proteínas de Notch1 e Notch2 após exposição PEITC foi consistente em cada linhagem de células testada. Além disso, a transição de células LNCaP ao andrógeno-independência (LNCaP-C4-2) não tem qualquer impacto significativo sobre mudanças PEITC mediadas nos níveis de componentes de sinalização Notch.

PEITC tratamento aumenta a atividade transcricional de Notch

Nós questionaram se a clivagem PEITC mediada de Notch1 e Notch2 traduzido em aumento da atividade transcricional de Notch. Como mostrado na Fig. 2A, o tratamento de LNCaP e, PC-3 de células com 5 uM PEITC resultou num aumento estatisticamente significativo na actividade repórter de luciferase de RBP-Jk (de um modulador a jusante de sinalização de Notch), em comparação com dimetil sulfóxido (DMSO) tenha sido tratada com os controlos. Utilizou-se uma outra linha bem caracterizado resistente à castração humano de células de cancro da próstata (DU145) para determinar o efeito do tratamento PEITC na actividade transcricional de Notch. Como pode ser visto na Fig. 2A, o tratamento PEITC aumento da actividade de luciferase repórter RBP-jk em células DU145 bem. Além disso, as células DU145-tratados PEITC exibiu cinética semelhante de Notch1 e Notch2 clivagem (Fig. 2B), como observado na linha de células PC-3 (Fig. 1B).

(A) Efeito do tratamento no PEITC actividade repórter da luciferase RBP-Jk (uma medida da actividade de transcrição de Notch) em LNCaP, PC-3, as células DU145, e PREC após o tratamento de 8 ou 16 horas com sulfóxido de dimetilo (DMSO) ou 5 uM PEITC. Os resultados apresentados são a média ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (

P

0,05) em comparação com o controlo tratado com DMSO por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett (LNCaP e PC-3) ou de Student t-teste (DU145 e PREC). (B) de imunotransferência para clivado Notch1 e Notch2 clivado usando os lisados ​​de células DU145 e PREC tratadas com DMSO (controlo) ou PEITC (2,5 ou 5 uM) para os períodos de tempo indicados. As manchas foram retirados e re-sondadas com anticorpo anti-actina. Seta no painel B (células DU145) identifica clivado Notch2, a banda inferior é não específica com base em resultados de ARNip mostrados na Fig. 4A. Imunotransferência para cada proteína foi feita pelo menos duas vezes, utilizando lisados ​​preparados independentemente. Os números acima bandas representam mudanças nos níveis de proteína em relação ao correspondente controlo tratado com DMSO. Cada experimento foi repetido pelo menos duas vezes.

Em seguida, utilizou-se uma linha de células epiteliais da próstata humana normal (Prec) para determinar se a ativação PEITC mediada de Notch1 e Notch2 foi exclusivo para células prostáticas cancerígenas. Este foi um objetivo da pesquisa digno considerando as diferenças marcantes foram observados com relação ao efeito da PEITC entre células da próstata cancerosas e normais. Por exemplo, mostrámos previamente que a linha celular PrEC é significativamente resistente à inibição mediada por PEITC de fosforilação oxidativa, a geração de espécies de oxigénio reactivo, e indução de apoptose em comparação com células LNCaP PC-3 e [11], [17]. Além disso, PC-3 e as células PrEC diferencialmente responder a alterações mediadas PEITC na expressão de genes de defesa antioxidantes [25]. Semelhante a células de cancro de próstata (fig. 1), o tratamento PEITC resultou no aumento dos níveis de Notch1 e Notch2 clivado em células PrEC especialmente no ponto de tempo de 16 horas em ambas as 2,5 e 5 uM concentrações (Fig. 2B). Consistente com os resultados, o aumento PEITC mediada na actividade repórter da luciferase RBP-Jk também foi observada em células PrEC após o tratamento de 16 horas com 5 uM PEITC (Fig. 2A). Com base nestes resultados, concluímos que PrEC e as células cancerosas da próstata (PC-3, LNCaP, LNCaP-C4-2, e DU145) se comportam de forma semelhante no que diz respeito à ativação PEITC mediada por Notch.

Efeito da PEITC tratamento sobre os níveis nucleares de clivada Notch2

Uma vez que o efeito do tratamento PEITC foi relativamente mais pronunciada e sustentada na clivagem Notch2 comparação com Notch1 clivada, procedeu-se a determinar os níveis de Notch2 clivada no controle tratados com DMSO e LNCaP tratados PEITC e células PC-3. PEITC-tratada LNCaP e PC-3 de células exibiram um aumento acentuado nos níveis nucleares de Notch2 clivada em comparação com o controlo tratado com DMSO (Fig. 3A). Estes resultados indicaram que o tratamento resultou em PEITC enriquecimento nuclear de Notch2 clivado em células de cancro da próstata, o que é consistente com o aumento observado na actividade transcricional de Notch por tratamento PEITC (Fig. 2A).

(A) Imunofluorescência microscópica imagens que descrevem os níveis de proteínas nucleares Notch2 clivado em LNCaP e PC-3 de células após o tratamento de 8 horas com sulfóxido de dimetilo (DMSO) ou 5 uM PEITC a 100 × ampliação objectivo. A determinação quantitativa de

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, e

Jagged2

níveis de mRNA por real-time RT-PCR em (B) LNCaP e ( C) PC-3 de células após o tratamento de 8 horas com DMSO (controlo) ou PEITC (2,5 ou 5 uM). Os resultados apresentados são a média ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (

P

0,05) em comparação com o controlo tratado com DMSO por ANOVA de uma via com ajuste de Dunnett. Cada experimento foi repetido pelo menos duas vezes.

Efeito do tratamento PEITC em

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, e

Jagged2

níveis de mRNA

os dados para o efeito do tratamento PEITC sobre os níveis de mRNA de

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, e

Jagged2

são mostrados na Fig. 3B (LNCaP) e a Fig. 3C (PC-3). Expressão de

Notch1

(2,5 e 5? M PEITC) e

Jagged1

(5 mM PEITC) mRNA foi significativamente aumentada após tratamento de 8 horas de células LNCaP com PEITC (Fig. 3B). Um tratamento PEITC semelhante resultou na supressão da

Notch2

(5 mM PEITC) e

Jagged2

(5 um PEITC) níveis de mRNA em células LNCaP (Fig. 3b). Por outro lado, PC-3 células tratadas durante 8 horas com 5 mM PEITC exibiram uma indução significativa de

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, e

Jagged2

expressão de ARNm em comparação com o controlo tratado com DMSO (Fig. 3C). indução significativa da

Notch1

,

Jagged1

, e

também foi observada Jagged2

mRNA com 2,5 mM tratamento PEITC em células PC-3 (Fig. 3C). Mais uma vez, estes resultados apontam para diferenças específicas de cada linha celular em alterações PEITC mediadas na expressão de

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, e

Jagged2

mRNA.

RNA de interferência de Notch2 confere protecção contra a apoptose induzida por PEITC

O’Neill et al [26] têm demonstrado anteriormente que a Notch2 regula a apoptose em células MDA-MB-231. Porque o tratamento PEITC consistentemente aumentou os níveis de proteína Notch2 clivado em cada linhagem de células testada, era lógico para determinar se Notch2 contribuiu para a apoptose induzida por PEITC. Como mostrado na Fig. 4A, nível de proteína de Notch2 clivado foi diminuída em cerca de 40-60% após a transfecção transiente de LNCaP e PC-3 de células alvo com um pequeno-Notch2-ARN interferente (siRNA) em comparação com células transfectadas com um controlo (não específica) siRNA. aumento PEITC mediada nos níveis de proteína Notch2 clivado era claramente visível no controlo de LNCaP transfectadas com ARNsi e células PC-3, que foi quase completamente abolido pela interferência de ARN de Notch2 (Fig. 4A). Knockdown de proteína Notch2 sozinho não teve qualquer impacto significativo na libertação de fragmento de ADN associado a histona para o citosol, que é um método bem aceite para a quantificação da apoptose, quer na linha de células (Fig. 4B). Por outro lado, a apoptose induzida por PEITC foi relativamente mais pronunciado em LNCaP e PC-3 transfectadas com o ARNsi de controlo em comparação com as transfectadas com ARNsi Notch2-alvo (Fig. 4B). Estes resultados indicaram que Notch2 knockdown conferiu protecção contra a apoptose induzida por PEITC.

(A) para a proteína de imunotransferência Notch2 clivado utilizando lisados ​​de LNCaP e PC-3 de células transientemente transf ectadas com um controlo (não-específica) ou um ARNsi siRNA e tratados durante 24 horas com sulfóxido de dimetilo (DMSO) ou 5 uM PEITC-alvo Notch2. Os números acima bandas representam mudanças nos níveis de proteínas em relação às células de controlo transfectadas com ARNsi tratados com DMSO. Arrow (PC-3) identifica clivada Notch2, a banda inferior é não-específica. (B) libertação fragmento de ADN associado a histona para o citosol (uma medida da apoptose) em células LNCaP e PC-3 de células transitoriamente transfectadas com um ARNsi de controlo ou um ARNsi e tratou-se durante 24 horas com DMSO (controlo) ou 5 uM alvo-Notch2 PEITC. Os resultados são expressos como o enriquecimento de apoptose em relação às células de controlo transfectadas com ARNsi tratados com DMSO. (C) para imunotransferência clivado Notch1 e clivado proteínas Notch2 utilizando lisados ​​de LNCaP e PC-3 células tratadas durante 8 horas ou 24 horas com DMSO (controlo) ou 5 uM PEITC na ausência ou na presença de 50 uM DAPT. Os números acima bandas representam mudanças nos níveis de proteína em relação ao correspondente controlo tratado com DMSO. (D) Histona-associado libertação fragmento de ADN apoptótico para o citosol em LNCaP e PC-3 células tratadas durante 24 horas com DMSO (controlo) ou 5 uM PEITC na ausência ou na presença de 50 uM DAPT. Os resultados são expressos como o enriquecimento de apoptose em relação ao controlo tratado com DMSO. Resultados (painéis B e D) são a média ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (

P

0,05) entre os grupos indicados por ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. Cada experiência foi repetida duas vezes, e os dados representativos a partir de uma tal experiência são apresentados.

conceberam experiências usando um inibidor farmacológico de γ-secretase {N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-G -alanil)] – éster de S-fenilglicina-t-butilo; daqui em diante abreviado como DAPT} para testar adicionalmente o papel do Notch na apoptose induzida por PEITC. aumento nos níveis de proteína de Notch1 clivado PEITC-mediada, mas não clivada Notch2, foi marcadamente suprimida por co-tratamento com 50 uM DAPT (Fig. 4C). Como esperado, o tratamento DAPT sozinho diminuição dos níveis de clivada Notch1 e Notch2 em ambos LNCaP e células PC-3, embora em graus variáveis ​​(Fig. 4C). apoptose induzida por PEITC quer não foi alterada em todos os (células PC-3) ou ligeiramente aumentada (células LNCaP) por co-tratamento com DAPT (Fig. 4D). Com base nestes resultados, conclui-se que a activação de Notch2, mas não Notch1, contribui para a apoptose induzida por PEITC, pelo menos, em células PC-3.

interferência de ARN de Notch2 aumenta a inibição mediada PEITC da migração de células

por causa de sinalização Notch está implicada na invasão celular e de transição epitelial-mesenquimal (EMT) [27], [28], nós projetamos experimentos funcionais para determinar as consequências da ativação Notch sobre a capacidade da PEITC para inibir células LNCaP e PC-3 migração. transfecção transiente com ARNsi Notch2-alvo isoladamente resultou em supressão de LNCaP (Fig. 5A) e PC-3 (Fig. 5C) a migração de células em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo correspondente, conforme determinado pelo ensaio de câmara de Boyden. Migração de ARNsi de controlo de LNCaP transfectadas (Fig. 5B) e PC-3 de células (Fig. 5D) também foi significativamente reduzida após tratamento com 5 uM PEITC. Além disso, a inibição de LNCaP (Fig. 5B) e PC-3 PEITC-mediada (Fig. 5D) migração celular foi significativamente aumentada por knockdown da proteína Notch2.

Imagens representativas (Boyden câmara de ensaio) que descreve a migração de (a) LNCaP e (C) células PC-3 transfectadas com um controlo (não-específica) ou um ARNsi siRNA e tratados durante 24 horas com sulfóxido de dimetilo (DMSO) ou 5 uM PEITC a 200 × ampliação alvo-Notch2. A determinação quantitativa de (B) células LNCaP migraram e (D) PC-3 de células experiências apresentadas nos painéis A e C. Três a quatro áreas de cada filtro foram marcados por células que migraram sob um microscópio invertido a 200 × ampliação. Os resultados apresentados são a média ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (

P

0,05) entre os grupos indicados por ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. Cada experimento foi repetido duas vezes, e dados representativos de um desses experimentos são mostrados.

supressão farmacológico da activação Notch1 aumenta a inibição PEITC mediada da migração celular

sozinho DAPT causou uma diminuição modesta em LNCaP (Fig. 6A) e PC-3 (Fig. 6C) a migração de células em comparação com o respectivo controlo tratado com DMSO. Similar aos dados usando Notch2 siRNA, o co-tratamento com DAPT aumentada inibição PEITC-mediada de células LNCaP (Fig. 6B) e PC-3 (Fig. 6D) a migração de células. Estes resultados indicaram que a ativação Notch1 e Notch2 por PEITC afeta negativamente sua capacidade de inibir a migração de células de câncer de próstata.

Imagens representativas LNCaP e (C) PC-3 células (Boyden ensaio de câmara) representando migração de (A) após tratamento de 24 horas com sulfóxido de dimetilo (DMSO) ou 5 uM PEITC na ausência ou na presença de 50 uM a 200 × DAPT ampliação. A determinação quantitativa de (B) células LNCaP migraram e (D), as células após tratamento de 24 horas com DMSO ou 5 uM PEITC e /ou 50 fiM DAPT PC-3. Três a quatro campos de cada filtro foram marcados por células que migraram sob um microscópio invertido. Os resultados apresentados são a média ± SD (n = 3). * Significativamente diferente (

P

0,05) entre os grupos indicados por ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. Cada experimento foi repetido duas vezes, e dados representativos de um desses experimentos são mostrados.

A análise imunohistoquímica para o efeito de PEITC na proteína Notch2 clivada

in vivo

Usamos tecidos arquivados a partir de nossos estudos previamente concluídos [6], [13], [16] para determinar

in vivo

relevância dos achados celulares (Fig. 1). Uma vez que o efeito do tratamento foi PEITC mais consistente e sustentado em Notch2 clivado, a análise imuno-histoquímica foi restringido a esta proteína. Imagens imuno-histoquímicos representativos para expressão Notch2 clivado em PC-3 secções de xenoenxerto de tumor de controlo e murganhos tratados com PEITC são mostrados na Fig. 7A. De acordo com os resultados apresentados em células PC-3 cultivadas (Fig. 3A) expressão nuclear de Notch2 clivado foi significativamente maior no PC-3 a partir de xenoenxertos de ratinhos tratados com PEITC comparado com o controlo (Fig. 7A). Da mesma forma, o nível nuclear de proteína Notch2 clivado na próstata dorsolateral era significativamente maior em ratinhos TRAMP em comparação com o controlo (Figura 7B). PEITC-Fed

(A) representativas H . E coloração e coloração imuno-histoquímica para a expressão de proteína Notch2 clivada no PC-3 xenoenxertos de três camundongos dos grupos indicados (barra de escala, 50 mm; ampliação, 400 ×). Amplificação da área selecionada é representada na inserção. A quantificação da expressão da proteína nuclear Notch2 em xenoenxertos PC-3 de controlo e ratinhos tenha sido tratada com isotiocianato de fenetilo (PEITC) é mostrado no gráfico de barras (média ± SD; n = 3). (B) A imuno-histoquímica mostrando clivada expressão da proteína Notch2 nas próstatas dorsolateral de quatro ratinhos TRAMP dos grupos indicados (barra de escala, 50 mm; Ampliação, 400 ×). Amplificação da área selecionada é representada na inserção. A quantificação da expressão da proteína nuclear Notch2 clivado nas próstatas dorsolateral de controlo e ratinhos TRAMP PEITC-alimentado é mostrado no gráfico de barras (média ± SD; n = 4). A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student.

Discussão

papel preciso da sinalização Notch no desenvolvimento do câncer de próstata ainda não está claro, mas estudos têm tentado resolver este problema com o uso linhas celulares de cancro da próstata e as biópsias de cancro da próstata humanos. A sub-regulação de Jagged1 foi demonstrado inibir a proliferação de células de cancro da próstata [29]. O mesmo grupo de investigadores relataram mais tarde que a interferência de RNA de Notch1 conferiu proteção contra a migração de células de câncer de próstata e invasão [30]. Ao mesmo tempo, a sobre-expressão de Notch1 constitutivamente activa também tem sido demonstrado para inibir a proliferação de células LNCaP [31]. Porque a sinalização Notch é bastante complexo que envolve interacção entre quatro receptores (Notch1-Notch4) e cinco ligantes [Jagged1, Jagged2, ligantes Delta-like (DLL1, Dll3 e DLL4)] [23], [24] e cada componente da sinalização Notch não é comumente estudada [29] – [31], é plausível que a discrepância decorre de mudanças compensatórias em outros componentes acionados por knockdown de Notch1 ou Jagged1. No entanto, a expressão Jagged1 em biópsias de câncer de próstata está associado com o aumento da metástase e recorrência [32]. O presente estudo revela que PEITC ativa Notch1 e Notch2 nas células prostáticas cancerosas e normais. Além disso, a administração PEITC provoca aumento significativo nos níveis nucleares de Notch2 clivada

in vivo

em tumores da próstata a partir de dois modelos de roedores diferentes. Também demonstramos que a activação de Notch1 e Notch2 reduz a capacidade do PEITC para inibir a migração de células de cancro da próstata. Com base nestas observações, somos tentados a especular que o efeito anti-metastático de PEITC pode ser aumentada por um regime de combinação envolvendo um inibidor de Notch.

LNCaP e PC-3 células apresentam diferenças notáveis ​​no que diz respeito a PEITC mediada alterações em componentes sinalização Notch, especialmente ligantes Notch e componentes y-secretase. Duas possibilidades óbvias merece atenção para explicar estas diferenças na resposta PEITC entre as células LNCaP andrógeno-sensível (do tipo selvagem p53)

contra

resistente à castração e p53 células PC-3. Uma tal possibilidade refere-se à diferença no estado de p53 entre LNCaP e PC-3 de células de Notch1 como tem sido mostrado para ser um alvo directo de p53 [33]. Restauração da expressão de p53 em linhas celulares de cancro humano foi mostrado para sobre-regular a expressão de Notch1 [33]. Como as células PC-3 e DU145, ambas as quais carecem de p53 funcional, se comportam de forma semelhante no que respeita à activação PEITC-mediada de Notch1 e Notch2, possibilidade de que a resposta diferencial entre células LNCaP e células resistente à castração (PC-3 e DU145) manifesta-se, parcialmente, se não completamente, pelo p53 não pode ser descartado no presente. Ao mesmo tempo, estamos conscientes de que a regulação da expressão, bem como a activação de Notch1 é bastante complexa mediada por outros fatores além da p53, incluindo Nrf2, ETS transcrição PEA3 membro do fator familiar, a sinalização do receptor do factor de crescimento epidérmico, e Akt para citar alguns [34] – [37]. Embora mais estudos são necessários para resolver esta questão em torno p53, é razoável concluir que a resposta diferencial entre LNCaP e as células-3 PC não está relacionado com andrógeno-responsividade porque as células LNCaP e sua andrógeno-independente variante LNCaP-C4-2 exposição resposta geralmente comparáveis ​​às mudanças PEITC mediadas em componentes de sinalização Notch. Neste contexto, é importante mencionar que

Notch

alvo HEY (Hairy /Enhancer de split-relacionada com motivo YRPW) é um receptor de andrógeno co-repressor seletiva [38].

Ativação de Notch2 por sobre-expressão do seu domínio intracelular promove a apoptose em células MDA-MB-231 [26]. Era de interesse para determinar as consequências da ativação Notch na resposta pró-apoptótica para PEITC em nosso modelo. Ao contrário de Notch1 [30], um knockdown 40-60% de proteína Notch2 não tem qualquer impacto significativo sobre a apoptose em células LNCaP ou células PC-3. No entanto, a apoptose resultante da exposição PEITC é significativamente atenuado por Notch2 knockdown, pelo menos, em células PC-3. Por outro lado, a supressão da activação de Notch1 com DAPT não tem qualquer efeito sobre a resposta pró-apoptótica de PEITC. Com base nestes resultados concluímos que Notch1 é dispensável para a morte celular, resultante de exposição PEITC em células LNCaP de PC-3 e. Mecanismo pelo qual Notch2 knockdown confere protecção contra a apoptose induzida por PEITC ainda não está clara. A inibição de várias vias anti-apoptóticas, tais como NF-kB e STAT3, juntamente com alterações na expressão de proteínas da família Bcl-2 tem sido implicado na indução de apoptose por PEITC [10], [11], [17], [19] , [39]. É possível que Notch2 efeito altera knockdown de PEITC em alguns destes caminhos para conferir protecção contra a apoptose.

A metástase é a principal causa de mortalidade por câncer de próstata. Notavelmente, o entalhe tem sido implicada em EMT [27], que promove a metástase [40]. Além disso, o tratamento de LNCaP e células PC-3 com DAPT inibidor γ-secretase tem demonstrado inibir a motilidade das células [41]. O presente estudo revela que a motilidade de ambos LNCaP e PC-3 de células é reduzida significativamente pelo knockdown de proteína Notch2 utilizando siRNA (diminuiu, mas não significativa, em células LNCaP), bem como a inibição DAPT mediada por activação de Notch1 (reduzido, mas não significativa no PC- 3). Além disso a inibição, mediada por PEITC de LNCaP e migração de células PC-3 é ampliado por knockdown de proteína Notch2 bem como a inibição farmacológica de clivagem de Notch1 (PC-3 apenas). Mecanismo pelo qual Notch2 knockdown inibe a migração celular permanece indefinida, mas esta questão tem sido estudada por Notch1 [28]. esgotamento alvo de Notch1 inibe PC-3 e migração celular 22Rυ1 por expressão de regulação para baixo da metaloproteinase-9 e uroquinase do ativador do plasminogênio [28]. É possível que Notch2 knockdown provoca resposta semelhante na matriz metaloproteinase-9 e ativador do plasminogênio uroquinase.

Em conclusão, o presente estudo demonstra que o tratamento PEITC promove a clivagem de Notch1 e Notch2 levando à sua activação da transcrição, tanto cancerosos ( LNCaP, PC-3, DU145 e) e células da próstata normais (PrEC). apoptose induzida por PEITC em células de cancro da próstata é atenuada por modestamente knockdown de Notch2, mas não pela inibição da activação farmacológica de Notch1.