Abstract

Fundo

Wnt5a é uma glicoproteína secretada não-canônico da família Wnt, que desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Estudos anteriores relatam que Wnt5a é regulada positivamente em cancro da próstata e sugeriu que Wnt5a afecta a migração e a invasão de células de tumor da próstata. Este estudo teve como objetivo avaliar o valor prognóstico da expressão da proteína Wnt5a no tecido de câncer de próstata e seu potencial para prever o resultado após a prostatectomia radical em pacientes com câncer de próstata localizado.

Metodologia e Resultados

A análise imuno-histoquímica de um tissue microarray contendo espécimes de próstata de 503 pacientes com câncer de próstata localizado mostrou significativamente maior expressão da proteína Wnt5a em câncer em comparação com núcleos benignos dos mesmos pacientes (p 0,0001). Pacientes com alta expressão da proteína Wnt5a teve resultado significativamente melhor em termos de tempo de recorrência bioquímica em comparação com pacientes com baixos níveis de expressão (IC p = 0,001, 95% 1,361-3,570, razão 2.204 de Hazard). Uma combinação de alta expressão Wnt5a com baixos níveis de Ki-67 ou andrógeno expressão do receptor tinha ainda melhor resultado em comparação com todos os outros grupos. Além disso, verificou-se que a expressão Wnt5a significativamente correlacionada com VEGF e com Ki-67 e receptor de andrógeno expressão, embora não seja muito significativo. In vitro, nós demonstramos que Wnt5a recombinante diminuiu invasão de 22Rv1 e DU145 células e que siRNA knockdown de proteína endógena Wnt5a levou ao aumento da invasão de células 22Rv1 e LNCaP.

Conclusão

Nós demonstramos que preservou superexpressão da proteína Wnt5a em pacientes com câncer de próstata localizado prevê um resultado favorável após a cirurgia. Esta verificação, juntamente com os nossos dados in vitro demonstra a capacidade de Wnt5a para prejudicar as propriedades invasivas das células de cancro da próstata, sugere um efeito supressor do tumor de cancro da próstata em Wnt5a localizada. Estes resultados indicam que Wnt5a pode ser utilizado como um marcador preditivo e que também é um alvo terapêutico plausível para o tratamento de cancro da próstata localizado

citação:. Syed Khaja AS, Helczynski G, Edsjö A, R Ehrnström, Lindgren Um, Ulmert D, et al. (2011) Elevated Nível de Wnt5a proteína no tecido câncer de próstata localizado é associada ao melhor resultado. PLoS ONE 6 (10): e26539. doi: 10.1371 /journal.pone.0026539

editor: Alana L. Welm, Instituto de Câncer Huntsman da Universidade de Utah, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Abril, 2011; Aceito: 28 de setembro de 2011; Publicação: 24 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Syed Khaja et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada pela Fundação Swedish Cancer (AB e TA), o Conselho de Pesquisa sueco (AB e TA), as fundações Söderberg (TA), da Universidade de Malmö fundações Hospital Investigação (AB e AT), Fundação do Câncer do Gunnar Nilsson (AB e AT ) e da União Europeia 6º Programa-Quadro (P-Mark), número Grant LSHC-CT-2004-503011. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: um pedido de patente tem sido apresentado com Anders Bjartell e Tommy Andersson como inventores em que, com base nos resultados apresentados, se propõem a tratar pacientes com câncer de próstata com tumores com uma expressão Wnt5a endógena baixa, com uma substância que reconstitui Wnt5a sinalização nos tumores de próstata de tais pacientes. Esta aplicação não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é o câncer líder afetar homens de todas as raças e o segunda causa mais líder de morte nos países desenvolvidos [1]. Os androgénios e o receptor de androgénio (AR), desempenham papéis críticos não só no desenvolvimento normal, no crescimento e função da glândula da próstata, mas também na carcinogénese e progressão de CaP [2]. Inicialmente, as células CaP são comumente AR dependente para o seu crescimento e sobrevivência, e, portanto, respondem à terapia da privação do andrógeno (ADT), mas em fases posteriores células CaP tornar andrógeno-insensitive, e câncer de próstata resistente à castração fatal (CRPC) desenvolve [3] . Os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela transição para a CRPC são mal compreendidos, no entanto, a alteração mais consistente associada com crescimento resistente à castração em perfis de expressão de gene globais de xenoenxertos de ACP foi um aumento nos níveis de ARNm de AR [4]. O aumento da expressão de AR é considerada como sendo uma característica essencial da CRPC e demonstrou-se como uma consequência de uma mutação ou de amplificação de AR ou por uma expressão aumentada causada por factores de crescimento desregulados ou vários co-reguladores [5]. Embora tenhamos acesso a factores de prognóstico em APC, incluindo Gleason grau, estágio TNM, níveis de status de margem e de PSA no soro cirúrgicas, há uma necessidade urgente de identificar novos biomarcadores, que podem melhorar significativamente, isoladamente ou em combinação de outros biomarcadores, a nossa capacidade de prever o resultado em pacientes APC. Estudos anteriores sugeriram uma possível relação entre vias de sinalização AR e Wnt-β-catenina durante o desenvolvimento e progressão do CaP [6], [7].

Recentemente, a atenção foi atraída para o papel das proteínas Wnt e sinalização Wnt em CaP. O nome vem de Wnt “local de integração MMTV relacionados com sem asas” e foi originalmente sugerido por Nusse e colaboradores em 1991 [8]. proteínas Wnt constituem uma família de glicoproteínas segregadas dezanove que desempenham papéis importantes durante o desenvolvimento e na especificação de destino celular, a migração celular e da polaridade celular [9], [10]. proteínas Wnt podem ser classificados em pelo menos duas subfamílias; Wnts canônicos que promovem a transcrição β-catenina-mediada e não-canônica Wnts. sinalização Wnt ocorrer de forma automática ou parácrina através da ligação de moléculas de Wnt segregados para sete proteínas transmembranares do receptor Frizzled (Fz), na ausência ou na presença de co-receptores, tais como a PRL 5/6 e ROR [10]. Vários componentes de sinalização Wnt também têm sido implicados na génese de cancros humanos; sobreexpressão de Wnt-1 foi observada em adenocarcinoma epitelial mamaria [11] e em várias linhas celulares e tecidos de CaP APC. Wnt-1 expressão positivamente correlacionada com a pontuação de Gleason, β-catenina e com níveis séricos de PSA [12]. Além disso, com base na determinação dos níveis de ARNm Wnt5a em tumores da próstata tem sido sugerido que a expressão anormal do Wnt5a não-canónica está envolvido na CaP [13].

Wnt5a, um dos mais estudados não- canónica Wnts, é uma proteína Wnt essencial na indução e controlar a polaridade de Wnt /célula planar (PCP) e o Wnt /Ca

2+ vias [14], [15]. Além disso, não só Wnt5a tem sido demonstrado para neutralizar a via /β-catenina Wnt, mas também, em contextos específicos, para activar esta via [16]. A possibilidade de Wnt5a para induzir diferentes eventos de sinalização a jusante pode, pelo menos em parte, explicar a presença de relatórios sugerindo uma natureza ambígua de Wnt5a; possuindo quer um supressor de tumor ou um tumor promover função dependendo do contexto e tipo de tumor [16]. Estudos anteriores demonstraram que Wnt5a é regulada negativamente em certas neoplasias malignas, incluindo cancro colorectal (expressão da proteína) [17], neuroblastoma (níveis de mRNA) [18], invasivos carcinomas da mama ductal (expressão da proteína) [19], [20] e leucemias (mRNA níveis) [21], indicando um efeito supressor de tumor de Wnt5a. Interessantemente, outros relatórios têm invés disso, sugeriu um efeito oncogénico de Wnt5a principalmente com base em uma regulação positiva em células de cancro da mama (níveis de mRNA) [22], cancro gástrico (a expressão da proteína) [23], o melanoma (a expressão da proteína) [24], o cancro do pulmão e cancro da próstata (a expressão de ARNm) [13]. a expressão do gene e da proteína aberrante de Wnt5a em APC e possíveis mecanismos moleculares subjacentes foram descritos em relatórios anteriores [13], [25], [26], [27]. Num estudo recente, com base nos estudos de Affymetrix linhas epiteliais da próstata e células de cancro normais, Wang et al mostraram que o aumento da transcrição do gene Wnt5a em ACP era devido a hipometilação; sugerindo que a regulação epigenética da expressão Wnt5a pode ser de importância na progressão CaP [28]. Qualquer conclusão feita a partir de dados de uma análise de Affymetrix sem uma análise simultânea de expressão da proteína Wnt5a é perigoso desde o mRNA Wnt5a tem uma longa não transcrita 3′-região aberta para a regulação de translação. Dados de apoio uma tal regra de translação da expressão da proteína Wnt5a foi relatado anteriormente [19], [29].

Os estudos recentes mostraram aumento dos níveis Wnt5a e proteína em CaP em comparação com tecido benigno [25], [26] . Yamamoto et al demonstrou

in vitro

que knockdown de Wnt5a reduziu as propriedades invasivas do DU145 e sobre-expressão de Wnt5a estimulou invasão de células PC3 [25]. Em contraste, Wang Q e colaboradores demonstraram que Wnt5a recombinante não induziu um aumento da motilidade nas mesmas células PC3 [26]. Além disso, foi demonstrado por imuno-histoquímica (IHC) que a expressão Wnt5a correlacionada com a escala de Gleason ≥8 em 24 pacientes de uma coorte de 98 pacientes com CaP, que tinham sido submetidos a prostatectomia radical. Isso pode indicar que Wnt5a promove agressividade, já que os pacientes com baixos níveis de Wnt5a tinha uma melhor sobrevida livre de recidiva em comparação com pacientes com níveis elevados Wnt5a [25].

relatos conflitantes sobre o papel da Wnt5a na progressão APC e esparsa informações sobre a expressão Wnt5a em relação ao resultado clínico, pediu-nos para investigar a expressão da proteína de Wnt5a em uma grande coorte de base populacional e seu possível papel para prever o resultado após a cirurgia para localizada e (91%) CaP predominantemente de baixo grau. Esta investigação foi complementada com

in vitro

experimentos para explorar as possíveis razões para a capacidade de Wnt5a para agir como um biomarcador preditivo nesta categoria paciente. No presente estudo constatou-se que os níveis de proteína Wnt5a foram upregulated em ACP em comparação com tecido benigno mas descobrimos que o aumento da expressão da proteína Wnt5a teve um efeito positivo sobre o resultado em pacientes APC, como pacientes com altos níveis de proteína Wnt5a tinha um resultado melhor em comparação com pacientes com baixos níveis Wnt5a após prostatectomia radical. Em boa concordância, também descobrimos que essa capacidade de Wnt5a de afetar positivamente a evolução em pacientes CaP pode ser devido à sua capacidade de inibir a invasão de células CaP sem afetar inicialmente a sua proliferação

in vitro

. A adição de Foxy5 (a imitar peptídeo Wnt5a) também diminuiu invasão, mas não proliferação destas células.

Resultados

Avaliação imuno-histoquímica de Wnt5a, AR, Ki-67 e VEGF

a tissue microarray (TMA) construir com núcleos em duplicado de ambos os tecidos benignos e malignos de 503 pacientes (características dos pacientes na Tabela 1) que tinham sido submetidos a prostatectomia radical, foi histoquímica para Wnt5a, AR, Ki-67 e VEGF (Fig. 1A- F). a expressão da proteína Wnt5a foi detectado no compartimento do citoplasma das células epiteliais e, ocasionalmente, em células estromais de ambos cancro e amostras de tecidos benignos. tecidos de cancro da maioria dos pacientes (82%) mostrou uma forte imunocoloração citoplásmica homogénea, ao passo que a maioria dos tecidos benignos (65%) mostraram fracas imunorreacção apoiando que uma sobre-regulação da proteína Wnt5a ocorre em tecido de cancro. Os resultados de classificação manual de intensidades de coloração citoplasmática em células epiteliais malignas e benignas são ilustrados na Fig. 1G-I. foi encontrada a diferença entre as intensidades de coloração Wnt5a em câncer e amostras benignas de ser significativa (p 0,0001) quando pareado de Wilcoxon foi realizada. Em quase 80% dos pacientes que encontramos forte intensidade de coloração Wnt5a (unidade arbitrária de 2 ou 3) em núcleos de cancro, enquanto que apenas 35% dos doentes apresentado forte coloração em amostras de tecido benigno. Mais detalhes sobre os dados de pontuação de Wnt5a, AR, núcleos corados Ki-67 e VEGF são apresentados na Tabela 2.

A B) Os painéis mostram imunomarcações Wnt5a representativas em áreas de tecidos benignos e câncer do mesmo paciente C D) Os painéis mostram imunomarcações AR nuclear de representação em áreas de tecidos benigna e câncer de E F) A imunocoloração VEGF painéis de esboço em áreas de tecidos benignos e cancerosas do mesmo paciente. Todas as inserções nos painéis retratam imagens da área indicada pela seta na imagem maior visto em 15 × ampliação de ampliação (40 vezes). G, H I) Os painéis delinear ilustrações gráficas de Wnt5a, AR e expressões de proteína VEGF nas amostras benignas e câncer em pacientes APC. O bar em cada painel apresenta 100 mm.

coloração do receptor de andrógeno foi predominantemente nuclear como esperado e, em geral, mais intensa no câncer em comparação com amostras de tecido benigno, conforme detalhado na Tabela 2. setenta por cento dos núcleos tumorais foram coradas intensamente em comparação com 53% dos núcleos benignos.

nuclear Ki-67 foi utilizado como um marcador de proliferação (Figura S1A, B, C, D). Havia diferenças significativas na coloração Ki-67 entre o cancro e núcleos benignos, como 14% dos núcleos benignas foram negativos para o Ki-67, ao passo que apenas 5% dos cancros núcleos foram Ki-67 negativo. Em relação à marcação nuclear Ki-67, cerca de 9% dos núcleos de cancro tinham uma coloração marcar mais do que dois, enquanto que o número correspondente para os núcleos benignos foi apenas de 2,5% (Tabela 2).

a expressão de VEGF, tal como um marcador substituto para a angiogénese, foi observada no citoplasma das duas células epiteliais benignas e malignas, com áreas cancerosas que apresentam coloração mais elevado em comparação com benigna. Mais de 73% dos núcleos de câncer mostraram forte imunomarcação VEGF, ao passo que apenas 51% dos núcleos benignos mostrou imuno forte (Tabela 2).

A diferença entre AR, Ki-67 e de coloração VEGF intensidades no cancro contra núcleos benignos foi estatisticamente significativa (p 0,0001). quando Wilcoxon rank sum foi realizada (Tabela 2)

Correlação de expressão tecido Wnt5a com AR, Ki-67 e VEGF

no presente coorte expressão Wnt5a mostrou uma correlação positiva e estatisticamente significativa com a expressão de VEGF (rho de Spearman (ρ) = 0,396, p 0,0001), fraco, mas ainda correlações estatisticamente significativas com expressão AR (ρ = 0,159, p = 0,007) e Ki-67 (ρ = 0,233, p 0,0001) (Tabela 3). A maioria dos pacientes (220/365, 60%) com forte imunocoloração Wnt5a em tecidos de cancro, também apresentaram uma coloração intensa AR (Tabela 4). Uma tendência semelhante foi observada quando Wnt5a e VEGF foram comparados; 65% (219/339) dos núcleos cancerosas exibiram forte coloração tanto para Wnt5a e VEGF. Não foram encontradas diferenças na Wnt5a imunocoloração intensidade quando comparados grupos de pacientes com diferentes escores de Gleason. Entre os pacientes com Gleason patológica marcar até 3 + 4 a expressão da proteína Wnt5a ( “baixo grau”), 81% apresentaram elevação em comparação com 86% dos pacientes com maior pontuação Gleason (dados não mostrados). Da mesma forma, não foi observada correlação entre a coloração Wnt5a e estágio T patológico, estágio T clínica, status da margem cirúrgica ou invasão de vesículas seminais (dados não mostrados).

expressão da proteína Wnt5a e previsão de clínica resultado

em seguida, avaliou-se a expressão da proteína Wnt5a em tecidos de câncer analisados ​​após a prostatectomia radical para CaP localizado poderia prever o resultado clínico, medida pelo tempo de recorrência bioquímica (BCR), utilizando PSA 0,2 ng /mL no sangue amostras com um valor de confirmação como um marcador substituto. a expressão da proteína Wnt5a como ilustrado por IHC foi significativamente mais elevada nas áreas cancerosas em comparação com áreas benignas (Fig. 1, Quadro 2). Curiosamente, quando a curva de Kaplan-Meier foi traçada entre a expressão da proteína Wnt5a e BCR tempo livre, um resultado favorável (p = 0,001) foi evidente para os pacientes com uma expressão de proteína de alta Wnt5a em comparação com pacientes com baixa expressão da proteína Wnt5a (Fig. 2A). Como esperado, a baixa expressão de AR (Figura S2C) e do Ki-67 (Figura S2B) foi associado com êxito enquanto a expressão de VEGF não foi significativamente associada com BCR tempo livre (Figura S2D).

Todos os casos de câncer foram separados em 2 grupos com base nas intensidades de coloração de Wnt5a, Ki-67, AR e VEGF. Os grupos de baixa incluídos tumores com escores 0 ou 1 e os grupos de alto incluídos tumores com pontuação 2 ou 3. A) O painel mostra as curvas de sobrevida plotados entre a expressão alta ou baixa proteína Wnt5a e BCR tempo livre. B) O painel mostra as curvas de sobrevida plotados entre alta ou baixa Wnt5a e expressão de proteínas de alta e baixa Ki-67. Por conseguinte, os tumores foram divididos em 4 grupos seguintes; Wnt5a baixo Ki-67 baixo, Wnt5a baixo Ki-67 elevado, Wnt5a alta Ki-67 baixa e alta Wnt5a Ki-67 alta. C O painel mostra as curvas de sobrevida plotados entre alta ou baixa Wnt5a e expressões altos e baixos de proteína AR. Por conseguinte, os tumores foram divididos em 4 grupos seguintes; Wnt5a baixo AR baixa, Wnt5a baixo AR alto, Wnt5a alta AR baixa e alta Wnt5a AR alta. D) O painel mostra as curvas de sobrevida plotados entre alta ou baixa Wnt5a e expressões altos e baixos de proteína VEGF. Por conseguinte, os tumores foram divididos em 4 grupos seguintes; Wnt5a baixo VEGF baixa, Wnt5a baixo VEGF alta, Wnt5a alta VEGF baixa e alta Wnt5a VEGF alta. Em todos os painéis de expressão elevada de uma proteína é indicado por ↑ ↓ Considerando que indica um baixo nível de expressão. Cada passo nas curvas representam recidiva em CaP. Os dados os valores de p no canto inferior direito dos painéis indicam diferenças significativas no resultado entre o grupo mais favorável e o grupo menos favorável (ver Tabela 4 para obter informações mais detalhadas).

Além disso, nós examinamos se a expressão da proteína Wnt5a também poderia prever o resultado quando combinado com qualquer dos outros biomarcadores de tecido. O melhor modelo de previsão foi obtida quando a expressão da proteína Wnt5a foi combinada tanto com AR ou Ki-67 (Fig 2B, C.), Como pacientes com alta Wnt5a e baixa AR ou baixa expressão do Ki-67 apresentaram melhor sobrevida livre de recidiva (p 0,0001), enquanto os pacientes com baixa expressão Wnt5a e alto AR ou expressão elevada Ki-67 teve o pior resultado após a cirurgia. Pacientes com alta expressão de VEGF Wnt5a e baixa tiveram melhores resultados em comparação com outros grupos (p = 0,003) ou cada marcador sozinho. No entanto, a combinação de alta Wnt5a e baixo VEGF era inferior a quando Wnt5a foi analisado em combinação com AR ou Ki-67, indicando que o VEGF em não tão forte como o Ar ou o Ki-67 para prever o resultado, em combinação com Wnt5a no presente contexto ( A Fig. 2D). Cox análise regressivo, foi utilizado para análises multivariadas e revelou que a expressão Wnt5a, escore de Gleason e estágio T patológica foram fatores independentes que influenciam a sobrevivência livre de recidiva em PCA (Tabela 4).

expressão da proteína Wnt5a e seus efeitos sobre a invasão e proliferação do CaP linhas celulares

Nossos dados mostram que os pacientes com expressão de proteína de alta Wnt5a têm resultado mais favorável em comparação com pacientes com baixa expressão da proteína Wnt5a. Para entender melhor essa expressão da proteína Wnt5a encontrar em linha um SV40 imortalizada humana normal das células epiteliais da próstata (PNT2) e quatro linhas de células CaP diferentes foram examinados. PNT2 células tinha uma expressão baixa da proteína endógena Wnt5a ao passo que houve expressão Wnt5a considerável nas linhas celulares LNCaP e CaP 22Rv1 (Fig. 3A). Estes dados estão de acordo com os nossos achados de expressão da proteína Wnt5a na coorte presentemente analisados ​​do CaP e um estudo recente, também realizado em epiteliais normais da próstata e linhas celulares de CaP [26]. No entanto, as análises das duas linhas de células mais agressivas CaP (PC3 e DU145) revelou muito baixo de expressão de proteína Wnt5a, comparável à da linha normal de células epiteliais da próstata PNT2 (Fig. 3A). Curiosamente, os níveis de proteína Wnt5a combinados com as expressões de proteínas AR nestas linhas celulares (Fig. 3a).

A) Este painel mostra a expressão endógena Wnt5a e AR em cada quatro indicados linhas celulares PCA (LNCaP, 22Rv1 , células DU145 e PC3) e em uma linha de células epiteliais da próstata humana imortalizada (células PNT2). Wnt5a banda de proteína foi identificado por executar rWnt5a em paralelo sobre o mesmo gel. As manchas foram sondado para β-actina como controlo de carga. Os borrões apresentados são representativos de 4 experiências separadas. B) O painel apresenta a invasão relativa de LNCaP, 22Rv1, DU145 e PC3 linhas de células depois de 24 h na ausência ou na presença de rWnt5a (0,4 ug /ml) no ensaio descrito nos Materiais e Métodos. Os resultados são dados como médias ± SEM de 5 experiências separadas. As diferenças na invasão entre as células tratadas só com veículo ou com rWnt5a foram avaliadas para significância estatística (p = 0,0001 para 22Rv1 e p 0,0001 para DU145). C) O painel apresenta a proliferação de células LNCaP, 22Rv1, DU145 e PC3 linhas de células depois de 24 h na ausência ou na presença de rWnt5a (0,4 ug /ml). Os resultados são dados como médias ± SEM de 5 experiências separadas. Não houve diferenças significativas na proliferação entre o controle e as células tratadas rWnt5a. D) O painel representa a invasão relativa de células DU145 e 22Rv1 após 24 h na ausência ou na presença de Foxy5 (100 ^ M) utilizando o mesmo ensaio como no painel B. As diferenças na invasão entre as células tratadas só com veículo ou com Foxy5 eram avaliadas para significância estatística (p = 0,01 para 22Rv1 e p = 0,0003 para DU145). E) O painel representa os efeitos de siRNA knockdown de Wnt5a em LNCaP e 22Rv1. As manchas foram sondado para α-tubulina como controlo de carga. Os borrões apresentados são representativos de 4 experiências separadas. F) O painel apresenta a invasão relativa das células LNCaP e 22Rv1 após o tratamento com Wnt5a SI-ARN (Wnt5a knockdown) ou mexidos siRNA (controlo), no mesmo ensaio anteriormente utilizado no painel B. Os resultados são dados como médias ± SEM de 5 experiências separadas. A diferença de invasão entre mexidos e si-Wnt5a derrubado células foram estatisticamente significantes para ambas as linhas celulares (p 0,0001).

Foram utilizadas as linhas celulares de quatro câncer (LNCaP, 22Rv1, PC3 e DU145 ) para nossos experimentos subsequente invasão. A adição de Wnt5a recombinante (rWnt5a) diminuiu o comportamento invasivo de ambos os 22Rv1 e DU145 células cancerosas (Fig. 3B). Nem o LNCaP nem as células PC3 que responder a rWnt5a com uma mudança em seu comportamento invasivo. O resultado com as células PC3 é de acordo com um relatório publicado recentemente por Wang et al [26], em que as células PC3 não responderam à adição de rWnt5a num ensaio de migração zero ferida. células LNCaP são conhecidos por terem uma actividade muito baixa invasão, e isto pode explicar por que estas células não responder quando rWnt5a foi adicionado. No entanto, quando a expressão Wnt5a em células LNCaP foi derrubado usando SI-ARN (Fig. 3E), houve um aumento significativo no comportamento invasivo das células LNCaP (Fig. 3F). Além disso, Wnt5a knockdown por SI-ARN em células cancerosas 22Rv1 também resultou num aumento da invasão destas células (Fig. 3E e F-A figura S4).

Para descobrir se a diminuição na invasão de 22Rv1 e DU145 linhas de células com a adição de rWnt5a era devido à diminuição da proliferação destas linhas de células, investigou-se a taxa de proliferação em linhas de células APC. A adição de rWnt5a não teve qualquer efeito significativo sobre a proliferação nestas linhas celulares durante as 24 horas utilizadas para o ensaio de invasão (Fig. 3C).

Desde rWnt5a diminuiu a invasão das células 22Rv1 e DU145, ensaio de invasão foi também realizada nestas linhas celulares utilizando Foxy5 que é um derivado de hexa-peptídeo a sequência de aminoácidos da proteína Wnt5a anteriormente e mostrado para inibir a motilidade das células do cancro da mama como rWnt5a [30]. Foxy5 de facto reprimido capacidades invasivas dessas duas linhas celulares de CaP (Fig. 3D), e esta diminuição na invasão não foi causada por proliferação diminuída como Foxy5 não afecta o estado de proliferação nestas linhas de células (ensaio de BrdU, dados não mostrados).

Discussão

para o nosso conhecimento, até aqui apenas um estudo com um número limitado de pacientes tem demonstrado um papel da proteína Wnt5a para prever o resultado clínico em CaP [25]. Este pediu-nos para realizar um estudo sobre a expressão da proteína Wnt5a em uma coorte maior de pacientes CaP bem definidos com doença localizada e baixo grau predominantemente e relacionar os resultados com a expressão de outros biomarcadores de tecido conhecido e mais importante com BCR. O presente estudo envolveu uma série consecutiva de 503 pacientes CaP que haviam sido submetidos a prostatectomia radical durante 1988-2003 no Hospital Universitário de Skåne, Malmö, Suécia, com um tempo médio de seguimento de 41,6 meses (intervalo de 1,51-205,90). Este grupo de pacientes é grande, a população com base, e os pacientes estão bem caracterizados (Tabela 1). No TMA desliza tecidos benignos e malignos do mesmo paciente estão presentes em duplicado. Com base em notas de Gleason materiais paciente foi caracterizado ainda em cancros de baixo grau (escore de Gleason até 3 + 4) e de alta qualidade cânceres (Gleason 4 + 3 ou superior). Quase 89% dos pacientes foram classificados como cancros de baixo grau, o que é de se esperar em um grupo de pacientes com PCA localizada adequados para a prostatectomia radical. Como um controle de nosso material clínico, constatamos que havia uma diferença estatisticamente significativa na evolução clínica entre os pacientes com câncer de alto grau de baixo grau e usando Kaplan-Meier análises de-BCR sobrevida livre (Figura S2A). Além disso o controle do material clínico também revelou que o mesmo era verdade quando proliferação foi estudada por expressão Ki-67, um biomarcador tecido validado em CaP [31]. Pacientes com alta expressão de Ki-67 tinha reduzido o tempo de sobrevida livre de recidiva quando comparados com pacientes com um baixo número de Ki-67 células tumorais expressando (Figura S2B).

No presente estudo TMA foi utilizado um bem caracterizado anticorpo específico para -house Wnt5a como descrito anteriormente em estudos de câncer de mama [20]. Aqui, nós também realizada competição com rWnt5a para confirmar a especificidade do anticorpo em secções de tecido da próstata (Figura S3). A intensidade da coloração diminuiu de anticorpo sozinho para quando se utilizaram anticorpo e rWnt5a e já numa proporção molar de 1:10 encontramos uma redução clara da imunocoloração. Além disso, foi realizado imunocitoquímica (Materiais suplementares e Métodos S1) de Wnt5a em linhas celulares de cancro da próstata (LNCaP, 22Rv1 e DU145) após pré-tratamento com qualquer mexidos ou Wnt5a si-RNA (Figura S4A, B, C, D, E) . Em primeiro lugar, observou-se a coloração citosólica de Wnt5a semelhante à observada no tecido de cancro da próstata e em segundo lugar, a intensidade da imunocoloração Wnt5a diminuiu significativamente nas células SI-ARN tratado Wnt5a comparado com aqueles tratados com mexidos SI-ARN. O tratamento com ARNsi Wnt5a diminuiu o grau de Wnt5a imunocoloração para um nível semelhante ao observado em transferências de Western (Fig. 3E). Análise do nosso TMA mostram claramente que a expressão da proteína Wnt5a foi aumentada em CaP localizada, quando em comparação com o tecido benigno dos mesmos pacientes, um efeito que exibiu uma forte significância estatística (p 0,0001; Fig. 1 A, B L, Tabela 2 ). Estes resultados estão em boa concordância com os resultados recentes obtidos a partir de uma coorte menor [25]. A conclusão que a expressão da proteína clínica Wnt5a está aumentada em tecido localizada CaP em comparação com o tecido normal /benigna, também é suportada pela nossa análise de diferentes linhas de células da próstata humana. Nós claramente observado que a linha de células PNT2, um SV40 imortalizada linha celular derivada de epitélio normal da próstata humana expressam níveis muito baixos de proteína endógena Wnt5a, ao passo que a expressão da proteína Wnt5a foi elevada nas linhas celulares LNCaP e CaP 22Rv1. As linhas de células mais agressivas, PC3 e DU145, tinha uma expressão da proteína muito baixo Wnt5a. Isto está de acordo com o resultado menos favorável observado em tumores de baixo Wnt5. No entanto, no material TMA, Wnt5a não foi regulada negativamente na alta-grade (grau de Gleason 4 + 3) casos APC. Se estes resultados aparentemente contraditórios indicam uma função de grau-relacionado de Wnt5a ou apenas refletem as características individuais dos dois tumores a partir do qual as linhas de células foram derivadas é difícil dizer. Como uma explicação alternativa, o número de alto grau CaP na presente coorte (n = 41) pode ser muito pequeno para detectar uma Wnt5a relacionadas com baixo grau de regulamentação.

Também encontramos aumento da expressão de AR, proteínas de Ki-67 e VEGF no tecido localizada CaP em comparação com tecido benigno (Fig. 1, C-F, H-I, Tabela 2). Para obter uma primeira visão sobre possíveis mecanismos para como funciona Wnt5a em APC, realizamos análises estatísticas de potenciais correlações entre a expressão da proteína Wnt5a e que de AR, Ki-67 e VEGF, todos os três bem sabe estar desregulada em progressiva CaP. Wnt5a significativamente correlacionada com o VEGF, um marcador para a angiogénese, o que indica que Wnt5a pode estar relacionada com o crescimento do tumor (Tabela 3). A este respeito, os nossos dados é um tanto diferente dos reportados das análises de cancro do pulmão de células não pequenas, onde Wnt5a não se correlacionou com a expressão de VEGF no tecido de cancro mas com VEGF no tecido do estroma circundante [32]. Além disso, a expressão no tecido Wnt5a CaP no nosso estudo fracamente mas significativamente associado com a expressão de AR (Tabela 3). análise de expressão proteica por Western blot indicou que os níveis de expressão e Wnt5a AR em uma linha de células epiteliais da próstata e imortalizado 4 linhas de células diferentes CaP combinados uns com os outros, o que indica uma correlação possível entre Wnt5a e AR na PCA (Fig. 3A). Apesar destes dados, foi demonstrado recentemente que Wnt5a inibe a actividade de transcrição em células AR 22Rv1 quando estas células foram transfectadas com um plasmídeo Wnt5a [33]. Finalmente, a expressão da proteína Wnt5a foi fracamente mas significativamente associado com Ki-67 (Tabela 3). Este resultado está de acordo com o relatório sobre o cancro do pulmão de células não pequenas, onde a expressão Wnt5a intratumoral significativamente correlacionada com o índice Ki-67 proliferação [32], mas em contraste com o estudo sobre carcinoma hepatocelular onde Wnt5a tem um efeito supressor de tumor e perda de Wnt5a tem uma forte correlação com alta Ki-67 índice de proliferação [34]. Em conjunto, estes dados indicam que o papel de Wnt5a sinalização na regulação da proliferação de células tumorais é incerto.

Na presente investigação, não encontramos uma correlação entre a expressão da proteína Wnt5a ea pontuação de Gleason, embora este último pode ser o melhor indicador prognóstico disponível de resultados em ACP [35]. No entanto, Gleason pontuação tem suas limitações, devido à variabilidade inter entre os patologistas e, portanto, há uma necessidade de marcadores complementares.