PLOS ONE: Integração do Genoma HPV no colo do útero Cancer

Non-Random

Abstract

integração do DNA do HPV no genoma do hospedeiro é uma característica, mas não uma etapa exclusiva durante a carcinogênese cervical. Ainda é uma questão de debate se a integração viral contribui para o processo de transformação para além de assegurar a expressão constitutiva dos oncogenes virais. Há evidências de montagem para uma distribuição não-aleatória de loci integração e o envolvimento directo de genes relacionados ao câncer celulares. Neste estudo, abordou este tema, estendendo os dados existentes definidas por um 47 HPV16 e HPV18 adicional carcinoma cervical positivo. Nós fornecemos evidência de suporte para pontos de acesso de integração previamente definidos e revelaram um outro conjunto de locais de integração dentro do 3q28 banda citogenética. Além disso, na vizinhança destes pontos de acesso numerosos microARNs (miARNs) são localizados e podem ser influenciadas pelo ADN de HPV integrado. Ao compilar os dados e relatórios publicados 9 genes puderam ser identificados, que foram afetados pela integração HPV pelo menos duas vezes em tumores independentes. Em alguns tumores as transcrições de fusão virai-celulares eram também idênticas no que diz respeito ao dador viral e locais de aceitadores celulares utilizadas. No entanto, os locais de integração exactas são susceptíveis de ser diferente uma vez que nenhum dos locais de integração analisadas até agora se mostraram mais do que uns poucos nucleótidos de homologia entre as sequências virais e hospedeiras. Portanto, a recombinação de DNA envolvendo grandes extensões de homologia ao sítio de integração pode ser descartada. No entanto, é intrigante que por alinhamento de sequências várias regiões do genoma de HPV16 foram encontrados a ter alongamentos altamente homólogas de até 50 nucleótidos para os genes acima mencionados e os pontos de acesso de integração. Uma região comum de homologias com sequências celulares é entre o gene viral E5 e L2 (nucleótidos posições 4100-4240). Especula-se que esta e outras regiões de homologia estão envolvidos no processo de integração. Nossas observações sugerem que o rompimento alvejado, possivelmente, também de genes celulares críticas, pela integração HPV permanece uma questão a ser totalmente resolvido

Citation:. Schmitz M, Driesch C, Jansen L, Runnebaum IB, Dürst M (2012) Integração não aleatória do genoma do HPV no câncer cervical. PLoS ONE 7 (6): e39632. doi: 10.1371 /journal.pone.0039632

editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Faculdade de Medicina, Chile

Recebido: 03 de abril de 2012; Aceito: 24 de maio de 2012; Publicado: 27 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Schmitz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por fundos do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DR780 /3-1) concedidos aos CD e MD. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A infecção persistente com o papilomavírus humano de alto risco (HR-HPV), em particular de HPV16 e 18 é reconhecido como o factor de risco mais elevado para o desenvolvimento de cancro [1] cervical. A maioria das infecções de HPV-RH são ou latente ou permissivo. infecções latentes são mal definida, mas admite-se que o genoma virai é mantida como um epissoma nas basais e parabasais células do epitélio sem induzir alterações fenotípicas óbvias na célula hospedeira. a replicação do vírus em termos de produção de viriões de se limita às células terminalmente diferenciadas das camadas epiteliais e os resultados intermédios e superficiais de um comutador de uma forma latente para uma fase permissiva ou directamente a partir de uma infecção aguda. Normalmente infecções HR-HPV são auto-limitada e resolver dentro de alguns meses. No entanto, em cerca de 10% dos casos, um tipo de transformação de infecção pelo HPV evolui. Este processo de transformação é caracterizada pela desregulação dos oncogenes virais E6 e E7 em células em divisão que, finalmente, resulta em instabilidade cromossómica e a acumulação de mutações. Os mecanismos subjacentes a desregulamentação são múltiplas. A integração do genoma HPV é um passo característico na carcinogénese do colo do útero e o seu aparecimento correlaciona com a progressão de lesões pré-cancerosas (CIN2 /3) para carcinoma invasivo [2], [3], [4], [5], [6]. No entanto, a integração não é obrigatória no presente processo e mostrou ser de HPV de tipo dependente. Vinokurova e colaboradores observaram que HPV16, 18 e 45 foram substancialmente mais frequentemente presente num estado integrado em comparação com os tipos de HPV 31 e 33 [7]. Curiosamente o maior potencial cancerígeno é atribuída ao HPV16 e HPV18 [8].

A perda do gene E2 viral é uma conseqüência comum da integração HPV. Este evento pode conduzir a uma expressão elevada dos oncogenes E6 e E7, devido ao facto de E2 não é mais capaz de reprimir a expressão dos oncogenes virais

em

trans [9], [10]. No entanto, de notar é que, uma análise recente de material de biópsia nenhuma correlação entre os níveis de expressão de transcritos de oncogenes virais e o estado físico do genoma viral foi encontrado [11]. Uma vez que os locais de integração virais transcricionalmente activas até agora analisados ​​em CIN2 /3 ou carcinomas cervicais representam o ponto final de um processo de selecção clonal a interpretação mais pragmática dos dados é que a integração assegura uma expressão constitutiva dos oncogenes virais a um nível necessário para manter o estado transformado da célula. Mais recentemente, vários investigadores também centraram-se na integração pode ter impacto no genoma do hospedeiro. Uma análise sistemática da estrutura do genoma no locus integração revelou alterações estruturais genómicas frequentes nos locais de inserção de HPV em carcinoma cervical [12]. Duas outras publicações fornecem evidências de uma perda funcional completa dos genes supressores de tumor,

ZBTB7C

e

CASZ1

, respectivamente. Em ambos os casos a expressão do gene é impedido devido à mutagénese de inserção em combinação com a perda de heterozigosidade [13], [14]. Embora tais constelações são susceptíveis de ser eventos raros torna-se cada vez mais evidente que a integração do HPV não ocorre totalmente ao acaso. Num estudo anterior podemos mostrar que a maioria dos transcritos de fusão virai-celulares em carcinomas cervicais co-transcrever sequências celulares de genes conhecidos ou previstos. De facto, 17 dos 74 (23%) dos sítios de integração foram localizados dentro das bandas citogenéticas 4q13.3, 8q24.21, 13q22.1 e 17q21.2, em aglomerados que variam de 86 a 900 kb. Os hotspots de integração 8q24.21 e 13q22.1 estão perto de locais frágeis adjacentes. De interesse é que a integração dentro do locus de MYC em 8q24.21 está fortemente correlacionada com altos níveis de

MYC

expressão [15], [16], [17] o que implica

cis

efeitos regulatórios sendo exercida pelo genoma viral.

o fenômeno da integração não-aleatória de DNA HPV é intrigante e não pode ser apenas uma questão de acessibilidade da cromatina em regiões transcricionalmente ativos ou sites frágeis, que são propensas a rupturas de filamentos duplos [18 ], [19], [20]. Para uma melhor compreensão do papel e mecanismos de integração vírus na carcinogénese do colo do útero é mais necessário para reunir dados para fins comparativos. Assim, analisamos as transcrições de fusão viral-celulares de 34 HPV16 positivo e 13 HPV18 carcinomas cervicais positivos. Com base nestes novos dados os hotspots previamente definidos para a integração pôde ser confirmado e estendido em cima. Há também evidências de que numerosos genes são afetados mais de uma vez por integração.

Resultados

Em 47 de 87 tumores HPV16 ou HPV18 positiva analisadas transcrições de fusão viral-celulares poderia ser amplificado. transcrições de fusão foram detectados com maior frequência em tumores positivos para HPV18 (72%) do que em tumores positivos para HPV16 (49%). Os tumores restantes continham apenas genomas virais episs�icas ou DNA HPV integrado que é transcricionalmente silencioso. As sequências celulares das transcrições de fusão foram caracterizados utilizando a ferramenta NCBI megablast humano. Para identificar marcadores de sequências expressas e genes preditos sequências celulares Todos os adicionais foram analisados ​​utilizando o banco de dados Blat UCSC.

cromossômica Atribuição das transcrições de fusão

No total, 23 transcrições de fusão continham sequências de genes conhecidos e 23 continham sequências de genes e ESTs previstos. Em um caso, a sequência de celulares não encontrou nenhum entradas de banco de dados. As transcrições de fusão celulares virais pode ser atribuído a todos os cromossomos, exceto para cromossomo 11, 14, 16, 18 e 20 e estão resumidos na tabela 1. Em um estudo anterior já tínhamos descrito que algumas regiões são mais freqüentemente afetados pela integração do que o outro partes do genoma [21]. Para três desses hotspots agora temos encontrado eventos de integração adicionais: As regiões 8q24.21 e 13q22.1 foram afetados duas vezes e região 4q13.3 foi afetada uma vez. Além disso, três transcrições de fusão foram mapeados para uma região de 600 kb no citogenética 3q28 banda cromossômica e, portanto, representam um novo ponto de acesso para a integração HPV. Figura 1 inclui os dados de Kraus e os colegas e retrata todos os cinco hotspots, o seu tamanho ea proximidade de locais frágeis relacionados e miRNAs

.

Descrito são locais de integração localizados dentro das bandas de citogenética 3q28 (A), 4q13.3 (B), 8q24.21 (C), 13q22.1 (D) e 17q21.2 (e). setas azuis de luz: genes afetados pela integração HPV; setas vermelhas: transcrições de fusão HPV descritos neste trabalho; setas cinzentas: transcrições de fusão HPV descritos por Kraus et al. 2008; setas verdes: sítio frágil; escuras setas azuis: microRNAs

Associação com Sites frágeis e miRNAs

Do loci 47 integração identificados, 10 (21%) ocorreu dentro de um sítio frágil comum (CFS. ) e 6 (13%) em sítios frágeis raras. Além disso, em 15 (32%) casos, os sítios de integração foram flancos locais frágeis a uma distância de 200 kb até 5 Mb. Outros 16 locais de integração não foram associados com os locais frágeis. Além disso, 32 locais de integração foram localizados a uma distância de 3 Mb para miRNAs (tabela 1).

Orientação da ORF dentro Fusão Tanscripts

Vinte e três dos 47 transcrições de fusão continham sequências de genes conhecidos . Em 12 casos, o gene hospedeiro foi orientada na direcção do promotor viral i.e. ambas as sequências virais e humanos foram em orientação com sentido. Em quase todos esses tumores, a sequência virai foi excisado a uma sequência de exão celular (11 de 12 eventos). 23 transcrições de fusão continha previu sequências de genes e 8 foram integrados na orientação sentido. Em 3 casos a orientação não pode ser determinada por causa da inconsistência entre as bases de dados utilizadas (tabela 1).

Genes idênticos são afetado pela integração em diferentes tumores

Ao compilar os dados deste estudo e dados publicados cinco genes e quatro genes previstos puderam ser identificados, que foram afectados pelo menos duas vezes em tumores independentes (Quadro 2). Quatro desses genes estão localizados nos hotspots 3q28 (

LEPREL1

e

TP63

), 8q24.1 (

LOC727677

) e 13q22.1 (

BG182794

). Os outros genes estão localizados em outras partes do genoma. Considerando que os genes

Chr2.3.305.a

,

LEPREL1

,

NT_008046.7

, e

LIPC

foram afectadas duas vezes por integração,

TP63

foi afetada três vezes,

LRP1B

,

LOC727677 Comprar e

BG182794

quatro vezes e

TMEM49

até seis vezes.

Além disso, os genes

NT_008046.7

,

LOC727677

,

BG182794

e

TMEM49

são de interesse particular, pois pelo menos dois tumores abrigam transcrições de fusão celular virais idênticas em relação às áreas doadoras e da emenda aceitador virais usados.

Discussão

integração HPV no genoma do hospedeiro é provável que seja um evento muito frequente, mas não pode ser facilmente detectados se a integração ocorre em uma única célula, sem posterior pressão de seleção clonal. Na maioria dos cancros cervicais há apenas um local de integração HPV transcricionalmente ativa. Há evidências de que estes locais de integração representam eventos precoces clonais que proporcionaram uma vantagem selectiva para a expansão do neoplasma. Devido à sua contribuição para o processo carcinogénico elucidação desses eventos de integração específicos são pertinentes para a compreensão da carcinogénese induzida pelo HPV.

transcrições de fusão viral-celular são marcadores moleculares para os locais de integração transcricionalmente activos e podem ser detectados por um 3` protocolo de RACE (o ensaio APOT) que permite a amplificação por PCR para análise de sequência subsequente. Neste estudo nós identificamos transcrições de fusão virais-celular em 47 carcinomas do colo do útero. Com uma exceção as transcrições de fusão compreendem sequências celulares, tanto de genes conhecidas ou previstas. Isto está em linha com os resultados da análise anterior, e sugere que a integração ocorre principalmente nas regiões transcricionalmente activos [21]. Além disso, em concordância com a literatura 66% dos eventos de integração foram quer dentro (34%) ou adjacente a um sítio frágil (32%) [18], [19], [20], [21]. Também a integração do DNA do HPV perto de miRNAs é evidente. miARNs estão associados com a regulação de processos importantes, tais como o desenvolvimento, a proliferação, a diferenciação e a apoptose [22], e frequentemente são desregulados em células cancerosas [22], [23]. Dos 75 miARNs na vizinhança de locais de integração 19 já têm sido associadas com o cancro (figura 1). Destes miR-34a, miR-191, miR-28, miR-944, miR-31, miR-7-2, miR-9-3, miR-497, miR-195, miR-301a, miR-21, miR-181C, miR-27a, 99a-miR e miR-let7c são expressos em células de cancro do colo do útero [24], [25], [26], [27], [28], [29]; Considerando miR-34a, miR-21, miR-191, miR-9-3, miR-181d, miR-23a, miR-24-2, miR-99a e miR-125b2 são relatados para ser envolvido em outras entidades tumorais [ ,,,0],28], [30], [31], [32].

de nota é que, para um número substancial de transcrições de fusão (11/47) as sequências virais são unidas na orientação de sentido para exões de celulares conhecida genes. Rompimento de um gene por integração HPV, mesmo que isso ocorra dentro de sequências de intrão, é provável que tenha um impacto sobre a expressão do gene e, em casos raros mostrou ter contribuído para a perda completa da função dos genes [13], [14].

um achado importante deste estudo é que ele fornece mais apoio para um agrupamento de locais de integração de HPV em regiões cromossômicas hotspot. Dos 121 tumores analisados ​​(incluindo os dados de Kraus et ai., 2008) 22% dos transcritos de fusão virais alveolar foram atribuídas a um de cinco pontos de acesso (figura 1). Os hotspots variam em tamanho de 150 kb para 995 kb e contêm até 8 locais de integração. Além disso, através da inclusão de dados adicionais publicados 9 genes foram encontrados a ser afectada, pelo menos duas vezes por Integração do HPV, quatro destes genes estão localizados nos pontos de acesso das bandas citogenéticas 3q28, 8q24.21 e 13q22.1 (tabela 2). Esta observação é de particular interesse porque sugere que a integração não está associado apenas com as regiões transcricionalmente ativos e locais frágeis nas proximidades. Especialmente, uma vez em alguns tumores mesmo transcrições de fusão virai-celulares idênticas no que diz respeito ao PROCESSAMENTO-viral celular foram encontrados (tabela 2). No entanto, a sequenciação dos locais de integração no caso de

TMEM49

tinham mostrado que os pontos de interrupção dos dois respectivos tumores são cerca de 17 kb de distância. Além disso, ambos os sítios de integração não mostrou qualquer homologia entre as sequências virais e celulares [14]. recombinação de DNA envolvendo grandes extensões de homologia ao sítio de integração pode pelo menos ser excluídos para o

TMEM49

. Curiosamente alinhamento de sequência dos genes listados na Tabela 2 revelou várias regiões com uma elevada homologia com o genoma de HPV16. A região mais comum de alta homologia entre o gene é viral E5 e L2 (nucleótidos posições 4.100-4.240). Seis das 9 genes afectados pelo menos duas vezes por Integração do HPV mostram um mínimo de 80% de homologia em extensões de até 34 nucleótidos (sequência S1). Além disso, cada um dos genes 9 mostram outras homologias com outras partes do genoma viral. Exemplarmente as posições das regiões homólogas dos genes adjacentes

LEPREL1

e

TP63

com o genoma de HPV16 estão representados na Figura 2. Especula-se que estas regiões podem estar envolvidos no processo de integração. Prevê-se que o genoma virai é amarrada a cromatina por Brd4 que desempenha um papel chave nos eventos funcionais cromossómicas tais como a transcrição, replicação de ADN, reparação e recombinação [33], [34]. Os alongamentos homólogos de ADN podem, em seguida, permitir o emparelhamento de fios parcialmente dissociadas e, assim, contribuir para o evento de recombinação. Homologia de sequência no local de integração em si não necessita ser um pré-requisito. Além deste cenário altamente especulativo é também interessante notar que todos os genes envolvidos são câncer associado genes em diferentes graus. Se prejudicada funcionalmente, eles podem ter desempenhado um papel no processo de selecção clonal. Para os genes previstos

chr2.3.305.a

(N-SCAN),

NT_008046.7

,

LOC727677

(sweeker alias) e

BG182794

não há dados funcionais estão disponíveis. No entanto,

LRP1B

pertence à família do gene do receptor de lipoproteína de baixa densidade e desempenha um papel no processo de endocitose mediada pelo receptor. A perda de homozigotos de

LRP1B

em vários tumores cervicais foi encontrado usando a análise baseada em array Hibridação Genômica Comparativa [35]. Também em outras entidades tumorais, como o câncer de tireóide [36], câncer gástrico [37], o cancro do pulmão [38], [39], [40], [41] e os cancros orais [42], [43] silenciar ou perda de

foi observada LRP1B

. Em termos funcionais

LRP1B

é capaz de inibir a migração celular [44] e a sua perda, assim, pode ser relevante para a invasão e metástase. O segundo gene,

LEPREL1

, codifica uma proteína envolvida na biossíntese do colagénio, dobragem e montagem. Até agora este gene não foi associada com o câncer do colo do útero, mas observou-se a ser silenciados linhas celulares de cancro da mama e em 26% dos cancros da mama analisados ​​[45]. Dois outros genes são

TP63

e

LIPC

.

TP63

, um membro da família das proteínas p53, é um outro gene afectado pela integração. Ele atua como uma proteína supressora de tumor e expressão aberrante foi notado por várias entidades de cancro, incluindo o cancro do colo do útero [46], [47].

LIPC

é uma proteína citoplasmática expresso principalmente no fígado. Ele está envolvido no metabolismo lipidprotein e catalisa a hidrólise de fosfolípidos, mono-, di- e triglicéridos e tioésteres de acil-CoA redutase [48]. Uma ligação directa a carcinogénese não é prontamente aparente, mas num estudo recente observou-se uma completa ausência de expressão em 18% dos carcinomas do colo do útero. Em contraste todos normais cervical epitélios, metaplasia e CIN examinados expressa LIPC [14]. O gene mais freqüentemente afetadas, sendo interrompidos 6 vezes, é

TMEM49

(proteína transmembrana 49), também conhecido como

VMP1

(proteína da membrana do vacúolo 1) localizado no cromossoma 17q23.1. Ele codifica uma proteína da membrana plasmática que é um componente essencial de contactos célula-célula iniciais e formações de junção apertadas [49]. redução da expressão de

TMEM49

foi encontrado para linhas celulares de cancro da mama invasivo e na metástase do câncer de rim [49].

TMEM49

também parece ser particularmente proeminente em termos de desregulamentação dos miRNAs nas proximidades. miR21 está localizado apenas a 676 bp a jusante deste gene e pode, como consequência da integração HPV ser para cima ou para baixo-regulado. Associação de miARN este foi descrito para a cascata de caspase [50] e pode ter como alvo BTG2, um gene com propriedades antiproliferativas [51]. Até agora miR21 mostrou ser regulada positivamente em vários cancros, tais como cancro da mama, pulmão, cólon, pâncreas, próstata, estômago, ovário e útero [28], [31], [32].

Três extensões de homólogos até 50 nucleotídeos são mostrados. O número de partidas de nucleotídeos exatas é dado entre parênteses (ver também Sequências S1). O loop de DNA entre os dois homologias localizados em

LEPREL1

compreende 102.689 nucleotídeos; o segundo laço 269.968 nucleótidos. pontos cinzentos referem-se à localização aproximada dos correspondentes transcrições de fusão viral-celulares detectadas em tumores D3829, T2107 e T4335 (da esquerda para a direita).

Ao caracterizar um número crescente de locais de integração HPV transcricionalmente ativos tornou-se evidente que a integração não é um evento totalmente aleatória, mas também envolve sítios cromossômicos preferenciais. Em casos individuais, isso pode prejudicar a função do gene e promover a progressão maligna. Presentemente, só podemos especular sobre os mecanismos que contribuem para este fenómeno.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

Neste estudo, 69 HPV16 e HPV18 18 biópsias positivas de colo do útero pacientes de carcinoma foram rastreados para a integração do HPV pelo ensaio APOT. Para HPV genotipagem de um multiplex em tempo real com base Taqman foi usada ensaio de PCR [52]. Todas as biópsias foram retirados de pacientes atendidos no Departamento de Ginecologia da Friedrich-Schiller-Universität, Jena, Alemanha, entre 1995 e 2008. Todos os tumores foram histologicamente classificados como carcinomas de células escamosas.

isolamento do ácido nucleico

o ARN total foi isolado utilizando o Kit de NucleoSpin ARN II (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) de acordo com o protocolo para isolamento de RNA a partir de tecidos. As amostras foram homogeneizadas através da utilização de agulhas de injecção com um diâmetro de 0,55 mm. O DNA foi removido em todas as amostras por tratamento com DNase durante 15 min (RT). ADNase foi fornecido com o Kit de NucleoSpin ARN II. O ARN total foi eluída em 60 ul de água isenta de ARNase e guardados a -80 ° C para posterior análise.

Transcrição Reversa

O ARN total (300-500 ng) foi transcritos de modo inverso utilizando 200 unidades de Superscript II de transcriptase reversa (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) e um iniciador oligo (dT), acoplado a uma sequência de ligante (5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA TC

(30) VN-3 ” ), referido como CDS-Primer (Clontech, Heidelberg, Alemanha). A reacção foi incubada durante 70 min a 42 ° C num volume final de 20 uL de acordo com o protocolo do kit Superscript II. 40 unidades de RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) foram adicionados para inibir a actividade de ARNase.

A amplificação de Papilomavírus Oncogene Transcrição (APOT) Ensaio

transcrições de fusão derivadas de HPV foram amplificados usando o ensaio APOT [6]. Ele baseia-se numa amplificação de 3′-rápida de extremidades de ADNc (RACE) realizados num formato de PCR aninhada. primers HPV E7 são utilizados como iniciadores para a frente (HPV16: primeiro iniciador: CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT, segundo iniciador: CCT TTT GTT GCA AGT GTG ACT CTA CG; HPV18: primeiro iniciador: TAG AAA GCT CAG CAG ACG ACC, segundo iniciador :. ACG ACC TTC CAT GAG TCC AGC AG) e um iniciador adaptador complementar da sequência ligante do iniciador em CDS como primeiro iniciador de sentido reverso e o iniciador CDS como segundo iniciador aninhado

o ensaio APOT foi feito como anteriormente descrito [6] com ligeiras modificações no que diz respeito ao iniciador usado. O iniciador inverso para a primeira PCR compreende a sequência 5′-CAG TGG AAG TAA CAA CGC A-3 ‘a nested PCR, iniciador a sequência 5′-CAG TGG AAG TAA CAA CGC AGA GTA TC-3’. A mistura reaccional, contendo Tris-HCl a 20, KCl 50 mM, MgCl 1,5 mM

2, 200 uM de dNTP, 250 nM de iniciadores cada, e 0,75 unidades de polimerase Taq recombinante (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA), foi submetido a um passo inicial de desnaturação durante 5 min a 94 ° C, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 segundos, hibridação do iniciador durante 30 segundos e alongamento a 72 ° C durante 2 min. Para HPV 16, as temperaturas de recozimento de 61 ° C e 66 ° C durante a primeira e a segunda PCR, respectivamente, foram utilizados; para HPV18, 61 ° C e 68 ° C. A reacção foi terminada por um passo de alongamento final a 72 ° C durante 6 min. Dois microlitros da primeira PCR foi utilizado como modelo para o passo de PCR aninhada. Ambas as reacções foram realizadas num volume de 25 microlitros. Os produtos de amplificação foram visualizados por electroforese em gel de agarose a 1%. Os produtos que são diferentes em tamanho do transcrito principal viral (E6 * 1-E7-E1

VE4-E5) são indicativos de transcrições de fusão virai-celulares. O ensaio APOT tem várias limitações. Um tumor no qual o genoma do HPV integrado é transcricionalmente silencioso não irá revelar o transcrito de fusão viral-celular característico e irá, portanto, ser classificados como negativos para a integração. Além disso, o ensaio pode não detectar transcritos de fusão virai-celulares na presença de um excesso de transcritos derivados dos genomas de HPV epissomais. Finalmente, um tumor em que o genoma de HPV integrado persistir na forma de um concatemer os transcritos virais podem não compreender sequências celulares e, por conseguinte, não podem ser diferenciados a partir de transcritos derivados de episome. Em geral, o ensaio subestima o número de tumores com DNA HPV integrado.

Análises de sequência

transcrições de fusão Viral-celulares foram excisadas do gel e extraído utilizando o Kit Zymoclean Recovery Gel DNA (AnalytikJena, Jena , Alemanha). Os produtos isolados foram sequenciados (Seqlab, Göttingen, Alemanha) e o locus de integração foi determinada por alinhamentos de banco de dados usando Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) ferramenta Megablast humana e da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (USCS) navegador genoma.

PCR

Para amostras selecionadas (n = 13) a existência de transcrições de fusão viral-celulares foi verificada por PCR usando primers específicos de integração virais e celulares. A amplificação por PCR foi realizada num volume final de 25 microlitros contendo Tris-HCl a 20, MgCl 3 mM de

2, KCl 50 mM, 200 uM de dNTP, iniciador e 400 nM de cada 1.5U Platinum Taq ADN polimerase (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA). As reacções de PCR foram realizadas com um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 10 min, seguido por 45 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 15 seg, emparelhamento a 58-60 ° C (dependendo do par de iniciadores usado) durante 20 seg e elongação a 72 ° C durante 30 segundos.

Em análises Silico

para o mapeamento cromossómico das transcrições de fusão viral-celulares e relacionar a integração HPV aos locais frágeis e miRNAs, da Universidade da Califórnia, foram usados ​​Santa Cruz (UCSC) navegador genoma (hg19) eo Map Viewer (Build 37.3) do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI). Todas as sequências de miRNA conhecidos estão listados no Registro miRNA “miRBase” (http://www.mirbase.org/) com 1527 registros (liberar 18) para homo sapiens.

Investigação de Integração Loci Frequency

Para determinar a frequência de integração HPV em genes e pontos de acesso específicos, dados publicados pela Dall 2008, Ferber 2003, Kraus 2008, Matovina 2009, Peter 2006, Thorland 2003, Wentzensen 2002 e 2004 e Ziegert [3], [15 2003 ], [17], [19], [20], [21], [53], [54], [55] foram incluídos.

Informações de Apoio

Sequências S1. Os alinhamentos de sequências de regiões homólogas

.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039632.s001

(DOC)

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