Abstract

incompatibilidade de cânceres colorretais reparação deficiente instabilidade generalizada (CRC) exibição em sequências de DNA microssatélites (MSI). Embora MSI tem sido relatada como ocorrendo frequentemente em repetições codificam, levando a alterações na função de um número de genes que codificam proteínas relacionadas com o cancro, nada é conhecido acerca do impacto putativo deste processo em microARNs não-codificantes. Em miRBase V15, foram identificados muito poucos genes microRNA humanos com mono- ou di-repetições de nucleotídeos (

N

= 27). Uma análise mutacional destas sequências em uma grande série de linhas celulares de CRC MSI e tumores primários em 15 sublinhada a instabilidade dos genes estudados 24 microRNA com sucesso a frequências variáveis ​​que variam de 2,5% a 100%. Seguindo um método da máxima probabilidade estatística, os genes microRNA foram separados em dois grupos que diferem significativamente nas suas frequências de mutação e na sua tendência para representar mutações que podem ou não estar sob pressões selectivas durante MSI progressão tumoral. O primeiro grupo incluiu 21 genes que apresentaram nenhuma ou poucas mutações no CRC. O segundo grupo continha três genes, ou seja,

HSA-mir-1273c

,

HSA-mir-1303 Comprar e

HSA-mir-567

, com frequentes (≥80 %) e, por vezes, bi-alélicos mutações em tumores de MSI. Para o único expresso em tecidos do cólon,

HSA-mir-1303

, nenhuma ligação direta foi encontrada entre a presença ou não de mono ou alterações bi-alélicas e os níveis de expressão madura miR em linhas celulares MSI , como determinado por sequenciação e de PCR quantitativa, respectivamente. No geral, nossos resultados fornecem evidências de que repete DNA contido em miRNA genes humanos são relativamente raras e preservadas de mutações devido a MSI em células cancerosas MMR-deficientes. Estudos funcionais são agora obrigados a concluir se miRNAs mutado, e especialmente o miR-1303, pode ter um papel na MSI tumorigênese

Citation:. El-Murr N, Abidi Z, Wanherdrick K, Svrcek M, Gaub MP , Fléjou JF, et ai. (2012)

Mirna

Genes constituem novas metas para microssatélites Instabilidade no câncer colorretal. PLoS ONE 7 (2): e31862. doi: 10.1371 /journal.pone.0031862

editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República da Coreia

Recebido: 18 de novembro de 2011; Aceito: 13 de janeiro de 2012; Publicação: 14 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 SR-Murr et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. N El -Murr é um destinatário de uma LNCC (Cancer Ligue Nationale Contre le) comunhão. Este trabalho foi apoiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Durante a última década, os genes microARN (miARN) têm sido extensivamente identificados em mamíferos, plantas e vírus. Eles codificam moléculas curtas (± 22 nucleótidos) de cadeia simples (RNA maduro MIRs) que regulam a expressão do gene na maior parte por emparelhamento de bases com a extremidade 3 ‘UTR do mRNA alvo [1], [2]. Nos seres humanos, estima-se que mais de mil miRs controlar a expressão de cerca de 60% dos genes codificadores de proteínas. Numerosos estudos funcionais têm relatado a participação de miRs em vários processos celulares, e subsequentemente, a sua desregulação em uma série de doenças humanas incluindo o cancro [2], [3]. genes miRNA pode ser localizado dentro íntrons e menos frequentemente dentro de exons ou regiões intergênicas, sua expressão a ser regulada por promotores de genes independentes ou de acolhimento [4]. Exceptuando os genes de miARN que derivam inteiramente dos intrões splicing fora de ARNm do hospedeiro (mirtrons chamadas [5]), cada gene microARN produz três tipos de moléculas que serão submetidas a clivagens sucessivas por dois ARNases, chamado Drosha e Dicer, para se obter o miR totalmente funcional: um grande transcrito primário (pri-mir, -500 a 3000 bases), um precursor intermediário gancho de cabelo do tipo (pré-mir, -60 a 80 bases), e um duplex de miARN transiente a partir do qual dois miRs maduras diferentes são normalmente produzidas em diferentes (major miR /menor miR *) ou equivalente (miR-5p /miR-3p) montantes [5], [6]. Cada etapa de maturação depende fortemente de características estruturais cruciais que ditam a biogênese correta e confiável do miRNA maduro. Tamanho e de sequência de variações em várias regiões do hairpin miARN (segmento basal, caule, miARN duplex e circular) pode provocar a desregulação de miR biogénese e acredita-se ter consequências tumorigénicas [7], [8], [9], [10 ], [11], [12].

Vários mecanismos genéticos e ambientais que levam à alteração da expressão e função de miR têm sido descritos em tumores humanos, incluindo o cancro colo-rectal (CRC) [13], [14 ], [15]. A metilação do

miRNA-34b /c

ilhas CpG, por exemplo, tem sido freqüentemente observada em linhas celulares de CRC e tumores primários [16], e um aumento da expressão de miR-17-92 cluster foi observado em conjunção com uma instabilidade cromossomal (CIN) na banda de cromossoma 13q31 contendo este

miARN

locus de [17]. Importante, CIN também chamado MSS (estabilidade de microssatélites) caracteriza a principal subconjunto de CRC (que representa 80-85% de todos os CRCs). instabilidade microssatélite (MSI), por outro lado, uma particularidade que resulta de uma deficiência de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN (MMR), foi reportado nos restantes 15-20% de CRCs [18]. Em MSI CRC, o que geralmente não apresenta CIN, a progressão do tumor é pensado para resultar nomeadamente a partir do acúmulo de eventos secundários de mutação (deleção /inserção) microssatélites que afetam, sequências repetidas de motivos de ADN curta (1-6 pb), contidos em Câncer genes relacionados [19], [20]. Estas mutações afetam genes alvo envolvidos em várias vias biológicas, tais como a regulação do ciclo celular e /ou a proliferação celular (

TGFBR2, IGF2R, TCF4, AXIN2, PTEN, RIZ

…), a regulação da apoptose (

BAX, CASP5, BCL10, APAF1, FAS …

) ou a sinalização de danos no DNA e vias de reparação (

RAD50, BLM, MSH3, MSH6, MBD4, MLH3, CHK1, ATR …

). Na maioria dos genes alvo, mutações de mudança de quadro foram observadas em repetições ex�icas, na maioria das vezes mononucleótido intervalos, levando à produção de proteínas truncadas. Mais raramente, mutações somáticas no repete mononucleotídicos intrônicas de genes alvo MSI (

MRE11

e

HSP110

) foram mostrados para levar a splicing aberrante e para a geração de proteínas alteradas [21], [22 ].

neste estudo, nós investigamos, pela primeira vez se os genes de miRNA, independentemente da sua localização genómica, pode constituir novos alvos da MSI no CRC. Todos os genes humanos de miARN contendo mononucleótido (RNM) ou repetições dinucleotídicas (DNR) (≥7 repete) nas suas sequências de gancho de cabelo foram rastreados para mutações (nucleótidos adições /supressões) utilizando uma grande série de linhas celulares de CRC MMR-deficiente e tumores primários, como bem como linhas de linfoblastóides celulares (LBLs) e controles MSS CRC permitem a avaliação do estado polimórfico destas sequências.

Resultados

Triagem de repetições microssatélites em grampos miRNA e determinação do seu polimorfismo no MMR linhas celulares -proficient

Entre as 940 sequências de miARN humanos constantes miRBase V15, 24 contêm MNR com, pelo menos, sete unidades de repetição (2,5%) (Tabela 1). DNR (≥ 7 repetições) são mais raramente encontrados em sequências de miRNA (3/940, 0,3%) (Tabela 1). Estes genes de miARN são distribuídos em vários cromossomas. A maioria é encontrada nos genes que codificam proteínas (22/27, 81,5%), principalmente dentro das sequências intrónicas (21/22, 95,5%). sequências repetidas variam em tamanho e pode chegar a até 18 repetições. Mais de dois terços de MNR (17/24; 71%) são pequenos (7-8 pb) e A /T rica (16/24; 67%). Eles abrangem muitas regiões do precursor de gancho de cabelo (Figura 1) considerada importante para miR maturação e /ou função. Essas regiões consistem em segmentos basais, o tronco, o duplex miRNA eo loop terminal de [7], [8], [9], [10]. Dois miRNAs (

HSA Restaurant –

mir-511-1

e

HSA Restaurant –

mir-511-2

) são duplicados do mesmo gene e exibir uma sequência única indistinguíveis em nossa análise. Exceto

HSA Restaurant –

mir-1234 Comprar e

HSA Restaurant –

mir-3166

, todos os genes de miRNA foram amplificados com sucesso usando um conjunto de primers fluorescentes fronteira a sequência de gancho de cabelo. miRNA genes foram analisados ​​pela primeira vez em indivíduos saudáveis ​​(LBLs,

n

= 40) para uma avaliação do polimorfismo inerente (Tabela 2). Fora de 21 MNR analisados ​​em amostras de DNA normais, foi mostrado que a maioria (17 genes) para ser monomórfica (Tabela 2). polimorfismo de comprimento (1 turno pb) no

HSA-mir-1303

foi observado com os alelos menores com a maior frequência de alelos (Tabela S1, Figura S1). polimorfismos de nucleotídeo único (SNP)

rs33982250

e

rs34889453

, ambos correspondendo a uma eliminação Adenina, são relatados por

HSA-mir-1303 Comprar e estão localizados fora do MNR [ ,,,0],23]. alelos raros com turnos de até 3-BP também foram identificados em

HSA-mir-511

,

HSA-mir-543 Comprar e

HSA-mir-1302-7

genes (Tabela S1, S1 Figura). Resultados semelhantes foram obtidos em uma série de 25 tumores colorretais MSS primárias e 13 linhas de células MSS CRC (Tabela S1).

O segmento basal (BS, single-stranded RNA), caule (S, RNA de cadeia dupla ) e do terminal de loop (L) são designados. O duplex (D, contendo um ou dois potenciais miRs) é considerado como uma entidade diferente e, por conseguinte, distinto da região de haste. Regiões do hairpin cobertos por MNRs ou DNRS estão marcados para cada miRNAs. À esquerda do esquema são miRNA genes cuja sequência se repete sobrepor duas regiões.

Genes

Mirna com DNR parecia ser altamente polimórficos (Tabela 2). Dois dos 3 genes exibidos vários alelos com importantes variações de comprimento: 6 e 15 alelos encontrados, respectivamente, para

HSA-mir-620

e

HSA-mir-558

em indivíduos saudáveis ​​(Tabela S1, Figura S1). Aqui, polimorfismos de comprimento foram relatados para ser localizada dentro das repetições microssatélites [23].

A análise da mutação de genes miRNA com MNR e DNR

A instabilidade de todas as repetições de miRNA foi investigado em uma série de 41 CRCs MSI primárias e 14 linhas de células MSI CRC (Tabela 2). Primária MSS CRCs (

n

= 25) e MSS CRC linhas de células (

n

= 13) são usados ​​como controles. Com muito poucas excepções, os controles MSS não apresentaram alterações de tamanho em qualquer das repetições de miRNA (3/557 e 3/304 eventos de mutação em tumores primários e linhas celulares, respectivamente), enquanto 135/913 e 50/326 eventos de mutação foram observado em tumores primários MSI (

p

= 2,2 × 10

-16) e linhas celulares (

p

= 2,28 × 10

-10), respectivamente. Análise de DNR mostrou que 2 miRNAs com 7 (

HSA-mir-1277

) e 11 repetições (

HSA-mir-620

) mantiveram-se inalterados em amostras MSI.

HSA-mir-558

com 18 repetições apareceu mutado em um terço das linhas MSI celulares (13/04; 30,8%) e MSI CRCs. (12/38; 31,6%) (Tabela 2)

estudos estatísticos foram realizados em miRNAs com MNR por causa de sua maior número (

n

= 21). Com base nos dados reportados na Tabela 2, que mostram que a maioria dos genes de miARN são raramente (21/03 com taxa de mutação ≤15%) ou não alterada (14/21, 66%) em linhas celulares de CRC MSI, ao passo que muito poucas genes (4/21; 19%) são encontrados para ser significativamente mutado. Resultados semelhantes foram obtidos em MSI CRCs (Tabela 2). No entanto, as alterações foram menos freqüentemente encontradas em tumores MSI comparação com linhas celulares, uma observação de acordo com o que é relatado para genes com MNRs de codificação [24]. Além disso, observou-se uma correlação significativa entre o tamanho do miRNA MNRs ea frequência de mutação em tumores MSI (

p 0,001

, r = 0,76) (Figura 2). Essa correlação já foi observado para muitas sequências microssatélites independentemente de suas localizações genômicas (intergênico, codificação /exônico, codificação /5 ‘3’ não traduzidas MNRs e intrônicas) (Figura S2).

Observe a correlação altamente significativa observada.

miRNA genes com MNR segregar em diferentes grupos

Usando um método de máxima probabilidade estatística, como descrito anteriormente (ver Materiais e Métodos e [24]), foram identificados dois grupos distintos de miRNA genes contendo MNR que diferiam em sua mutabilidade em tumores primários MSI (Figura 3). Resumidamente, o teste considera que todos os genes pertencem a um grupo de frequência e opõe-se a esta configuração a hipótese alternativa de dois grupos mutuamente exclusivos de frequências. A razão de verossimilhança calcula as chances de cada hipótese e dá mais “provável” de ocorrer. O primeiro grupo maior, compreende os genes de miARN encontrados para não ser muito ou não mutado em tumores MSI (18/21; 86%). O segundo grupo continha 3 genes de miRNA (

HSA-mir-1273c

,

HSA-mir-567 Comprar e

HSA-mir-1303

) frequentemente mutado no MSI CRCs ( ≥75%). Grupos semelhantes foram definidos em linhas celulares MSI CRC (Figura S3).

Dois grupos distintos de miRNAs com MNR são estabelecidos com base em suas frequências de mutação em tumores primários MSI. O valor de cut-off é calculada pela relação de probabilidade método estatístico e é marcada por uma linha vertical tracejada. Note-se que

HSA-mir-644

está incluído no grupo de miRNAs raramente ou não mutado na MSI CRCs (

n

= 18, a frequência da mutação 25%), enquanto que

HSA-mir-1273c

,

HSA-mir-567

e

HSA-mir-1303

constituem o grupo de miRNAs freqüentemente alterada (

n

= 3, frequência de mutação 75%)

Caracterização das alterações e seu impacto na expressão miRNA madura

a nossa análise permitiu a identificação de 3 miRNAs MSI-alvo:.

HSA -mir-1273c, HSA-mir-567 e

HSA-mir-1303. Para estes genes, a grande maioria das linhas celulares apresentou MSI até 3 deleções pb (Figura 4, Tabela S2), e raramente uma adição de nucleótidos (Tabela S2). Uma mutação bi-alélico também foi observado em 36%, 57% e 83% de linhas celulares alterados MSI CRC para miR-1273c, miR-567 ou miR-1303, respectivamente (Figura 4, Tabela S2). Alterações similares foram encontrados em tumores primários MSI com a excepção de

HSA-mir-1273c

, que geralmente exibiram níveis menores de alterações nos tumores (apenas 1 pb-supressão) (Figura 4, Tabela S2). No que respeita à polimórfica

HSA-mir-1303

gene, cujo alelo principal exibe um A-supressão (Tabela S1), o precursor hairpin foi sequenciado em cada linha de células MSI CRC para determinar a extensão real da eliminação. Como LBL e linhas celulares MSS (Tabela S1), linhas celulares de MSI parecia ser homozigótica (50%; Dela /Dela) ou heterozigótica (50%, Dela /A) para o alelo “DELA”. A relevância do “Dela” SNP em

HSA-mir-1303

é mostrado na Figura 5A, que ilustra as mudanças no circuito do terminal das estruturas hairpin mir-1303. A dimensão da malha contendo o microssatélite diminui quando as alterações se tornam maiores e sempre que a estrutura em gancho contém a A-adição de SNP (Figura 5A).

perfis alélicas para várias linhas celulares de CRC MSI e tumores primários são mostrados. perfis normais são definidas em linhas de células LBL e MSS e tumores primários. Para genes monomórficas, uma linha vertical pontilhada indica o alelo único. A zona polimórfica para

HSA-mir-1303

é definido entre duas linhas verticais tracejadas indo ao longo dos 2 alelos (ver figura S1). Tamanhos (pb) são indicadas em uma caixa abaixo de cada perfil. Vários supressões alélicas que variam de 1 a 4 pb foram observados em linhas de células de CRC MSI e tumores primários e são indicados a negrito. As exclusões observadas foram, por vezes, bi-alélicas em linhas celulares MSI CRC. Em tumores primários MSI, os perfis alélicas foram também altamente sugestivos de mutações bi-alélicas. Devido ao polimorfismo inerente que pode modificar o comprimento da sequência, a sequência de gancho de cabelo de

HSA-mir-1303

foi determinada para uma avaliação correcta e fiável das alterações em linhas celulares de CRC MSI (ver Tabela S2) .

a: Alterações em sequências repetidas de

HSA-mir-1303

(a) e sua variante (DELA) não parecem afetar em geral, a estrutura secundária do hairpin, mas a dimensão do laço (annoted dentro) é ligeiramente reduzida, conforme determinado pelo software MFOLD (https://mfold.rna.albany.edu/). miR maduro (negrito) e MNR (letras sublinhadas) são mostradas em ambas as sequências hairpin. As setas indicam as posições potenciais de uma deleção de adenina que leva a um alargamento do loop. B: Comparação das expressões relativas de madura miR-1303 em MSS (MNR inalterado) e linhas celulares MSI CRC com nenhum, mono ou mutações bi-alélicas de

HSA-mir-1303

. MiR expressão foi normalizado para a expressão de RNU48. Meios são mostrados para cada grupo (linha horizontal preta). Observou-se um aumento significativo na expressão de miR-1303 entre linhas celulares MSS e mucosa de cólon normal (

P

= 0,012). C: ausência de correlação entre o tamanho do mir-1303 loop e os níveis de maturidade expressão de miR-1303 em linhas celulares MSI sem (HCT-8, TC7) ou mutações bi-alélicas (LS411, RKO, LIM2405, KM12, LoVo , HCT116) em MNR de

HSA-mir-1303

. Nota linhas de células que produzem precursores hairpin com o mesmo tamanho do loop expressam madura miR-1303 em vários níveis.

Com base nestes resultados, a hipótese de que deleções de nucleotídeos encontradas na precursores de miRNA pode afetar a biogénese de miRs madura, modificando os seus níveis de expressão e /ou a sua sequência conforme relatado para alguns outros genes de miARN [7], [8], [9], [10]. Utilizando tecnologias quantitativas específicas de RT-PCR, determinou-se a expressão relativa de cada amadurecer miR no tipo selvagem (WT) e mutantes linhas celulares de CRC em comparação com a expressão na mucosa do cólon saudável. Expressão de miR-567 e miR-1273c não era detectável em mucosa colónica e linhas celulares colorrectais (C

T 36 ciclos) (dados não mostrados); Considerando que o miR-1303 pareceu ser bastante expresso em ambas as células normais e tumorais do cólon (Figura 5B). Levando-se em conta o nível de instabilidade, miR-1303 expressão foi analisada pela primeira vez em linhas celulares MSI CRC. Com mucosa do cólon normais servindo como controles, foi observada nenhuma diferença na expressão de miR-1303 entre inalterado

HSA-mir-1303

linhas celulares MSI e as linhas de células MSI heterozygously mutantes (Figura 5B). Um aumento na expressão de expressão de miR-1303, no entanto, foi observada em algumas das linhas celulares mutadas MSI em ambos os alelos (Figura 5B). Além disso, as linhas celulares suposto ter estruturas idênticas de grampos de miARN (Figura 5C), não apresentaram níveis de expressão comparáveis. Parece, por conseguinte, desde que o tamanho da malha não se correlacionam com os níveis de expressão, que não têm alterações MSI repercussão sobre a expressão de miR madura. Um aumento significativo de miR-1303 observados em linhas celulares MSS CRC em comparação a mucosa do cólon normal, apoiou este resultado (Figura 5B).

Discussão

Até o momento, o único impacto indireto estabelecido de MSI processo em miARN biogénese é a segmentação e, por conseguinte, a interrupção de genes codificadores de proteínas envolvidas no processamento e transporte miARN [25], [26], [27], [28]. Nosso estudo é o primeiro relatório mutações somáticas em genes miRNA devido a MSI em CRCs MMR-deficientes. Pela triagem da quase totalidade do MNR e DNR (≥ 7 unidades de repetição) contido em miRBase-V15-anotada sequências hairpin miRNA,

HSA-mir-1273c, HSA-mir-1303 e HSA-mir-567

foram demonstrou-se que a mutação de alta frequência em ambas as linhas celulares de CRC e tumores primários. Desde alta frequência de mutação é o primeiro critério actualmente tomado em consideração para identificar genes alvo que desempenham um papel na via MSI-conduzido para o cancro [19], [20], [29], [30], estes genes de miARN pode assim constituir -alvo real para MSI. Em contraste, todas as outras alterações que miARN identificados são susceptíveis de ser o resultado do fundo da instabilidade genética caracterizar estes tumores. Eles foram encontrados para ser afetado em baixa frequência e pode desempenhar um papel menor na tumorigênese de cólon, se houver. Além disso, alguns genes de miRNA contendo microssatélites foram encontrados para não ser mutado em linhas celulares de CRC e tumores primários. Eles podem ser considerados como genes “sobrevivente” miRNA cujas mutações não são selecionados para durante a progressão do tumor, uma vez que pode ser altamente prejudicial para as células cancerosas [19].

MSI também é influenciada por critérios de sequência,

por exemplo,

o comprimento da repetição. Expectedly, observou-se uma correlação positiva entre o comprimento de repetições de miRNA e as suas taxas de mutação em MSI CRC, corroborando a observação feita para codificação e MNR não-codificante. Como exigido para genes codificadores de proteínas [29], [30], os critérios funcionais são necessários para afirmar que os genes de miRNA MSI-alvo têm um papel na MSI cólon tumorigênese. MiRNAs estão profundamente envolvidos na regulação da expressão do gene, sendo, por conseguinte, associado a diversos processos biológicos. Nenhum papel biológico ainda não foi atribuído a

HSA-mir-1303

isto é, entre estes, a única miR que foi expressa de forma significativa na mucosa do cólon. Várias centenas de mRNA pode ser atribuído

in silico

para miR-1303, dependendo do software utilizado, e análises adicionais são necessários para definir aqueles cuja

in vivo

expressão realmente depende de

HSA -mir-1303

. Além disso, a prioridade é para provar que alterações MNR devido a MSI pode impactar mir-1303 função. Várias equipes já destacou o importante papel do ciclo do terminal dentro do hairpin miRNA primário em miRNA biogênese e função [8], [9]. Além disso, uma alteração de uma única base (SNP ou seja) dentro do gene de miARN si (pri-, pré e amadurecer sequências de miARN) é, por vezes, suficiente para alterar a expressão de miARN e /ou função em cancros, bloqueando o processamento de pri-miARN de pré -miRNA [23], [31] ou, pelo contrário, o aumento da expressão de miR madura [32]. Nós não aqui para observar qualquer correlação evidente entre o nível de expressão madura miR-1303 e a mutação na repetição de DNA contida no seu ciclo de terminal em células de CRC MSI, independentemente do SNP adjacente à linha de assinante. Estudos adicionais utilizando as construções de plasmídeos apropriados serão desenvolvidos para saber se as mutações que afectam MNR este gene miARN pode modificar o processamento maduro do miR-1303 gerando miRs diferentes [33] ou a função das moléculas de miARN pré-pri- ou que foram recentemente relatados por Trujillo

et al.

[34] para ser biologicamente ativa.

em conclusão, os nossos resultados têm duas implicações principais para o papel de miRNA na carcinogênese MSI-driven. Eles primeiro fornecem evidências de que MSI CRCs exibição apenas algumas mutações somáticas que afetam um pequeno número de genes miRNA contendo repetições de DNA com consequências ainda incerto sobre o tratamento ea função destas moléculas. Estudos funcionais são agora obrigados a impor a ideia de que o miR-1303 pode ter um papel na MSI tumorigênese. Em segundo lugar, eles mostram que as repetições de ADN contidas nos genes de miARN são relativamente raros e em geral conservados de mutações devidas a MSI em células cancerosas deficientes em MMR. Este estudo centra-se nas repetições de nucleotídeos localizadas nas sequências sinuosas que contêm, pelo menos, o pré-miRNA, e poderia ser ampliado para MNR localizados em outras regiões do miRNA genes importantes para a transcrição e o processamento de grandes transcrições miRNA primário (pri-miRNAs ).

Materiais e Métodos

amostras de DNA

DNA normal foi obtido a partir de 40 indivíduos saudáveis ​​(linhas celulares linfoblastóides) fornecidos pelo CEPH (Centre d’Etude du polymorphisme Humain, Paris, França). tecidos do tumor primário (41 MSI e 25 tumores MSS) de pacientes submetidos à cirurgia para CRC em cada hospital Saint-Antoine (Paris, França) ou o hospital de Hautepierre (Estrasburgo, França) foram coletadas nos centros de recursos biológicos de cada instituição. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. aprovação ética foi obtida a partir Comitê de Ética em Pesquisa (Paris, França) e do “Comité pour la Protecção des Personnes de Strasbourg” (CPPEST IV, Strasbourg, França). O estado MSI foi determinada por PCR multiplex fluorescente, como descrito anteriormente [35], e permitiu a avaliação da percentagem de tecido de carcinoma epitelial em MSI. Apenas tumores com pelo menos 40% de material de tumor foram incluídas em nosso estudo. O DNA foi extraído a partir de 14 MSI e 13 linhas de células MSS CRC usando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, França) de acordo com as instruções do fabricante.

Identificação de mono e dinucleótido repete

A sistemática triagem para mono e dinucleótido repete foi realizada em miRBase (versão 15, abril 2010 release) (https://www.mirbase.org/) [6]. Esta base de dados fornece sequências de precursores hairpin miRNA e miRNAs maduros em várias espécies. Foram selecionados miRNAs humanos com pelo menos 7 unidades de repetição. Este número mínimo foi escolhido porque microssatélites foram raramente encontrados a ser instável abaixo de 7 repetições (consulte a SelTarbase, https://www.seltarbase.org/).

A análise da mutação

primers específicos de flanco as sequências hairpin foram projetados usando o software Amplifix para cada candidato miRNA. A amplificação por PCR foi realizada num volume final de 25 ul com 5 ng de ADN, de alta ou baixa MgCl

2 concentração, com ou sem solução de Q, e ADN-polimerase Taq (Qiagen). As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S3. As condições dos ciclos térmicos compreendia um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 45 seg; 60 ° C durante 60 seg e 72 ° C durante 60 seg. polimerase Finnzyme Phusion de alta-fidelidade DNA (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, França) também foi usado em alguns casos de acordo com o protocolo do fabricante. diluições adequadas dos produtos de PCR fluorescentes foram misturados com formamida e GeneScan ™ 400HD ROX ™ tamanho padrão (Life Technologies, Courtaboeuf, França), o calor desnaturados e executado em um curto capilar contendo GS desempenho otimizado Polymer 7 na ABI 3100 Genetic Analyzer. Os dados foram visualizados e anotados no software GeneMapper 3,7 (Life Technologies).

O sequenciamento de HSA-mir-1303 hairpin precursor

Uma seqüência contendo o precursor hairpin HSA-mir-1303 foi amplificada por a polimerase Finnzyme Phusion de alta fidelidade de ADN (Thermo Fisher Scientific), utilizando os seguintes iniciadores: F-GTGAACTAAACGCTGCCTCTGCTA e R-TGCAGGAACCGTACTAAGCACT (Tm = 66 ° C). Os produtos de PCR foram, em seguida, purificado em 96 poços Multiscreen-PCR canteiros de filtração (Millipore, Molsheim, França). reacção de sequenciação foi realizada utilizando o estojo Big Dye Terminator V3.1 (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante e usando separadamente a frente ou para trás iniciadores. produtos sequências foram então purificado em placas de 96 poços Multiscreen-DV (Millipore) com Sephadex G-50 Fine e analisados ​​em um ABI 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies)

transcrição reversa e PCR em tempo real quantitativa

O ARN total foi preparado a partir de células cultivadas exponencialmente (MSS 9 e 14 células MSI CRC) e mucosa de cólon normal de pacientes com CRC (

N

= 7) utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies) e depois quantificado utilizando um espectrofotómetro NanoDrop. Os cDNAs foram gerados a partir de 10 ng ou 100 ng de ARN total, utilizando iniciadores em ansa pedunculada RT-miARN específicos (Life Technologies) para miR-1303 ou miR-1273c, respectivamente. Os ensaios de RT-qPCR foram realizadas em triplicado num 7900 Sequence Detection System ABI utilizando o ensaio TaqMan MicroRNA de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). Para a detecção de miR-567, o sistema miScript PCR (RT miScript e miScript SYBR Green PCR kits) foi usada de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Com ambas as tecnologias, CT, o número do ciclo em que a quantidade do alvo amplificado atingir um limiar fixo, foi determinada. CT 36 acima foram considerados como falsos positivos. expressão miARN maduro foi normalizada para a da RNU48 (Life Technologies) ou RNU6B (Qiagen) (ΔCT = CT

miR-CT

RNU). Comparativo quantificação foi realizada usando uma amostra de calibrador. expressão miRNA relativo foi expresso em 2

-ΔΔCT (2

– (ΔCT amostra-ΔCTcalibrator)). As condições térmicas de ciclismo composta por 45 ciclos a 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min (Life Technologies) ou 45 ciclos a 94 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s e 70 ° C durante 30 s, precedida por uma etapa de ativação inicial a 95 ° C durante 15 minutos (Qiagen).

análise estatística

as diferenças entre variáveis ​​foram avaliadas com o

Chi-2

ou Fisher teste exato, quando necessário. Teste t de Student foi utilizado para avaliar as diferenças nos níveis de expressão de miR.

Tal como descrito anteriormente por Duval

et al.

, Uma razão de probabilidade foi calculada para atribuir a cada miRNA a um grupo de freqüência [ ,,,0],24]. Com

N

i

, o número de tumores testados no lócus

i

e

n

i

, o número de tumores instáveis ​​neste locus, o

H1

hipótese alternativa supõe a presença de dois tipos de loci (ie. miRNA genes) que diferem em suas frequências de mutação (um grupo “estável” com uma baixa taxa de mutação,

p

1

, e um grupo de “instável”, com uma taxa de mutação elevada,

p

2

α e 1-α são as proporções de sites com o

p

1 |. e

p

2

instabilidade respectivamente). Por outro lado, o

H0

hipótese nula assume que todos os genes de miRNA podem ser agrupados em uma classe de frequência,

p

0

, onde não existem diferenças significativas entre cada locus miRNA. A razão de probabilidade é dada por:

Esta relação segue uma distribuição qui-quadrado com dois graus de liberdade

Para todos os testes, um intervalo de confiança de 95% foi aplicada e

P. Art 0,05 foi considerado significativo

Informações de Apoio

Figura S1.. perfis

alélicas de genes miRNA polimórficas em LBLs. Para

HSA-mir-1303

(T

13),

HSA-mir-620

((TA)

11) e

HSA-mir-558

((GT)

18) genes, a zona polimórfica é determinada entre o menor eo maior alelos (localizado entre as duas linhas verticais tracejadas) observados em uma grande série de linhas de células 40 linfoblastóides de indivíduos saudáveis. O comprimento dos alelos predominantes (pb) é indicado em uma caixa abaixo de cada perfil

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031862.s001

(TIF)

Figura S2.

Comparação das frequências de mutação de miRNA MNRs aos de MNRs ex�icas, não traduzidas, intrônicas ou intergênicas. MNRs com tamanhos entre 7 e 13 pb e localizações genômicas diferentes foram incluídos nesta comparação. Estes MNRs são tomadas a partir SelTarbase (https://www.seltarbase.org/, Outubro 2010 release), um banco de dados aberto de mutações microssatélites mononucleotidic humanos em cancros MSI

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031862.s002

(TIF)

Figura S3.

Classificação de miRNAs com MNR base para as suas frequências de mutação em linhas celulares MSI CRC.