Abstract

Fundo

Este estudo teve por objetivo investigar o significado funcional de sulfato de heparan (glucosamina) 3-

O

-sulfotransferase 2 (

HS3ST2

) hipermetilação no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Metodologia /Principais achados

HS3ST2

hipermetilação foi caracterizado em linhas celulares de cancro do pulmão de seis, e sua significado clínico foi analisado utilizando 298 tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina e 26 tecidos frescos congelados de 324 pacientes com NSCLC. MS-HRM (fusão de alta resolução específica-metilação) e EpiTYPER

TM ensaios mostrou hipermetilação substancial da ilha CpG na região promotora de

HS3ST2

em linhas celulares de cancro de seis pulmonares. O gene silenciado foi desmetilado e re-expressas por tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-dC). Um ensaio de promotor também mostrou a actividade do promotor de núcleo HS3ST2 foi regulada por metilação. expressão exógena de HS3ST2 em células de câncer de pulmão H460 e H23 inibiu a migração celular, invasão, proliferação celular e que knockdown de HS3ST2 em NHBE células migração celular, invasão e proliferação celular induzida

em

vitro

. Observou-se uma correlação negativa entre o mRNA e metilação níveis de HS3ST2 em 26 tumores fresco congelado tecidos (ρ = -0,51,

P

= 0,009; correlação de Spearman).

HS3ST2

hipermetilação foi encontrada em 95 (32%) de 298 CPNPC primários. Os pacientes com

HS3ST2

hipermetilação em 193 linfonodos negativos fase I-II CPNPC com um período de acompanhamento médio de 5,8 anos teve sobrevida global pobres (taxa de risco = 2,12, 95% de intervalo de confiança = 1,25-3,58,

P

= 0,005) em comparação com aqueles sem

HS3ST2

hipermetilação, após o ajuste para idade, sexo, tamanho do tumor, a terapia adjuvante, recorrência e diferenciação.

Conclusões /Significado

O presente estudo sugere que

HS3ST2

hipermetilação pode ser um indicador prognóstico independente para sobrevida global em linfonodos negativos fase I-II NSCLC

Citation:. Hwang JA, Kim Y , Hong SH, Lee J, Cho YG, Han JY, et al. (2013) epigenética Inactivação de sulfato de heparano (glucosamina) 3-

O

-Sulfotransferase 2 no câncer de pulmão e seu papel na Tumorigênese. PLoS ONE 8 (11): e79634. doi: 10.1371 /journal.pone.0079634

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 22 de maio de 2013; Aceito: 25 de setembro de 2013; Publicação: 12 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hwang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Cancer Center (NCC 1110140-1 e 1110100-2), tecnologia da Coréia Healthcare R D Project, Ministério da Saúde, Bem-estar Assuntos da família, República da Coreia. (A084947AA202308N100010A), e da Fundação Nacional de Pesquisas da Coreia do subsídio (NRF) financiado pelo governo da Coreia (MEST) (No. 2011-0029138), República da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Apesar dos avanços significativos na detecção precoce e tratamento nas últimas duas décadas, o prognóstico permanece pobre, com a pairar geral taxa de sobrevida em 5 anos a menos de 15% [1]. O mau prognóstico de pacientes com câncer de pulmão resulta em grande parte de micrometástases, o que torna menos provável curar, e parcialmente a partir da alta taxa de recorrência após ressecção curativa; pacientes com câncer de pulmão em estágio I têm uma sobrevida de 50% se o câncer se espalhou para os linfonodos próximos ou outras áreas. Mais de 80% das recorrências ocorrer dentro dos primeiros dois anos; as taxas de recorrência após ressecção cirúrgica curativa com linfa adequado gama nó dissecção a partir de 20% a 50%, dependendo da fase patológica [2]. Assim, a descoberta de biomarcadores moleculares para a detecção precoce e identificação de pacientes com alto risco de recorrência é claramente importante.

sulfato de heparano (HS) é um polissacárido linear, que é encontrada em todos os tecidos dos animais, e que ocorre como um proteoglicano em que dois ou três glicosaminoglicano sulfato de heparano lineares (GAG) as cadeias estão covalentemente ligados a resíduos de serina específicos na uma proteína do núcleo através de um ligante tetrassacárido [3]. As cadeias SH são montados sobre uma proteína do núcleo pelas enzimas no aparelho de Golgi e são constituídos por unidades repetidas de dissacárido de alternando glucurónico (GlcA) ou ácido idurónico (IdoA) e

N-acetil glucosamina

(GlcNAc). Durante a montagem, são submetidos a uma série de alterações sequenciais começando com

N

-deacetylation e

N

-sulfation dos resíduos de glucosamina. Adjacente a esta primeira modificação, alguns resíduos são GlcA epimerizado para idurónico ácido por uma epimerase C5 e, em seguida, 2-O-sulfatado, com mais de sulfatação nas posições 6-O e 3-O de resíduos de glucosamina, para se obter cadeias maduras [4,5 ]. As modificações são importantes para a estrutura fina de proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) e na especificidade da interacção proteína-sulfato de heparano.

heparano sulfato de

(

glucosamina

)

3-O-

sulfotransferase

2

(

HS3ST2

), um membro do heparan sulfato de família enzima biossintética, possui sulfato de heparan glucosaminilo 3-

O

atividade -sulfotransferase que modifica cadeias de GAG ​​[6,7].

HS3ST2

hipermetilação foi relatado recentemente em uma variedade de cânceres, como câncer de mama [8,9], o cancro colorectal [8,10,11], câncer gástrico [12], neoplasia hematológica [13], o cancro do pulmão [8], câncer pancreático [8], o câncer de próstata [14], e cancro do colo do útero [15,16].

HS3ST2

hipermetilação foi encontrado com uma frequência elevada no carcinoma ductal in situ de mama [9] e em amostras de citologia cervical de neoplasia intra-epitelial 3 (CIN3) [15], sugerindo

HS3ST2

hipermetilação provavelmente ocorre precocemente durante a transformação maligna da mama e colo do útero.

HS3ST2 também

mostra alta metilação no câncer de próstata com a recorrência [14]. Além disso, a frequência de

HS3ST2

hipermetilação é rico em alto grau de lesão escamosa intra-epitelial (HSIL) do colo do útero em comparação com baixo grau de lesão escamosa intra-epitelial (LSIL) [16]. No entanto, o significado clínico-patológico de

HS3ST2

hipermetilação permanece indefinida no câncer de pulmão. Para obter uma melhor visão sobre o papel da

HS3ST2

hipermetilação no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), caracterizamos

HS3ST2

hipermetilação em linhas celulares de cancro do pulmão e seis investigou o efeito da hipermetilação do

HS3ST2

no fenótipo e prognóstico de câncer de pulmão em tecidos embebidos em parafina de 298 cânceres primários de pulmão não pequenas células (NSCLCs).

Materiais e Métodos

cultura celular e amostras de tecido

Seis linhas de células humanas de câncer de pulmão (H23, H226, H460, H520, H1650 e A549) e duas linhas epiteliais brônquicas humanas celulares (HBEC e NHBE) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection ( Manassas, VA). As células foram cultivadas num meio de crescimento designado suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10% (Hyclone, Logan, UT) e 1% de antibiótico-antimicótico (Invitrogen, EUA). Vinte e seis tumor fresco congelado e correspondentes tecidos normais, bem como 298 tecidos tumorais embebidos em parafina, foram obtidos a partir de um total de 324 pacientes com NSCLC submetidos à ressecção curativa no Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular, Samsung Medical Center, Seul, Coreia entre Agosto de 1994 e novembro de 2005. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão Institucional da Samsung Medical Center, e consentimento informado por escrito para a utilização de tecidos foi obtida de cada paciente antes da cirurgia. Pós-operatório follow-up para a sobrevivência ou a reincidência foi realizado como descrito anteriormente [2]. estágio TNM patológica foi determinada de acordo com as orientações do Comité Misto Americana do Cancro [17]

extração e DNA genômico de sódio modificação bisulfite

H . E (Hematoxilina e Eosina) coloração de fresco tecidos -frozen e embebidos em parafina foi realizada; as áreas tumorais continha pelo menos 75% de tecido neoplásico. O ADN genómico a partir de células cultivadas e a partir de 26 de tumor fresco congelado e tecidos normais e 298 tecidos de tumor embebidas em parafina foi extraído utilizando o MagAttract DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e o kit de tecido DNeasy (Qiagen, Valencia, CA) correspondente, respectivamente. Um micrograma de ADN genómico foi modificado por bissulfito de sódio utilizando o Kit de DNA Metilação de EZ-ouro (Zymo Research, Irvine, CA).

ensaio MS-HRM, EpiTYPER

TM ensaio, e metilação específicas de PCR

Para encontrar regiões altamente metilados no

HS3ST2

promotor, uma região 2 kb contendo 1,5 kb

HS3ST2

promotora foi analisada com um derreter (MS-HRM) ensaio de alta resolução específicos de metilação em um tempo real instrumento de PCR LightCycler®480 (Roche, Switerland). O estado de metilação de uma região de 1,5 kb que foi encontrado para ser altamente metiladas por análise MS-HRM foi adicionalmente analisada quantitativamente utilizando o EpiTYPER

TM ensaio (Sequenom, San Diego, CA) para analisar os estados de metilação de CpG individuais. regiões analisadas estão representadas na Figura 1A. Os iniciadores para cada ensaio foram concebidos utilizando SEQUENOM (San Diego, CA) de software EpiDesigner (Tabela S1 e S2). O estado de metilação de

HS3ST2

nos 298 tecidos embebidos em parafina e fixado em formalina foi determinada utilizando metilação específicas de PCR (MSP) com dois conjuntos de iniciadores (Tabela S3) abrangendo a região do promotor, como anteriormente descrito

2. As reacções foram quente começou a 94 ° C antes da adição de 2,5 unidades de Taq polimerase. A amplificação foi realizada durante 35 ciclos (30 s a 94 ° C, 30 s a a temperatura de recozimento, 30 s a 72 ° C), seguido de 4 minutos a 72 ° C. Os resultados da análise de MSP foram classificadas visualmente por dois autores (Y Kim e D-H Kim). As amostras com uma intensidade de banda mais forte do que o controlo negativo na PCR específicos de metilação foram denotado metilado, e as amostras com nenhuma produto de PCR visível foram considerados como não metilado.

(A) CpG mapa da ilha de

HS3ST2

promotor e as regiões analisadas usando MS-HRM e ensaio EpiTYPER. status (B) A metilação do

HS3ST2

foi avaliada pela primeira vez em seis linhagens de células de câncer de pulmão e duas linhas de células epiteliais brônquicas usando MS-HRM. (C) metilação de CpG individuais a uma região do promotor de 1,5 kb (GRH-04, 05, 06, 07, 08, e 09) foi quantitativamente analisada nas linhas de células usando o ensaio de TM EpiTYPER

. níveis de metilação são descritos como uma mudança de cor numa escala de vermelho contínua (0% metilado) ao branco (100% metilado). (D) os níveis de transcrição da

HS3ST2

foram comparados entre as linhas de células de câncer de pulmão altamente metilados e linhas de células epiteliais brônquicas por qRT-PCR (barra preta). Recuperação de

HS3ST2

transcrição foi avaliada após o tratamento de linhas celulares de cancro do pulmão seis com 5-Aza-dC durante 72 h (cinza bar vs. barra branca;

P

-Valores são baseados em Wilcoxon ensaio assinado-rank). (E) de metilação de CpG em torno da área altamente metilado ATG do

gene HS3ST2

foi avaliada após o tratamento com 5-Aza-DC por 72 h. O mapa de calor mostra padrões típicos de desmetilação em células cancerosas em resposta a 5-Aza-dC, e as percentagens indicam níveis médios de metilação.

Análise de expressão HS3ST2

Para examinar a expressão de HS3ST2 ao nível do ARNm, ADNc foi sintetizado a partir de dois ug de ARN total utilizando o SuperScript

TM III da primeira cadeia Synthesis System (Invitrogen, CA). A expressão de ARNm de HS3ST2 foram analisados ​​utilizando RT-PCR quantitativo e PCR em tempo real (qRT-PCR). Quantitativa PCR em tempo real foi realizada em um LightCycler

® 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science). GAPDH foi usada como um gene de referência, e o nível de expressão relativa foi calculada utilizando a ôc

método T (ôc

T = C

T de GAPDH – C

T de HS3ST2). O experimento foi realizado em triplicado e os iniciadores de qRT-PCR utilizados foram os mesmos que no RT-PCR. Os iniciadores foram concebidos para conter junção exão-exão (Tabela S3).

tratamento com 5-Aza-dC in vitro

Seis linhas celulares de cancro de pulmão foram incubadas com 10? M de 5-aza-2 ‘-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durante 72 h. Após a incubação, a expressão de ARNm e metilação foi quantificada por quantitativa PCR em tempo real e ensaio de TM EpiTYPER

, respectivamente.

Repórter ensaio

construções de deleção em série do promotor HS3ST2 foram criadas, e diferentes comprimentos de regiões promotoras (-984 ~ + 12, + 12 ~ -742, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) foram amplificados utilizando iniciadores de PCR (Tabela S4) e clonado no vector pGL3-basic. A sequência promotora foi

in vitro

metilado por CpG-específico

Sss

I metilase (New England Biolabs, Ipswich, MA). As actividades promotoras de construções metilados e não metilados foram comparados pela dupla de luciferase ensaio (Promega, Madison, WI).

A migração celular, invasão e proliferação de ensaio

Para

in vitro

a migração celular, invasão e os ensaios de proliferação, um pAcGFP1-C1-

HS3ST2

clone de ADNc foi preparada utilizando os iniciadores listados na Tabela S3, e células H460 e H23 foram transfectadas com uma ug pAcGFP1-C1-

HS3ST2

e pAcGFP1-C1 (vector vazio) usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, EUA). Quarenta e oito horas após a transfecção, a expressão HS3ST2 foi confirmada por imunotransferência utilizando anticorpos primários dirigidos a GFP (SC-9996; Santa Cruz Biotechnology, CA) e α-tubulina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). A migração celular foi ensaiada deixando as células para migrar para baixo durante a noite a 37 ° C através de um elemento filtrante de poro de 8 m (BD, EUA) e, em seguida, através da coloração com violeta de cristal a 1%; as células foram dissolvidas em 564 nm, medida num VERSA

max leitor de microplacas (Molecular Devices, USA). O ensaio de invasão foi realizada por contagem Diff-Quick

TM (Sysmex, Japão) em células coradas um inserto de Matrigel-revestido na sequência de uma incubação de 48 h. Para o ensaio de proliferação, os poços foram semeadas com 1 × 10

3 células por poço e um ensaio de MTT foi realizada a cada 24 h; células em proliferação foi medida por absorvância a 570 nm.

pequena interferência RNA (siRNA sequência alvo.: Gato 5′-CCCAGCTACTTTGTCACTCAA-3 ‘No. SI00442015, Qiagen) Knockdown de HS3ST2

HS3ST2-específica ou controle negativo siRNA (N ° de Cat 10272810, Qiagen) foi transfectado para células NHBE. Após 72 h de transfecção, silenciamento de HS3ST2 foi confirmada por immonublotting utilizando anticorpos primários dirigidos a HS3ST2 (Cat. No. PA5-26522, Thermo Scientific) e normalizados com β-actina. O efeito do knockdown HS3ST2 sobre a migração celular, invasão celular e a proliferação celular foi analisada como descrito acima.

quantitativa metilação específicas de PCR

de metilação de ilha CpG na região promotora de

HS3ST2

em 26 tecidos de tumor fresco congelado foi quantitativamente analisada utilizando o ensaio de PCR quantitativo em tempo real, baseado em fluorescência, MethyLight, tal como descrito por Gonzalo et al [10]. Resumidamente, as reacções foram MethyLight realizada num volume final de 12,5 mL contendo ADN tratado com bissulfito de 1,0 uL, 900 nM de cada iniciador e sonda TaqMan 250 nM. termociclagem reacções foram realizadas utilizando um tempo real Sistema de PCR 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA), e

gene ALU-C4

foi utilizado como referência interna para normalizar a quantidade de ADN de entrada [18]. Os iniciadores e sondas TaqMan marcados com fluorescência utilizados no presente estudo são apresentados na Tabela S5.

A imuno-histoquímica de Ki-67

análise imuno-histoquímica de Ki-67 foi realizada como descrito anteriormente [19] . A fração de Ki-67-positivo células (o índice de marcação Ki-67) foi definido como o percentual de núcleos corados positivamente com o anticorpo.

A análise estatística

O teste de Wilcoxon ( ou

t

-teste) e exato de Fisher (ou o teste do qui-quadrado) foram utilizados para a análise univariada das variáveis ​​contínuas e categóricas, respectivamente. níveis de mRNA HS3ST2 entre os tecidos tumorais e tecidos normais pareados foram comparadas pelo teste de sinais com posto Wilcoxon. coeficiente de correlação de Spearman foi calculado para a avaliação da correlação entre a expressão e metilação de

HS3ST2

. O efeito da

HS3ST2

hipermetilação na sobrevivência ou recidiva foi estimada pelas curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, e a significância das diferenças no prognóstico entre os grupos foi avaliada pelo teste de log-rank. Cox análise de risco proporcional foi realizado para estimar as taxas de risco de

HS3ST2

hipermetilação para a sobrevivência, após o controle de potenciais fatores de confusão.

Resultados

Análise de metilação em torno do promotor HS3ST2

o estado de metilação de

HS3ST2

em torno do

HS3ST2

promotora foi analisada utilizando MS-HRM (Figura 1B) e EpiTYPER

TM ensaios (Figura 1C) em seis linhas celulares de cancro do pulmão e duas linhas de células epiteliais brônquicas normais. estado de metilação de uma região de 2,0 kb contendo a sequência do promotor de

HS3ST2

foi exibido pela primeira vez por MS-HRM. Notável curva de fusão dissociação foi observada em seis fragmentos (HRM-04, 05, 06, 07, 08 e 09) entre linhas celulares de cancro do pulmão e linhas normais epiteliais brônquicas celulares (Figura 1B). Porque citosina metilada requer uma temperatura de fusão mais elevada do que a citosina não metilada, as curvas de fusão dos fragmentos metilados deslocado para a direita em comparação com linhas celulares normais. Para avaliar os estados de metilação de CpG em cada região do promotor de 1,5 kb incluindo os seis fragmentos, que analisado quantitativamente CpGs individuais com o EpiTYPER

TM ensaio (Figura 1C). linhagens de células normais foram hypomethylated em sequências de 1,5 kb inteiros, mas linhas celulares de cancro do pulmão eram geralmente hipermetilado em torno do local de início da tradução ATG. Embora alguns CpGs no ATG site do início tradução de

HS3ST2

foram parcialmente metilado em H226 e H1650 células, a maioria dos CpGs foram altamente metilado em outras linhas de células de câncer de pulmão.

5-Aza-dC desmetilação induzido e re-expressão de silenciados HS3ST2

Para investigar se a regulação negativa do

HS3ST2

é dependente de hipermetilação do gene, foi analisada a re -expression (Figura 1D) e desmetilação (Figura 1E) do silenciada

HS3ST2

por qRT-PCR e ensaio TM EpiTYPER

após o tratamento de células de câncer de pulmão com 10? M de 5-Aza-dC por 72 h. Os níveis de ARNm HS3ST2 eram substancialmente mais baixos em linhas celulares de cancro de pulmão do que seis em duas linhas de células epiteliais brônquicas (barra preta; Figura 1D). Silenciados

HS3ST2

foi re-expressa em todas as linhas de células de câncer de pulmão após tratamento com 5-Aza-dC (barra branca; Figura 1D). A mudança no nível de metilação em resposta a 5-aza-dC foi ainda analisada em CpGs individuais em redor da área altamente metilada ATG do gene da

HS3ST2

(Figura 1E). Embora o grau de desmetilação diferia entre as linhas celulares, desmetilação foi encontrada em todas as linhas de células após o tratamento 5-aza-dC. Desmetilação ocorreu de forma mais substancial em H460 ou H1650 células, que eram menos densamente metilado, que em células H23 densamente metilados. Estes achados sugerem que

HS3ST2

hipermetilação pode ser associada com regulação negativa da transcrição do gene.

HS3ST2

actividade do promotor diminuiu com o promotor metilação

A actividade do promotor foi medida em células H23 (Figura 2A) e células HEK-293T (Figura 2B) pelo ensaio de luciferase duplo para determinar se

HS3ST2

metilação afeta a transcrição do gene. Quatro construções (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) para cada sequências do promotor metilados e não metilados foram produzidos. metilados de construções

HS3ST2

promotor foram obtidos com SSSI metilase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) na presença de S-adenosilmetionina. A actividade do promotor entre os construtos de não metilados

HS3ST2

promotor não era proporcional ao comprimento de cada construção nas células, mas a actividade do promotor foi notavelmente diminuída quando sequências promotoras entre -742 e -495 pb pb foram suprimidos. Para construções metilados, a actividade do promotor foi semelhante em todas as construções e substancialmente reduzida quando comparada com a de construções não metilados correspondentes. Esta observação sugere que o promotor-núcleo compreende uma região de DNA de -742 pb através de -495 pb do local de iniciação da transcrição.

As actividades de luciferase dupla de quatro HS3ST2 construções de promotor foram medidos em H23 (A) e HEK- linhas celulares 293T (B). Uma construção promotor kb foi serialmente excluído, ea atividade luciferase de cada construção foi comparado entre os construtos tratados com (barra cinza) e sem SSSI metilase (barra preta).

HS3ST2 inibiu a migração celular, invasão e proliferação

Para investigar a função de

HS3ST2

na tumorigênese do pulmão, migração celular, invasão e proliferação foram examinada em células de câncer de pulmão H460 e H23.

HS3ST2

ADNc foi clonado em pAcGFP-C1 e transfectado em células H460 e H23: dados de H23 são células na Figura S1. A sobre-expressão de transfectada pAcGFP-C1-

HS3ST2

foi monitorizada por meio de RT-PCR (Figura 3A), qRT-PCR (Figura 3B), e imunotransferência (Figura 3C). Superexpressão de

HS3ST2

reduziu significativamente a capacidade de migração celular em 53% (

P

= 0,0017; Figuras 3D e 3E). a atividade das células invasão diminuiu 83% em H460 transfectadas com pAcGFP-C1

HS3ST2

(

P

= 0,0019; Figuras 3F e 3G); proliferação celular também diminuiu substancialmente ao longo do tempo (Figuras 3H 3I). Estas observações sugerem que

HS3ST2

pode inibir tumorigênese pulmonar, reduzindo a migração celular, invasão, ou a proliferação de células do cancro do pulmão.

(AC) pAcGFP-C1

HS3ST2

foi transfectado em células de câncer de pulmão H460. a sobre-expressão específica de

HS3ST2

em comparação com o vector vazio foi confirmada por RT-PCR (A), qRT-PCR (B), e Western blotting (C). (DG) células H460 foram semeadas em uma câmara de Boyden com um vector vazio ou com uma ug pAcGFP-C1

HS3ST2

em transpoço migração (D E) e ensaios de invasão (F G), tal como descrito em Materiais e Métodos. Manchado migração de células e as células invasoras são mostrados em (D) e (F), respectivamente; As células que migram foram medidas por absorvância a 564 nm; células invasoras foram contadas sob um microscópio. Os resultados são apresentados em relação ao

em

migração vitro

ou invasão de células H460 não induzidas (100%). (H I), H460 células transfectadas com um vector vazio ou pAcGFP-C1-

HS3ST2

foram cultivadas em um prato de 96 cavidades para analisar o efeito de

HS3ST2

sobre o crescimento celular. A proliferação celular foi medida pelo ensaio de MTT e foi medida a absorvância a 570 nm. Os dados são apresentados como ± erro padrão da média (SE) de experiências em triplicado.

Knockdown de HS3ST2 aumento da migração celular, invasão celular e proliferação celular

Para confirmar os dados de HS3ST2 ectópica expressão, os efeitos de

HS3ST2

knockdown sobre a migração celular, invasão e proliferação de células foram analisados ​​em células epiteliais brônquicas NHBE. Após 72h de

HS3ST2

knockdown, silenciando foi confirmada por immunoblotting (Figura 4A). Knockdown de

HS3ST2

causou um aumento na proliferação de células (Figura 4B). migração e invasão celular também aumentou em 45% e 79% em células silenciadas NHBE, respectivamente (Figuras 4C 4D).

(A) HS3ST2 siARN foi transfectado em células NHBE, e knockdown siRNA mediada foi confirmada por Western blot. viabilidade (B) das células foi medido pelo ensaio de MTT determinada avaliando a absorvância do corante convertido a um comprimento de onda de 570 nm. (C D) O efeito do knockdown HS3ST2 sobre a migração celular (C) e invasão (D) também foi medido em células NHBE. NC indica controlo normal não tratada.

Relação de características clínico-patológicas com HS3ST2 hipermetilação

Antes de analisar o significado clínico-patológico de

HS3ST2

hipermetilação em NSCLC, a relação entre o

HS3ST2

hipermetilação e sua expressão foi analisada em tecidos frescos congelados. Quantitative PCR em tempo real foi realizada em tumor fresco congelado e combinados a partir de tecidos normais de apenas 26 doentes, devido à pequena quantidade de tecidos, e a PCR específica de metilação-quantitativo foi realizado em tecidos de tumor de pacientes. níveis de mRNA HS3ST2 foram significativamente maiores nos tecidos normais do que em tecidos tumorais (teste

P

= 0,0004, postos sinalizados de Wilcoxon; Figura 5A), e foi observada uma correlação negativa entre a expressão e metilação do

HS3ST2

em 26 tecidos tumorais (ρ = -0,51,

P

= 0,009, de correlação de Spearnman; Figura 5B). O estado de metilação de

HS3ST2

foi analisada em 298 tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina, utilizando PCR específicos de metilação (MSP) (Figura 5C). As relações entre as características clínicas e

HS3ST2

hipermetilação estão descritos na Tabela 1.

HS3ST2

hipermetilação foi encontrada em 95 (32%) de 298 pacientes.

HS3ST2

hipermetilação não foi associada com a idade do paciente (

P

= 0,12), o tamanho do tumor (

P

= 0,14), sexo (

P

= 0,33), histologia (

P

= 0,12), a diferenciação (

P

= 0,31), estágio patológico (

P

= 0,66), ou recorrência do tumor (

P

= 0,20). No entanto,

HS3ST2

hipermetilação foi significativamente associada com maços-anos de tabagismo (

P

= 0,01) e foi mais prevalente em atuais fumantes do que em mulheres que nunca fumaram (

P

= 0,002).

níveis (A) de mRNA HS3ST2 foram comparados primeira quantitativa entre 26 tecidos tumorais fresco congelado e correspondentes tecidos normais (Wilcoxon signed-rank teste,

P

= 0,0004). Os dados são apresentados como a média 2

-ΔC

valor T de experiências em triplicado, e as barras representam desvios padrão. (B) correlação negativa entre expressão e de metilação níveis de

HS3ST2 foi observada

usando a análise de correlação de Spearman em 26 tecidos tumorais (ρ = -0,51,

P

= 0,009). (C) A metilação do

HS3ST2

promotor foi analisado em tecidos embebidos em parafina de pacientes com NSCLC usando PCR específicos de metilação (MSP). números de identificação dos pacientes são indicados. “H” e “L” representa a amplificação do alelo metilado e não metilado, respectivamente. “Pos” representa os controlos positivos para os alelos metilados e não metilados. Foram incluídas amostras de controlo negativo sem ADN para cada PCR. (D) Expressão de Ki-67 foi analisada por análise de imuno-histoquímica. Os números mostram exemplos representativos de expressão positiva de Ki-67 no adenocarcinoma (esquerda) e carcinoma de células escamosas (direita) (Ampliação: × 200). (E) Associação de

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hipermetilação com Ki-67 índice de proliferação foi avaliada em 298 CPNPC. As barras de erro representam o erro padrão. “Adenoca” e “escamosas” indicam adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular, respectivamente. “Met (+)” e “Met (-)” representam a presença e ausência de

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hipermetilação, respectivamente

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hipermetilação.

Categoria

Subcategoria

Não (N = 203)

Sim (N = 95)

P

-valor

Idade

a62 ± 860 ± 110.12Pack anos

a26 ± 2,432 ± 250.01Size (cm)

A3.9 ± 2.10.14SexWomen4526Men158690.33Smoking 1.94.3 ± statusNever7315Former3217Current98630.002HistologyAdeno

b7748Squamous

b10739Others1980.12Differentiation

cWell2517Moderately9537Poorly2918Undifferentiated720.31Pathologic stageI11858II5319III3017IV210.66RecurrenceNo11059Yes93360.20Table 1. Características clínicopatológicos (n = 298)

aMédia ± padrão deviationbAdeno, adenocarcinoma.; , dados escamosas escamosas cDifferentiation carcinoma de células estão em falta em 68 casos CSV Baixar CSV

Para analisar a relação de

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hipermetilação à proliferação celular, Ki-67 foi avaliada por coloração imuno-histoquímica (Figura 5D). O índice de proliferação Ki-67 foi encontrado para ser significativamente diferente de acordo com o estado de metilação de

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(

P

= 0,02; Figura 5E), o índice de proliferação média Ki-67 foi de 29% e 22% em tumores com e sem

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hipermetilação, respectivamente. A relação entre o índice de proliferação Ki-67 e

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hipermetilação também foi similar em adenocarcinoma (

P

= 0,04) e carcinoma de células escamosas (

P

= 0,009).

a análise de sobrevida

sobrevida livre de recorrência (RFS) e sobrevida global foram comparados de acordo com o estado de metilação de

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em todo o estágio do tumor. Para analisar o efeito de

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hipermetilação no prognóstico do paciente, estratificamos dados pelo estágio do tumor, porque o estágio do tumor é significativamente associada à sobrevida do paciente em NSCLC.

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hipermetilação não foi associada com RFS (dados não mostrados). No entanto, o efeito de

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hipermetilação na sobrevivência global mostrou um padrão diferente de acordo com envolvimento de linfonodo em 248 fase I-II CPNPC. Para 193 linfonodos negativos fase I-II CPNPC, a taxa de sobrevida em 5 anos foi de 59% e 71% em pacientes com e sem

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hipermetilação, respectivamente (Figura 6A). E, essa diferença foi significativamente diferente (

P

= 0,04). No entanto, a sobrevida global não foi significativamente diferente entre os pacientes com e sem hipermetilação do

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em 55 casos nódulo positivo. (

P

= 0,69; Figura 6B)

No geral sobrevivência foi comparada acordo com o estado de metilação de

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em 193 estágio linfonodos negativos I-II CPNPC (a) e em 55 fases nódulo positivo I-II CPNPC (B).

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hipermetilação em um grupo que não tem envolvimento de linfonodo mostrou um efeito adverso significativo na sobrevida global (

P

= 0,04).

Cox- análise de riscos proporcionais

estratificada proporcional de Cox riscos análise (Tabela 2) para 248 fase I-II CPNPC foram realizados com controle de potenciais efeitos de confusão de variáveis, tais como idade, sexo, tamanho do tumor, a terapia adjuvante, recorrência, e diferenciação, e para calcular a taxa de risco (HR). Os pacientes com

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hipermetilação em 193 CPNPC linfonodos negativos teve um 2,12 vezes (95% intervalo de confiança [CI] = 1,25-3,58;

P

= 0,005) maior risco de falha em comparação com aqueles sem

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hipermetilação. No entanto, a sobrevida global em pacientes com o envolvimento de linfonodo não foi significativamente diferente de acordo com o estado de metilação de

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(HR = 0,84; IC95% = 0,34-3,82;

P

= 0,69).

HS3ST2

hipermetilação

HR

a

IC 95%

a

P

-valor

(A) casesNo1.00 nódulo positivo (n = 55) Yes0.840.34-3.820.69 (B) casesNo1.00 nó-negativo (n = 193) Yes2.121.25-3.580.005Table 2.