Sumário

Proteína Tirosina-quinase 6 (PTK6) é um tipo de tirosina-quinase não receptora que pode estar envolvido em alguns cancros. No entanto, o papel e a expressão biológica estatuto de PTK6 no câncer de pâncreas é desconhecida. Portanto, neste estudo, foi avaliado o papel funcional da PTK6 na invasão câncer pancreático. Cinco linhas de células do cancro do pâncreas expresso PTK6 em diferentes níveis. PTK6 expressão foi também observada em adenocarcinomas pancreáticos humanos. supressão PTK6 por siRNA reduziu significativamente tanto a migração celular e invasão (0,59 /0,49 vezes para BxPC3, 0,61 /0,62 para Panc1, 0,42 /0,39 para MiaPaCa2, respectivamente,

P 0,05 para cada

). Em contraste, forçado a sobre-expressão de PTK6 por transfecção de um vector de expressão PTK6 em células Panc1 e MiaPaCa2 aumento da migração celular e invasão (1,57 /1,67 vezes para Panc1, 1,44 /1,57 para MiaPaCa2, respectivamente,

P 0,05

) . Silenciando PTK6 reduzida 2 activação /ERK1, mas não AKT ou ativação STAT3, enquanto PTK6 superexpressão aumento da ativação de ERK1 /2. U0126, um inibidor específico de ERK1 /2, aboliu completamente o efeito de sobre-expressão PTK6 sobre a migração celular e invasão. Estes resultados sugerem que PTK6 regula a migração celular e invasão no câncer de pâncreas via de sinalização ERK. PTK6 pode ser um novo alvo terapêutico para câncer de pâncreas

Citation:. Ono H, Basson MD, Ito H (2014) PTK6 Promove migração e invasão de câncer em células do cancro do pâncreas Dependentes ERK sinalização. PLoS ONE 9 (5): e96060. doi: 10.1371 /journal.pone.0096060

editor: Noriko Gotoh, Instituto de Ciências Médicas da Universidade de Tóquio, Japão

Recebido: 22 de novembro de 2013; Aceito: 02 de abril de 2014; Publicado em: 01 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ono et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo fundo de investigação do departamento interno dos autores. O financiador (Departamento de Cirurgia da Michigan State University) não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existe.

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta causa de mortalidade por câncer nos Estados Unidos. [1] A sobrevida em pacientes com câncer de pâncreas tem sido sombrio, com uma taxa-sobrevida em 5 anos 5%. [2] A letalidade do câncer de pâncreas é devido aos seus comportamentos biológicos agressivos, incluindo um grande potencial de invasão e metástase, e resistência a agentes anti-câncer atualmente disponíveis. Os mecanismos moleculares responsáveis ​​por essas características é em grande parte desconhecida, e deve ser entendido para melhorar os resultados do tratamento de pacientes com câncer de pâncreas.

proteína tirosina quinase 6 (PTK6) ou mama relacionado tumor quinase (BRK) é um não-receptor de tipo de tirosina-cinase. Ela está relacionada com a família da quinase c-Src, possuindo os domínios SH2 e SH3. [3] PTK6 promove a diferenciação celular em células epiteliais normais e quase não é expressa em células epiteliais maduras no trato gastrointestinal, mama ou pele. [3] – [5] Embora a superexpressão anormal de PTK6 foi identificada em vários cancros epiteliais, incluindo cancros da mama, pulmão, melanoma, próstata, cólon e ovário, as funções de PTK6 na biologia do cancro não foram completamente caracterizadas. [3], [6] – [12].

Neste estudo, foi avaliado o papel da PTK6 na invasão de células do cancro do pâncreas e explorou os sinais a jusante que possam mediar tal efeito. Nossos resultados sugerem que PTK6 regula invasão pela ativação ERK e levanta a possibilidade de que PTK6 pode ser um alvo molecular novo e importante para melhorar a eficácia da terapia para câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

Materiais

meios de cultura, soro fetal de bovino (FBS) e penicilina /estreptomicina (P /S) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). O anticorpo anti-PTK6 foi obtido a partir de Santa Cruz Bioquímica (Santa Cruz, CA), anti-p44 /42 ERK1 /2, anti-fosfo-p44 /42 ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), anti-MAPK p38, anti-fosfo -p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), anti-STAT3, e anti-fosfo-STAT3 (Tyr705) anticorpos foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA), e anticorpo anti-β-actina foi obtido a partir de Sigma-Aldrich. O U0126 inibidor selectivo da ERK1 /2 foi obtido da Sigma-Aldrich.

tecidos humanos

pancreáticas lâminas de tecido de cancro foram obtidas junto ao Departamento de Patologia da Sparrow Hospital, Lansing MI. O uso de amostras arquivadas para este estudo foi aprovado pela Michigan State University (MSU) e Sparrow Hospital Institutional Review Boards (IRBs). Nosso comitê IRB dispensou a necessidade de consentimento. Nove pacientes submetidos à ressecção pancreática para o adenocarcinoma ductal pancreático, de 2002, embora 2012 foram selecionados e foram incluídos neste estudo. Os espécimes, embebidos em parafina fixadas em formalina arquivados foram seccionados em micrótomo rotativo a 4 mm de. Enzima de recuperação de epítopo induzido foi realizada por 0,03% de protease E durante 10 minutos a 37 ° C. O anticorpo anti-PTK6 foi diluída 1/100 em Diluente de Anticorpo com normal (NAD) (Scytek – Logan, UT) e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. reacções de antigénio-anticorpo foram visualizados com o sistema de complexo de biotina-avidina-peroxidase (ABC Elite Vectastain R.T.U. reagente; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). As lâminas foram revistos e expressão PTK6 foi graduada de acordo com a intensidade da coloração citoplasmática da seguinte forma; negativa, sem coloração ou coloração fraca intensidade em menos do que 5% das células; fraco a moderado positivo, fraco a moderado intensitiy; positivo forte, forte intensidade.

Cell Cultures

linhas celulares de cancro pancreático humano de BxPC3, Capan1, Hs766T, Panc1 e MIA PaCa2 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection. BxPC3 foi mantida em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de P /S numa atmosfera humidificada (37 ° C, 5% de CO

2) da câmara. As outras linhas de células foram mantidas em meio DMEM contendo 10% FBS e 1% de P /S.

Análise Western Blot

As células foram lisadas em tampão de lise celular (Cell Signaling Technology) com 1 mM de fenilmetanossulfonilo flúor (Cell Signaling Technology). A concentração de proteína de cada ligado celular foi estimada pelo ensaio BCA (Pierce Chemical). Os lisados ​​celulares contendo total de 20 ug de proteína foram aplicados a 10% de SDS-PAGE e transferidos para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Invitrogen, Grand Island, NY). Depois de ser bloqueadas com solução salina tamponada com Tris com 0,2% de Tween-20 (TBST) contendo 5% de BSA ou leite desnatado durante 4 horas à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com anticorpo em uma diluição apropriada a 4 ° C. Rábano burro conjugado com peroxidase de IgG anti-coelho ou ovelha anti-rato IgG (GE Healthcare, Piscataway, NJ) foram usados ​​como anticorpos secundários e incubada com as membranas a uma diluição 1/3000 por 1 hora. β-actina foi usado como um marcador de controlo de carga para a normalização de cada pista.

silenciamento gênico por RNA de interferência pequeno

Perda de função de análise foi realizada utilizando siRNAs segmentação PTK6 (s11487, Ambion , Grand Island, NY: sentido 5′-CAUCCAUGGUUAAGUCAUAtt-3 ‘, 5′-antisense UAUGACUUAACCAUGGAUGaa-3′) e controle negativo (Silencer Select Negative controle # 2 siRNA, Ambion). Outro par de siRNAs segmentação PTK6 e controle negativo foram utilizadas (PTK6 e controle negativo, Invitrogen, St Louis, MO: Discrição RNAi-PTK6HSS183907 sentido 5’-CAGGCUGUGCGGCACUACAAGAUCU-3 ‘, 5′-antisense- AGAUCUUGUAGUGCCGCACAGCCUG-3’ e discrição RNAi Negative Controlo Médio GC duplex, respectivamente). Cada siRNA (10 nmol /L) foi transfectado em células de cancro pancreático utilizando Lipofectamina ARN IMAX (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O knockdown de um gene alvo foi confirmada em 96 horas por Western blotting

A sobre-expressão de PTK6 por Transfecção estável

PTK6 ADNc humano (ClonelD: 5746034). Foi adquirido a Abrir Biosystems (Pittsburg, PA ) e amplificada por PCR utilizando iniciadores (5′-CCCAAGCTTATGGTGTCCCGGGACCAGGC, e 3′-CGGGATCCTCAGGTCGGGTTCTCGTAGC). O produto de PCR foi inserido no vector de expressão pcDNA3.1-Myc /His-B (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O vector de expressão PTK6 estabelecida foi submetida a análise de sequenciação de ADN para confirmar o inserto correcto dos comprimentos completos de ADNc PTK6. PTK6 vector de expressão ou vector vazio correspondente foram transfectados em células de cancro do pâncreas, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 72 horas da transfecção, as células foram incubadas em meio de cultura contendo concentrações adequadas de G418. Por cultura em meio de selecção containg G418 mais de 2 semanas, células transfectantes estáveis ​​foram selecionados. A expressão da proteína PTK6 foi posteriormente confirmada por transferência Western.

Migração Transwell e Invasion Ensaio

ensaios de migração e invasão Transwell foram realizadas em 24 poços câmaras de Boyden modificadas pré-revestidas com (invasão) ou sem (migração) Matrigel (Transwell-câmara, BD Biosciences, San Jose, CA,). células de cancro pancreático (BxPC3 1 × 10

5 células, Panc1, 5 × 10

4 células, e MiaPaCa2, 7,5 × 10

4 células por poço, respectivamente) em meio isento de soro foram semeadas sobre o trans-membrana na câmara superior com 10% de FBS na câmara inferior como um quimioatractor. Após uma incubação de 24 horas, as células que tinham migrado através da membrana foram fixadas e coradas com Diff-Quik mancha Conjunto (Siemens, Newark, DE). Eles foram então contadas sob ampliação em 5 campos de alta potência selecionados aleatoriamente. Cada ensaio foi realizado em triplicado

Análise Estatística

A comparação dos valores contínuos foi realizada utilizando o teste t de Student e 2-sided

p

-Valores. 0,05 foram considerados significativo.

resultados

status PTK6 Expressão em cancro do pâncreas

Nós comparamos os níveis PTK6 em cinco linhas pancreáticos humanos estabelecidos celulares de cancro (BxPC3, Capan1, Hs766T, MiaPaCa2 e Panc1 ) e tecidos de cancro do pâncreas levado diretamente a partir de 9 pacientes submetidos à ressecção cirúrgica. As transferências de Western demonstrou que as linhas de células pancreáticas 5 PTK6 expressa em vários níveis; BxPC3 e Capan1 expressa PTK6 robusta, enquanto MiaPaCa2 expressa um nível muito mais baixo de PTK6 (Figura 1A). A imunocoloração para PTK6 em tecidos de cancro do pâncreas de 9 pacientes demonstraram que PTK6 foi altamente expressa em 4 pacientes (44%), ligeiramente a moderadamente expressos em 2 pacientes (22%), e não manifestou em tudo em 3 pacientes (33%). No epitélio normal adjacente ducto pancreático, imunorreactivo PTK6 não era detectável em qualquer das amostras foram examinados (Figura 1B).

Um

, expressão endógena de PTK6 em linhas celulares de cancro pancreático humano. expressão PTK6 foi confirmada em 5 linhas celulares de cancro do pâncreas, BxPC3, Capan1, Hs766T, MiaPaCa2 e Panc1 em vários níveis de ocidental-blotting.

B

, imuno-histoquímica staning para PTK6 no pâncreas normal adjacente e tecido câncer pancreático. Enquanto não houve expressão PTK detectável no epitélio ductal pancreático normal adjacente (superior esquerdo), PTK6 foi expressa em vários níveis (de negativo através fortemente positivo) em cancros pancreáticos.

PTK6 Expressão afeta a migração celular e invasão de linhas celulares de cancro do pâncreas

Vários estudos têm sugerido que PTK6 influencia maquinaria celular mediando migração e invasão. [13] – [15] Por conseguinte, a hipótese de que PTK6 é um regulador chave da migração e invasão do cancro do pâncreas e avaliou-se o efeito de diminuição da expressão PTK6 sobre estes comportamentos celulares. Após expressão PTK6 foi suprimido por silenciamento de gene utilizando siRNA (a partir de Ambion) em 3 linhas de células do cancro do pâncreas (Figura 2A), o potencial de migração de células de cancro pancreático foram ensaiados utilizando uma câmara de Boyden. Tal como mostrado na Figura 2B, o silenciamento do gene de PTK6 migração significativamente reduzido em todos os 3 linhas de células do cancro do pâncreas (0,59 vezes na diminuição BxPC3, 0,61 em Panc1, 0,42 MiaPaCa2 em, respectivamente,

P

0,05 para cada um) . potencial invasivo celular foi semelhante ensaiada utilizando câmaras de Boyden Matrigel-revestidas, e invasão foi significativamente reduzida pelo silenciamento do gene de PTK6 em todas as 3 linhas de células de cancro do pâncreas, tal como mostrado na Figura 2C (diminuição de 0,49 vezes na BxPC3, 0,62 em Panc1, 0,39 em MiaPaCa2, respectivamente,

p Art 0,05 para cada). Estes efeitos inibidores de silenciamento de genes PTK6 sobre migração celular e invasão foram confirmados pelas experiências semelhantes usando outras siRNA segmentação seqüência diferente de PTK6 (de Invitrogen) (Figura S2).

A

, PTK6 silenciamento do gene. As células foram transfectadas com PTK6-específica siARN (siARN-PTK6) ou controlo negativo-siARN (siARN-NC) durante 96 horas. Knockdown de expressão PTK6 foi comfirmed por Western-blot. Os números na parte inferior indicam a intensidade relativa das bandas para PTK6 com os controlos correspondentes (normalizado pelo β-actina).

B

,

C

, o efeito do silenciamento de genes PTK6 na motilidade celular (B) e invasão (C). As células foram tratadas com siRNA PTK6-específico ou controlo negativo siRNA durante 48 horas, em seguida, submetido a migração ou ensaio de invasão utilizando câmaras de Boyden com ou sem Matrigel. Gene silenciamento de PTK6 reduzida migração celular em todas as 3 linhas de células do cancro do pâncreas (0,59 vezes na diminuição BxPC3, 0,61 em Panc1, 0,42 MiaPaCa2 em, respectivamente, *

P

0,05 pelo teste t). Da mesma forma, o silenciamento do gene de PTK6 reduzida invasão celular em todas as 3 linhas de células do cancro do pâncreas (diminuição de 0,49 vezes na BxPC3, 0,62 vezes na Panc1, 0,39 vezes na MiaPaCa2, respectivamente, *

P

0,05 por t-teste). Cada ensaio foi realizado em triplicado.

Por outro lado, nós próxima avaliou o efeito da superexpressão PTK6 sobre migração e invasão. Um vector de expressão codificando ADNc de comprimento completo PTK6 foi transfectado em células Panc1 e MiaPaCa2 e transfectantes estáveis ​​que sobreexpressam PTK6 foram estabelecidas para cada linha celular (Figura 3A). Em contraste com o efeito de silenciamento de genes PTK6, PTK6 superexpressão aumento da migração celular e invasão comparado com os controlos. (Aumento de 1,6 /1,7 vezes em Panc1 e 1.4 /1.6 em MiaPaCa2, sobre o potencial migratório e invasivo, respectivamente,

p Art 0,05) (Figura 3B, 3C) Estes resultados sugerem que a expressão PTK6 no pâncreas câncer está associado ao seu potencial migratório e invasivo celular.

A

, superexpressão de PTK6. As células foram transfectadas com pcDNA3.1-Mock (vector vazio) ou pcDNA3.1-PTK6. A sobre-expressão de PTK6 em trasfectant estável foi confirmada por transferência Western em células MiaPaCa2 e Panc1, respectivamente. Os números na parte inferior indicam a intensidade relativa da banda para PTK6 com os controlos correspondentes (normalizado pelo β-actina).

B

,

C

, o efeito da superexpressão PTK6 sobre a migração celular (B) e invasão (C). células transfectantes estabelecidos foram avaliados com ensaios de migração e invasão. a sobre-expressão forçada de PTK6 aumento da migração celular em células do cancro do pâncreas e Panc1 MiaPaCa2 (aumento de 1,6 vezes para Panc1, e 1,4 vezes para MiaPaCa2, respectivamente, *

P

0,05 pelo teste t). Da mesma forma, a sobre-expressão forçada de PTK6 aumento invasão celular nestas linhas de células 2 (aumento de 1,7 vezes para Panc1, e 1,6 vezes para MiaPaCa2, respectivamente, *

P

0,05 pelo teste t). Cada ensaio foi realizado em triplicado.

MAPK /ERK sinalização é um mediador crítico no celular relacionados com PTK6 Motilidade

Para elucidar o mecanismo no qual PTK6 regula a migração celular e invasão, nós exploradas vias a jusante para PTK6 sinalização. Várias moléculas de sinalização tenham sido previamente relatado para ser a jusante de PTK6, incluindo STAT3 [16], Akt [17], [18], ERK5 [15], [19], MAPK p38 [19], e ERK1 /2 [20] (revisto em Ostrander 2010). Quando a expressão PTK6 foi manipulada utilizando siRNA, a fosforilação da STAT3, Akt, MAPK e p38 não foram alteradas de forma consistente entre 3 linhas de células testadas (Figura S1). A activação de ERK5 não era detectável nos nossos estudos (dados não mostrados) Em contraste, activado (phospholylated) ERK1 /2 foi significativamente reduzida em todas as células de cancro do pâncreas PTK6-silenciado do gene em comparação com as células de controlo correspondentes, enquanto que a sobre-expressão forçada de PTK6 induzida activação de ERK1 /2 em ambas as células e Panc1 MiaPaCa2 (Figura 4A.B). ERK1 /2, portanto, emergiu como o candidato para o mediador da motilidade celular PTK6-regulada no câncer de pâncreas e consequentemente procuraram determinar se os efeitos da PTK6 sobre migração celular e invasão depende da atividade do ERK1 /2. Utilizou-se o inibidor selectivo de ERK1 /2, U0126 para inibir a actividade de ERK1 /2. Como mostrado na Figura 5A, PTK6 induzida por activação de ERK /1/2 foram completamente bloqueadas pelo U0126 a 10 uM. Quando ensaiadas a migração celular e invasão de células 2 Panc1 MiaPaCa e na presença de U0126, U0126 reduzida migração celular e invasão da base e aboliram a capacidade de sobre-expressão PTK6 estimulá-las (Figura 5B). Isto sugere que PTK6 regula a migração celular e invasão através ERK1 /2.

A

, Efeito de silenciamento de genes PTK6 no total de ERK1 /2 e ativado (fosforilada) ERK1 /2. Gene silenciamento de PTK6 reduziu o nível de ERK1 /2 em todas as 3 linhas de células do cancro do pâncreas. Os números na parte inferior indicam a intensidade relativa da banda para pErk1 /2 com os controlos correspondentes (normalizado pelo total de ERK1 /2).

B

, Efeito da superexpressão PTK6 sobre o total ERK1 /2 e ERK1 activado /2. Forçado a sobre-expressão induzida por activação PTK6 de ERK1 /2 em ambas as células e Panc1 MiaPaCa2. Os números na parte inferior indicam a intensidade da banda relativa para pErk1 /2 com os controlos correspondentes (normalizada pelo total de ERK1 /2).

A

, as células foram tratadas com o ERK1 específica /2 inibidor, U0126 a 10 uM durante 24 horas. ERK1 /2 foi inibida fosforilação e activação de ERK1 /2 PTK6 induzida não foi detectada em células Panc1 ou MiaPaCa2.

B

, o efeito da ERK1 /2 inibição da migração celular (

esquerdo) e invasão (

direito

) ERK1 2 inibição /não só reduziu a migração basal e invasão em Panc1 e células MiaPaCa2, mas aboliu o efeito de PTK6-superexpressão sobre migração e invasão. *

p Art 0,05 vs controle correspondente com o veículo DMSO (pelo

t

-teste). **

p Art 0,05 vs células PTK6-sobre-expressos com veículo DMSO (pelo

t

-teste). Cada ensaio foi realizado em triplicado.

Discussão

Embora não haja uma evidência acumulada de que PTK6 é expressão aberrante em vários cancros epiteliais, a implicação de expressão PTK6 e seu papel na biológica comportamento dos cancros são controversos e mal definida. Na verdade, o papel e a função de PTK6 se acredita grandemente dependente do contexto em que é expressa PTK6. Por exemplo, PTK6 tem sido extensivamente estudada em cancros da mama para a sua

Pro

papéis -oncogenic incluindo a progressão do ciclo celular [21], a angiogénese [22], a resistência anoikis [23] e a migração celular [13], enquanto PTK6 foi mostrado para trabalhar

anti

-oncogenically em câncer de esôfago [24]. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a investigar a expressão e a função de PTK6 em células de câncer de pâncreas.

A nossa principal conclusão deste estudo é que PTK6 superexpressão aumentos de migração celular e invasão e que o silenciamento do gene PTK6, em contraste, diminui-los em células de cancro pancreático. Os efeitos da PTK6 sobre migração celular pode variar entre os tipos de cacners. Nos estudos de células de cancro da mama, PTK6 foi relatado para aumentar a migração celular induzida por EGF [13] – [15], [19], enquanto que a sobre-expressão de PTK6 foi relatado para aumentar o potencial invasivo celular através da indução de tradução mesenquimais epitelial (EMT) em células de câncer de próstata [25]. Em contraste, Ma et al relataram que PTK6 diminui a migração de células de cancro esofágico [24]. Estes relatórios aparentemente opostas sobre a influência de PTK6 na biologia do cancro destacar a importância de estudos que investigam os efeitos de sinais individuais em diversos tipos de cânceres. Parece provável que os efeitos de PTK6, como muitos outros sinais, depender da kinome geral na qual o PTK6 é expresso. Entender as diferenças entre kinomic cancros em que PTK6 promove a migração e aqueles em que inibe a migração pode ser um assunto fértil para o estudo futuro. Várias moléculas efectoras a jusante associadas com PTK6 foram anteriormente identificadas em outros cancros. Estes incluem p190RhoGAP, Rho, RAS [14], Rac1, Paxillin [13], p38MAPK e ERK5 [15], [19] no câncer de mama, e AKT, GSK3β e βCatenin [24], em câncer de esôfago. No presente estudo de várias linhas de células de cancro do pâncreas, a maioria das moléculas que têm relatado previamente para ser associado com a sinalização PTK6 em outros cancros não se alterou em actividade pela manipulação da expressão PTK6. Por conseguinte, é menos provável que estas moléculas desempenham um papel na mediação do efeito de PTK6 sobre a migração celular /invasão de cancro pancreático. Em vez disso, ERK1 /2 emergiu como um mediador a jusante chave do sinal de PTK6-associado que regula invasão câncer pancreático. ERK1 /2 é um membro da família da proteína cinase activada por mitogénio (MAPK) e é conhecido para influenciar a migração celular e invasão em vários cancros, incluindo o cancro pancreático [26], [27]. Os mecanismos pelos quais a sobre-expressão PTK6 induz a activação de ERK1 /2 tem ainda a ser determinado e não se sabe se PTK6 interage directamente com a ERK1 /2. Castro e Lange relatado que em células de cancro da mama do complexo /ERK5 PTK6 é crítico para a migração celular induzida por factor de crescimento, enquanto PTK6 ainda aumenta a migração celular por activação de ERK1 2 /em queratinócitos ERK5 quando é batido para baixo [15]. Eles especularam que a ERK1 /2 pode servir como uma via alternativa para os sinais PTK6 /ERK5, em alguns tipos de células que não possuem ERK5. Este modelo seria consistente com nossas observações, uma vez que não foram capazes de detectar a atividade ERK5 em células de câncer de pâncreas, independentemente do status expressão PTK6. No entanto, Xiang et ai demonstraram que PTK6 liga-se directamente ao erb-B2 e ativa ERK1 /2 em células de cancro da mama. Erb B2 é bem conhecido por ser sobre-expresso comumente em cancros pancreáticos [28], [29] de modo que este pode ser um possível mecanismo pelo qual forçado PTK6 superexpressão em células de câncer de pâncreas poderia ativa ERK1 /2 sem atividade ERK5.

foi interessante notar que, enquanto expressão PTK6 era uniformemente indetectável em células pancreáticas histologicamente normais adjacentes duto epiteliais, os níveis PTK6 variaram substancialmente entre os cânceres de pâncreas que estudamos. a sobre-expressão de Abberant de PTK6 foi descrito em outros tipos de cancros e tem sido sugerido anteriormente que PTK6 pode ser útil como biomarcador para prever os resultados de doentes com vários cancros, incluindo o da mama, cabeça e pescoço, ovário e pulmão [6], [12 ], [30] – [33]. O potencial valor prognóstico da variação de PTK6 em câncer pancreático aguarda um estudo mais aprofundado.

Em resumo, demonstramos que PTK6 é expresso de forma aberrante em câncer pancreático. Além disso, nossos resultados sugerem que PTK6 podem promover a migração celular e invasão no câncer de pâncreas, ativando ERK1 /2. Outras investigações da via de sinalização PTK6-dependente que impulsiona invasão no câncer de pâncreas pode destacar a importância potencial de prognóstico e terapêutica deste sinal romance em câncer pancreático.

Informações de Apoio

Figura S1.

Efeito de silenciamento do gene PTK6 sobre a actividade de várias moléculas em vias de sinalização; p38, STAT3, e AKT foram testados tal como foram previamente relatado para ser associado com PTK6. A atividade dessas moléculas não foram consistentemente afetados por silenciamento de genes de PTK6 em 3 linhas celulares de cancro do pâncreas, BxPC3, Panc1 e MiaPaCa2

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096060.s001

(TIF)

Figura S2.

A

, os efeitos do silenciamento de genes PTK6 no total de ERK1 /2 e fosforilada ERK1 /2, utilizando siRNA. Digno de nota, o siARN utilizado nesta experiência tem sequência diferente PTK6 segmentação do siARN utilizado na experiência em Figuer 2 e 4. A ERK1 /2 foram reduzidos por silenciamento do gene PTK6 em ambas as células e Panc1 MiaPaCa2. Os números na parte inferior indicam a intensidade da banda relativa para PTK6 e pErk1 /2 com os controlos correspondentes, respectivamente (normalizado pelo β-actina para PTK6 total e ERK1 /2 para pErk1 /2).

B

, o efeito do silenciamento de genes PTK6 na migração de células (esquerda) e invasão (à direita). Gene silenciamento de PTK6 reduzida migração celular em células MiaPaCa2 Panc1 e diminuição (0,65 vezes em Panc1, 0,72 MiaPaCa2 em, respectivamente, *

P

0,05 pelo teste t). Além disso, o silenciamento do gene de PTK6 reduzida invasão celular em células MiaPaCa2 Panc1 e diminuição (0,48 vezes em Panc1, 0,78 vezes na MiaPaCa2, respectivamente, *

P

0,05 pelo teste t). Cada ensaio foi realizado em triplicado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096060.s002

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos a William S. Spielman, Amy S. Porter, e Kathy A. Joseph para assistência técnica.

Apresentado em parte, como um cartaz na Reunião anual da Sociedade de Cirurgia do Trato alimentar, 18 de maio

th-21

th, 2013, Orlando, FL.