Abstract

células estreladas pancreático (PSCs) desempenham um papel crucial no comportamento agressivo de câncer pancreático. Embora heterogeneidade de unidades tenha sido identificado, as diferenças funcionais permanecem obscuros. Nós caracterizado CD271

+ PSCs em câncer pancreático humano. Imuno-histoquímica para CD271 foi realizada por 31 tecidos pancreáticos normais e 105 adenocarcinomas do ducto pancreático (PDACs). Foi realizada citometria de fluxo e RT-PCR quantitativo, e avaliaram a expressão de CD271 em unidades isoladas a partir de tecidos pancreáticos e as alterações na expressão de CD271 em unidades co-cultivadas com células cancerosas. Investigou-se também o padrão de expressão de CD271 num modelo de murganho de xenoenxerto de SCID. Nas análises de imuno-histoquímica, as taxas de coloração de alta CD271 em estroma pancreático em tecidos e PDACs pancreáticas normais foram 2/31 (6,5%) e 29/105 (27,6%), respectivamente (p = 0,0069). Em PDACs,

+ CD271 células estromais foram frequentemente observadas na borda em vez de no centro dos tumores. elevada expressão do estroma CD271 foi associada com um bom prognóstico (p = 0,0040). As análises de citometria de fluxo demonstrou taxas de CD271-positivos em unidades foram 0-2,1%. As análises RT-PCR quantitativa revelou que a expressão de ARNm de CD271 foi aumentada em unidades após a co-cultura com células de cancro do pâncreas. No entanto, o nível de expressão de ARNm de CD271, subsequentemente, diminuiu após o aumento transitório. Além disso, a expressão do mRNA CD271 foi diminuída em PSCs migrando para células de cancro do pâncreas através Matrigel. No modelo de xenotransplante, CD271

+ PSCs estavam presentes no tumor margens /periferia e estavam ausentes no núcleo do tumor. Em conclusão, CD271 foi expressa em unidades em torno dos tumores pancreáticos, mas não no centro dos tumores, e expressão diminuída após um longo cocultura com células de cancro pancreático ou após o movimento em relação às células de cancro do pâncreas. Estes achados sugerem que CD271

+ PSCs aparecem na fase inicial da carcinogênese pancreática e que a expressão CD271 é significativamente correlacionada com um melhor prognóstico em pacientes com PDAC

Citation:. Fujiwara K, Ohuchida K, K Mizumoto , Shindo K, D Eguchi, Kozono S, et al. (2012) CD271

+ subpopulação de células pancreáticas estreladas correlaciona-se com prognóstico do câncer de pâncreas e é regulada pela interação com as células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e52682. doi: 10.1371 /journal.pone.0052682

editor: Hidayatullah G. Munshi, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de julho de 2012; Aceito: 19 de novembro de 2012; Publicação: 27 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Fujiwara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por números de subvenção JSPS KAKENHI 24-1237, 23390327, 24659613, 23659654, 24390319, 22591524, 23659655, 23-11109, 24390318. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação de o manuscrito

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é um dos cânceres mais letais, e seus 5 anos taxa de sobrevivência é de apenas 4% [1]. É caracterizada pela excessiva desmoplasia, que desempenha um papel crucial no seu comportamento agressivo [2], [3]. Recentemente, pesquisas sobre biologia do câncer tem se concentrado em interações câncer estroma. As interacções entre as células cancerosas e tecidos estromais são essenciais para o desenvolvimento e progressão de tumores [4]. Terapias enfocadas interações câncer do estroma pode representar uma nova abordagem para o controle do câncer de pâncreas.

células estreladas pancreáticas (PSCs) foram identificados como a principal fonte da matriz extracelular excessiva observada em pancreatite crônica e adenocarcinoma do pâncreas [ ,,,0],5], [6]. Semelhante a células estreladas hepáticas, um tipo de células importantes para a produção de matriz extracelular na fibrose hepática, armazenar unidades gotículas de gordura contendo vitamina A no seu citoplasma [7]. PSCs são ativados por estimulação por vários fatores autócrinos ou parácrinos. Eles expressam actina de músculo α-liso (α-SMA) e produzir diferentes proteínas da matriz extracelular [8], [9]. fatores solúveis secretados pelas unidades ativadas promover a proliferação, migração, invasão e sobrevivência das células de câncer de pâncreas contra gemcitabina [10]. Assim, unidades desempenham um papel importante nas interacções cancro de estroma no cancro pancreático.

Vários relatórios sugerem que as células do estroma, tais como miofibroblastos e células mesenquimais, isolado a partir de vários tecidos humanos exibem fenótipos diferentes [11], [12 ]. Nós relatado anteriormente que CD10

+ PSCs melhorar a progressão de células de cancro pancreático [13]. Estas observações indicam que PSCs têm heterogeneidade funcional e ainda sugerem que PSCs podem conter várias outras subpopulações de células que individualmente ou em sinergia afetam a progressão do cancro pancreático. caracterização detalhada das unidades de atendimento em câncer pancreático ajudaria a esclarecer o mecanismo subjacente as interações entre células cancerosas e células do estroma, e pode fornecer novos alvos para terapias direcionadas-estroma.

CD271 (também conhecido como receptor do factor de crescimento do nervo , NGFR ou p75NTR) é um receptor de neurotrofina que tem sido implicado na regulação do crescimento parácrino de um número de tipos de tumor neuronais e não neuronais [14], [15]. Estudos recentes têm-se centrado em CD271 porque ele foi identificado como um marcador de células estaminais mesenquimais humanas [16] e foi avaliado como um importante marcador de células estaminais cancro melanoma em [17]. CD271 pode ser um marcador de uma subpopulação específica funcional, tal como stemness. No pâncreas, CD271 expressão em unidades foi detectada [18]. No entanto, a expressão CD271 diminui rapidamente após o isolamento de células a partir de tecidos pancreáticos [19]. Portanto, o papel da expressão CD271 em PSCs permanece obscuro.

O objetivo deste estudo foi identificar as unidades específicas que afetam a progressão das células cancerosas, concentrando-se na expressão de CD271. Foram avaliados ainda mais o significado da expressão CD271 em PSCs.

declaração de Ética Materiais e Métodos

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Kyushu (número de aprovação, 23 -64) e conduzida de acordo com as Diretrizes éticas para Genoma Humano /Gene Research promulgada pelo governo japonês e da Declaração de Helsinki. Todos os pacientes assinaram documento de consentimento informado, que aprova o uso de seus tecidos para fins de investigação não especificados. Para todos os experimentos envolvendo ratos, os animais foram alojados em armários de fluxo laminar sob condições específicas isentos de agentes patogénicos em locais aprovados pela Universidade de Kyushu (número de aprovação, A24-112-0).

Pacientes e tecidos pancreáticos

tecidos de câncer pancreático foram obtidos a partir de 105 pacientes que se submeteram à ressecção pancreática para câncer de pâncreas em nossa instituição. As características clinicopatológicas dos pacientes estão descritos na Tabela S1. A sobrevivência foi medido a partir do momento da ressecção pancreática até à morte. O prognóstico foi determinada em setembro de 2011. O tempo médio de sobrevida global foi de 23,5 meses (variação, 1-114 meses). Sessenta e dois pacientes morreram durante o acompanhamento. Todos os tecidos adjacentes para os espécimes foram avaliados histologicamente de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde. O estágio do tumor foi avaliada de acordo com a União de Controle do Câncer Internacional (UICC). Também obtivemos 31 amostras normais pâncreas (NP) a partir de tecidos do pâncreas intactas ressecados para o cancro do ducto biliar, tumor neuroendócrino ou tumor sólido-pseudopapilar benigna para o uso como tecidos de controle. Nós ainda recolhidos 10 neoplasia intra-epitelial pancreáticas (pancreáticas intraepiteliais) e 39 amostras intraductais papilar mucinoso neoplasia (IPMN).

procedimentos de imuno-histoquímica e avaliação

coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando um Kit Histofine SAB-PO (Nichirei , Tóquio, Japão). Os tecidos foram seccionados a uma espessura de 4 mm e foram incubadas com anticorpo monoclonal de rato anti-CD271 (1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou anticorpo monoclonal de ratinho anti-α-SMA anticorpo (1:50; Dako, Glostrup , Dinamarca) durante a noite a 4 ° C. As células foram imunocoradas ser considerada positiva quando o citoplasma ou membrana foi corada. Identificamos activado PSCs com base na morfologia celular (células fusiformes) e suas identidades foram confirmadas por coloração α-SMA. Nós contado o número de células em, pelo menos, 10 campos por secção em 200 × ampliação. Para ter em conta a heterogeneidade de expressão de CD271, CD271 a distribuição de imunocoloração foi avaliada como percentagens de células coradas e pontuadas como se segue: 0, 0%; 1, 25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; ou 4, 76-100%. Do mesmo modo, a intensidade da coloração foi pontuada como se segue: 0, sem coloração; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; ou 3, de coloração forte. Finalmente, calculamos a pontuação coloração multiplicando a pontuação percentual pelo escore de intensidade. Nas células de câncer pancreático, dividimos as amostras em alta coloração 3 e baixa coloração 2 grupos. Todas as lâminas foram avaliadas independentemente por dois investigadores sem qualquer conhecimento das características clínicas de cada caso.

Células e condições de cultura

PSCs humanos foram isolados de espécimes cirúrgicos pancreáticos frescos utilizando o método de crescimento em nossa laboratório [5], [20]. O tipo de célula CPS foi confirmada pela morfologia (células estreladas semelhante ou fusiformes) e por coloração de imunofluorescência para α-SMA e vimentina [10], [13], [20]. PSC 1 e PSC3-9 foram isoladas de câncer pancreático. PSC2 e PSC10 foram isolados a partir de cistos de pâncreas benigna. PSC11 e pSC12 foram isolados a partir da área de pâncreas normal dos tecidos de cancro do pâncreas. Além disso, avaliou-se duas linhas celulares de cancro do pâncreas, SUIT-2 (Ciências da Saúde Research Resources Bank, Osaka, Japão) e Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). SK-N-MC, uma linha celular de neuroepitelioma humano (American Type Culture Collection), foi adquirido como um controlo positivo para a expressão de CD271. As células em passagens 3 a 8 foram utilizadas para ensaios. As células foram mantidas como descrito anteriormente [21].

Microscopia confocal

imunofluorescência e Laser Scanning-

unidades (1 × 10

5) foram plaqueadas em placas com fundo de vidro (Matsunami , de Osaka, Japão) e incubados durante 24 horas. Em culturas com o sobrenadante, as células foram incubadas em soro bovino fetal a 10% (FBS) /DMEM com sobrenadante derivado de células de cancro do pâncreas, durante 72 horas. As células foram então fixadas com metanol, bloqueadas com 3% de albumina de soro de bovino em solução salina tamponada com fosfato (PBS), e incubadas com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-α-SMA (1:50; Dako), um monoclonal anti-coelho anticorpo vimentina (01:50; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) e um anticorpo monoclonal de ratinho anti-CD271 (01:50; Santa Cruz Biotechnology) durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente, as células foram incubadas com IgG Alexa 488-conjugado anti-ratinho ou anti-IgG de coelho conjugado 546 (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 1 hora. ADN nuclear foi contrastado com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (0,05 ug /mL). Um laser de varredura confocal microscópio de fluorescência.; Foi utilizado (A1R Nicon, Tóquio, Japão), e as imagens foram gerenciados usando software NIS-Elements (Nikon)

A citometria de fluxo análise

As células cultivadas foram obtido a partir de culturas em monocamada subconfluentes e incubadas com um isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated CD271 anti-anticorpo (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). IgG1 de ratinho de controlo de isotipo K FITC (Miltenyi Biotec) foi utilizado como um controlo negativo. As células marcadas foram analisadas por citometria de fluxo utilizando um FACS Calibur (Becton Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ).

em tempo real quantitativa de RT-PCR (qRT-PCR)

O ARN total extraiu-se a partir de células cultivadas usando um Kit de Isolamento de RNA High Pure (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e ADNase I (Roche Diagnostics). Em tempo real de qRT-PCR foi realizada utilizando um Kit de QuantiTect SYBR Green transcrição reversa-PCR (Qiagen, Tóquio, Japão) e um sistema Chromo4 Real-Time PCR Detection (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primers para CD271 e β-actina foram adquiridos a partir de Takara Bio Inc. (Tóquio, Japão). As sequências dos iniciadores oligonucleotídicos utilizados neste estudo foram os seguintes: CD271, 5′-TCAGTGGCATGGCTCCAGTC-3 ‘(directo) e 5′-GCAGTATCCAGTCTCAGCCCAAG-3′ (inverso); p-actina, 5’- TGGCACCCAGCACAATGAA-3 ‘(directo) e 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ (inverso). Cada mistura reaccional foi inicialmente incubadas a 50 ° C durante 30 min para permitir a transcrição reversa. A amplificação por PCR foi então iniciada por incubação a 95 ° C durante 15 minutos para activar a polimerase, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 20 s, e 72 ° C durante 30 s. Os níveis de expressão de genes foram calculadas utilizando uma curva padrão construída usando o RNA total a partir de células SK-N-MC. Os níveis de expressão foram normalizadas para os níveis de expressão de p-actina como controlo interno, e expressos como a razão da expressão do gene alvo para a de β-actina. Todas as amostras foram realizadas em triplicado. Nenhum produto de PCR detectáveis ​​foram amplificados sem transcrição reversa antes. A precisão e integridade dos produtos de PCR foram confirmados usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA).

In vitro co-cultura sistema

In vitro

co-culturas foram realizadas utilizando cultura de células de 6 poços inserir placas de companhia e inserções de cultura de células de 3,0 mícrons (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) como previamente descrito [22]. células SUIT-2 e Capan-2 (5 x 10

5) foram semeadas separadamente em câmaras superiores às 24 horas após a sementeira dois tipos de unidades (5 × 10

5) para dentro das câmaras inferiores.

Cultura com um sobrenadante derivado de células do cancro

células SUIT-2 e Capan-2 foram cultivadas em FBS livres condições durante 48 horas. Em seguida, foram coletados os sobrenadantes das células cancerosas e ajustou-los a 10% de FBS. Os sobrenadantes derivados de células cancerosas, em seguida, foram adicionados a unidades previamente semeadas para a cultura subsequente.

A separação funcional pelo ensaio de invasão de Matrigel

de seis cavidades de cultura de células placas de inserção de companhia e inserções de cultura de células de 8,0 mícrons (Becton Dickinson Labware) foram revestidas com Matrigel (150 ug /poço; BD Biosciences, Bedford, MA). Unidades (5 × 10

5 células /2 mL) foram semeadas em câmaras superiores. Anteriormente, as células cancerosas (5 × 10

5) foram semeadas em câmaras inferiores. Em seguida, as células foram cultivadas durante 72 horas. Posteriormente, as células removidas de ambos os lados das câmaras superiores utilizando tripsina. Após duas centrifugações, extraímos ARNm a partir das células. Cada experimento foi realizado em poços em triplicado, e experimentos independentes foram repetidas três vezes.

experimentos in vivo

SUIT-2 pancreáticas células cancerosas e dois tipos de unidades foram utilizados para

In vivo

experimentos. As células foram divididas em três grupos, compreendendo células SUIT-2 sozinho, SUIT-2 com células pSC1, e as células Terno-2 com células PSC2. células SUIT-2 (5 x 10

5) e unidades (5 × 10

5) em suspensão em 100 uL de PBS foram cotransplanted na cauda do pâncreas de 6 semanas de idade, ratinhos SCID fêmea (Fox Chase SCID® , CB-17 /lcr-scid /scidJcl; Clea Japan Inc., Tóquio, Japão). Seis ratos foram usados ​​em cada grupo. Os tumores foram ressecados nos dias 8, 15, e 22 após a implantação. Os tecidos foram fixados em 10% de formalina neutra tamponada e embebidos em parafina. Quatro uM secções de tecido foram coradas com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-α-SMA (Dako) e um anticorpo monoclonal de coelho anti-CD271 anticorpo (Millipore, Billerica, MA).

A análise estatística

Valores são expressos em média ± SD. As comparações entre os dois grupos foram realizadas usando Estudante de

t

-teste. A significância estatística foi definida como valores de P 0,05. A χ

2 teste foi utilizado para analisar as correlações entre a expressão CD271 e as características clínico-patológicas observadas nas análises de imuno-histoquímica. análises de sobrevida foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier e as curvas foram comparadas pelo teste de log-rank. Avaliar os fatores prognósticos independentes associados à sobrevida, utilizou-se uma análise de regressão de riscos proporcionais de Cox multivariada, com expressão CD271, a categoria pT, metástase linfonodal, estágio UICC, invasão perilinfática, invasão perivascular, ea margem patológica como co-variáveis. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP 8,0 software (SAS Institute, Cary, NC).

Resultados

células do estroma expressam CD271 em adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC)

Para avaliar expressão CD271 em tecidos pancreáticos, foi realizada imuno-histoquímica para CD271. Consistente com um relatório anterior [23], observou-se forte coloração de nervos como um controlo positivo. As células epiteliais de ductos pancreáticos normais não mostraram expressão de CD271 e as células foram PDAC não corado. No pâncreas normal (NP), células estromais em torno do ducto pancreático raramente foram coradas (Figura 1A-a). No entanto, observou-se que as células estromais foram fortemente coradas em torno de neoplasia intra-epitelial pancreáticas (pancreáticas intraepiteliais) (Figura 1A-b) e neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN) (Figura 1A-C). Nos tumores PDAC, células estromais em torno de células de câncer pancreático foram parcialmente manchado. No entanto,

+ CD271 células do estroma não estavam adjacentes às células cancerosas em PDAC, e foram fortemente corados na borda em vez de no centro dos tumores (Figura 1A-d). CD271 alta coloração em células do estroma estava presente em 6,5% (2/31) dos NP, 30,0% (3/10) dos PanIN, 27,6% (29/105) de PDAC e 84,6% (33/39) dos IPMN. As taxas de alta coloração CD271 foram significativamente mais elevados nas células estromais de IPMN (p 0,0001). E PDAC (p = 0,0069) do que aqueles em células estromais de NP (Tabela 1)

(A) coloração imuno-histoquímica para CD271 em tecidos pancreáticos. (A-A) No pâncreas normal (NP), células estromais raramente coloração positiva para CD271. (A-b, -C) células estromais são fortemente coradas em torno de neoplasia intra-epitelial pancreáticas (pancreáticas intraepiteliais) (b), e neoplasia intraductal mucinoso papilar (IPMN) (C). (A-d) em adenocarcinomas do ducto pancreático (PDAC), células do estroma são em parte manchada, e CD271

+ células estromais não são adjacentes a células de cancro do pâncreas. setas pretas e setas indicam CD271

+ células e nervos como controle positivo nas seções de série. (A-E) α-actina de músculo liso (SMA) é expresso a maioria das células estromais em torno das células cancerosas e túbulos neoplásicas. setas brancas indicam células alfa-SMA nos cortes seriados. ampliação original: 200 ×, inserir: 600 ×. (B) a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier para a expressão alta CD271 no estroma da PDAC. alta expressão do estroma CD271 está associada com um bom prognóstico (p = 0,0040).

expressão do estroma CD271 independentemente correlacionada com bom prognóstico

Foram avaliadas as correlações entre a expressão do estroma CD271 e os fatores clínico-patológicas de PDAC. Embora as diferenças não atingiram significância estatística, o PT1 /pT2, sem metástase linfonodal, UICC fase I, nenhuma invasão perilinfática, nenhuma invasão perivascular, ea margem patológica /negativo foram observados mais frequentemente no grupo coloração CD271high estroma do que no estroma CD271 baixo grupo coloração (Tabela 2). Curiosamente, a expressão do estroma CD271 foi associado com um bom prognóstico no câncer de pâncreas (p = 0,0040) (Figura 1B). Os tempos médios de sobrevivência para alta coloração CD271 e CD271 pacientes de baixo de coloração foram 62 e 18,5 meses, respectivamente. Em seguida, foi realizada uma análise de sobrevida multivariada com base no modelo de riscos proporcionais de Cox para todos os parâmetros encontrados a ser significativo por análises univariadas, incluindo expressão do estroma CD271, a categoria pT, metástase linfonodal, estágio UICC, invasão perilinfática, invasão perivascular, ea margem patológica positividade (Tabela S2). expressão do estroma CD271 foi encontrado para ser um marcador independente de prognóstico em pacientes com câncer pancreático, eo risco relativo de expressão do estroma CD271 foi 0,495 (Tabela 3).

CD271 células estromais são uma subpopulação de PSCs ativados

para caracterizar a CD271

+ células do estroma, foi realizada imuno-histoquímica para a α-SMA, um marcador para PSCs activado, em seções PDAC série. Descobrimos que α-SMA foi expresso na maioria das células estromais em torno das células cancerosas e túbulos neoplásicas (Figura 1A-E). células estromais

+ CD271 foram restritos a áreas com expressão α-SMA forte. Estes resultados indicam que

+ células estromais CD271 são uma subpopulação de unidades ativadas.

expressão CD271 em PSCs humanos

Nós isolado cinco culturas primárias de unidades de tecidos pancreáticos humanos frescos, e sua identidade foi confirmada por imunofluorescência. Unidades foram estreladas semelhante ou em forma de fuso e expressa α-SMA e vimentina (Figura 2A). Em análises de imunofluorescência estes, não se detectou expressão de CD271 em unidades (dados não mostrados). Em seguida, avaliamos a expressão CD271 em 12 culturas primárias de unidades humanas utilizando a citometria de fluxo, e encontrou taxas de CD271-positivos de 0,0-2,1% em PSCs (Figura 2B).

(A) microfotografia Representante da imunofluorescência para a-actina de músculo liso (SMA) (verde) e vimentina (vermelho) em PSCs. Os núcleos foram contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (azul). PSCs mostram uma morfologia estrelada-like ou em forma de fuso e expressar α-SMA. Ampliação original: 200 ×. (B) As taxas positivas de expressão CD271 em PSCs são 0,0-2,1% em citometria de fluxo analisa. imagens de citometria de fluxo representativas de CD271 em unidades ativadas também são mostrados (direita).

CD271

+ PSCs são aumentadas através de interações câncer estroma

Foram investigados os efeitos de PSCs sobre o fenótipo das células cancerosas, utilizando um sistema de co-cultura. Foram utilizadas duas linhas de células de câncer pancreático, Fato-2 e Capan-2, e duas culturas primárias de unidades humanas isoladas de PDAC e cistos pancreáticos benignas. Depois de monocultura ou co-cultura com células de câncer de pâncreas por 72 horas, avaliamos a expressão CD271 em PSCs utilizando citometria de fluxo e em tempo real qRT-PCR. Por citometria de fluxo de análise, observou-se a percentagem de CD271

+ células na co-cultura foi maior do que em monocultura (0,7% versus 0,1%) (Figura 3A). Por análises em tempo real qRT-PCR, o nível de expressão de ARNm de CD271 em duas culturas de PSCs foi significativamente maior em co-cultura com células de cancro do pâncreas do que no monocultura (p 0,001) (Figura 3B). Em seguida, foram coletados sobrenadante de células cancerosas SUIT-2 de pâncreas, e acrescentou que para duas culturas primárias de unidades. Foram comparados os níveis de expressão de ARNm de CD271 entre monoculturas, culturas com o sobrenadante derivado de células do cancro, e com co-culturas de células de cancro do pâncreas para 72 horas. O nível de expressão de ARNm de CD271 foi mais elevado em co-culturas com células de cancro do pâncreas. Além disso, o nível de expressão de ARNm de CD271 foi maior em culturas com o sobrenadante do cancro derivado de células do que em monoculturas (p = 0,0053) (Figura 3C). Por análises de imunofluorescência, que detectada expressão em unidades CD271 foi ligeiramente aumentado em cultura com o sobrenadante derivado de células do cancro, em contraste com as monoculturas (Figura 3D).

(A) Em análises de citometria de fluxo, a percentagem de CD271

+ é maior do que na co-cultura em monocultura (0,7-0,8% versus 0,1%). (B) Os níveis de expressão de ARNm de CD271 em duas culturas de unidades são significativamente mais elevados em co-culturas com células de cancro do pâncreas do que em monoculturas (p 0,001). (C) O nível de expressão de ARNm de CD271 é mais elevada em culturas com um sobrenadante derivado de células do cancro do que em monoculturas (p = 0,0053). (D) microfotografia Representante da imunofluorescência para CD271 (verde) e α-actina de músculo liso (SMA) (vermelho) em PSCs. Os núcleos foram contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (azul). CD271 foi em unidades ligeiramente expressa em culturas com o sobrenadante derivado de células de cancro, apesar de ter sido difícil de detectar a expressão CD271 em monocultura. Ampliação original: 200 ×. * P 0,01; ** P . 0.001

expressão CD271 diminui após o aumento transitório da expressão quando co-cultivadas com células de câncer pancreático

Foi utilizado um sistema de co-cultura que consiste em duas linhas celulares de cancro do pâncreas, SUIT culturas -2 e Capan-2, e duas unidades de primários humanos para avaliar as alterações dependentes do tempo na expressão de ARNm de CD271. Depois de monocultura ou co-cultura de unidades com células de cancro do pâncreas para 1 a 5 dias, foi avaliado o nível de expressão de mRNA CD271 em PSCs. Em monoculturas, a expressão de ARNm de CD271 em unidades não se alterou. No entanto, em co-culturas com células de cancro do pâncreas, o nível de expressão de ARNm de CD271 aumentada no dia 3 (p = 0,0249) e atingiu um pico no dia 4 (p 0,0001). Interessantemente, os níveis de expressão de ARNm de CD271 diminuiu no dia após a expressão pico (p 0,0001) (Figura 4A). Em seguida, foram coletados sobrenadante de Capan-2 células de câncer pancreático, acrescentou que para duas culturas primárias de PSCs e avaliadas as alterações dependentes do tempo na expressão de mRNA CD271. Em culturas com sobrenadante, o nível de expressão de ARNm de CD271 aumentada no dia 2 (p 0,0001) e em seguida, diminuiu no dia 4 (p 0,0001) (Figura 4B). Semelhante a co-cultura com células de cancro do pâncreas, CD271 expressão diminuída após o aumento transiente na expressão quando co-cultivados com sobrenadante.

(A) as análises em tempo real de qRT-PCR mostrou que os níveis de expressão de ARNm de CD271 em unidades de co-cultura com células de cancro do pâncreas começar a aumentar no dia 3 (p = 0,0249), são mais elevados no dia 4 (p 0,0001), e depois diminuir o dia seguinte depois do pico de expressão (p 0,0001). (B) em culturas com a adição de sobrenadante derivado de células do cancro, o nível de expressão de ARNm de CD271 começou a aumentar no dia 2 (p 0,0001) e em seguida, diminuiu no dia 4 (p 0,0001). (C) Avaliação das diferenças na expressão de CD271, consoante a função de unidades de tempo real de qRT-PCR. O nível de expressão de ARNm de CD271 no topo unidades derivadas do lado, que não se movem em relação às células cancerosas através de Matrigel e manteve-se em câmaras superiores, é mais baixa do que em unidades derivadas do lado do fundo, que se movem em relação às células de cancro do pâncreas através de Matrigel (p 0,01). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, não significativo.

expressão CD271 é diminuído em unidades migratórias através de Matrigel em direção a células de câncer pancreático

Em seguida, avaliamos a expressão CD271 em unidades após a separação funcional, utilizando ensaio de invasão Matrigel. Neste sistema de cultura envolvendo câmaras superiores revestidas com Matrigel, avaliamos SUIT-2 pancreáticas células cancerosas e duas culturas primárias de PSCs humanos. PSCs nas câmaras superiores foram incubadas durante 72 horas em cultura, com as células cancerígenas pancreáticas nas câmaras inferiores, ou como controlos sem células cancerígenas pancreáticas nas câmaras inferiores. PSCs foram coletados a partir dos lados superior e inferior das câmaras superiores separadamente. As unidades derivadas do lado do topo eram células que não migraram em direção às células cancerosas através do Matrigel e permaneceu nas câmaras superiores. As unidades derivadas do lado inferior eram células que migraram para as células de cancro do pâncreas através Matrigel e recolhidos na parte inferior das câmaras superiores. Em seguida, analisamos os níveis de expressão de mRNA CD271 na parte superior ou inferior PSCs derivada do lado de avaliar as diferenças funcionais entre CD271

+ e CD271

– PSCs. O nível de expressão de ARNm de CD271 foi mais elevada na parte superior unidades derivadas do lado após cultura com células de cancro do pâncreas (p 0,001). Curiosamente, o nível de expressão de ARNm de CD271 nas unidades derivadas do lado do fundo que migram para as células cancerígenas pancreáticas foi menor do que no topo unidades derivadas do lado que não se movem em relação às células de cancro (p 0,01). Nos controles, não houve diferenças nos níveis de expressão de mRNA CD271 entre superior e unidades derivadas do lado inferior, e estes níveis eram baixos em comparação com os níveis de expressão de mRNA CD271 em culturas com células de câncer de pâncreas (Figura 4C).

CD271

+ PSCs estão presentes no tumor margens /periferia e estão ausentes no núcleo do tumor

Para avaliar a localização de CD271

+ PSCs

in vivo

, nós transplantado SUIT -2 células de cancro pancreático para a cauda do pâncreas de ratinhos SCID, ou cotransplanted deles com duas culturas primárias de unidades humanos. Nós sacrificados os ratos nos dias 8, 15 ou 22 anos, e avaliaram a localização de CD271

+ PSCs nos tumores de xenoenxerto. expressão do estroma CD271 foi detectada em todos os dias após o transplante, independentemente do transplante ou cotransplantation. Estroma CD271 altas taxas de coloração foram de 50% (06/03), 60% (05/03), e 67% (06/04) nos dias 8, 15, e 22, respectivamente. Em todos os casos, foram detectados CD271 expressão em feixes de nervos como um controlo positivo, e descobriram que as células de câncer de pâncreas nunca expressou CD271. Foi confirmada a presença de unidades accionadas por uma morfologia em forma de fuso e por coloração α-SMA. PSCs activados existia nos tumores de xenoenxerto e áreas pancreáticas normais em torno dos tumores (Figura 5A). No entanto, CD271

+ PSCs só existia nas áreas pancreáticas normais em torno dos tumores de xenoenxerto, e estavam ausentes no núcleo do tumor (Figura 5B).

+ células do estroma (A) α-SMA , como unidades activadas, existem no tumor xenoenxerto e áreas pâncreas normal (NP) (lado esquerdo) em torno do tumor (lado direito) a. (B) Alguns

+ células estromais CD271 estavam presentes na área de NP (lado esquerdo) em torno do tumor de xenoenxerto, e estavam ausentes no núcleo do tumor (lado direito). ampliação original:. 200 ×

Discussão

Anteriormente, Apare et al, [18] relatou que CD271 foi expressa em unidades de atendimento.. Haas et al., [19] também relatado que CD271 foi ligeiramente expressa em unidades e que o nível de expressão de ARNm de CD271 rapidamente diminuiu em unidades primários de rato durante a cultura. Descobrimos que CD271

+ PSCs existia nos tecidos pancreáticos cirúrgicos utilizando imuno-histoquímica. No entanto, qRT-PCR e citometria de fluxo análises revelaram que a expressão CD271 em unidades isoladas a partir de tecidos pancreáticos foi muito fraco. Estes resultados sugerem que a expressão de CD271 em unidades primárias humanas também diminuiu rapidamente durante a cultura.

Descobrimos que a expressão do mRNA CD271 foi transitoriamente aumentada em unidades co-cultivadas com células de câncer de pâncreas, sugerindo que as células de câncer de pâncreas aumentar a expressão CD271 em PSCs. No entanto, as actuais análises de imuno-histoquímica revelou que CD271

+ PSCs também existia em torno PanIN e IPMN, lesões pré-cancerosas. Além disso, a guarnição et al., [18] relatou que CD271

+ PSCs foram encontrados em tecidos de pacientes com pancreatite crônica. Estas observações sugerem que o aparecimento de CD271

+ PSC não é específico para doenças malignas, e está relacionada com a desmoplasia.