PLOS ONE: linhas celulares de cancro da próstata em hipóxia apresentam uma maior Stem-Like Properties

Abstract

A hipoxia é uma importante mudança ambiental em muitos tipos de câncer. hipóxicas nichos pode ser ocupada por cancro de células estaminais /progenitoras semelhantes que estão associados com a progressão do tumor e resistência à radioterapia e quimioterapia. No entanto, ainda não foi totalmente elucidado como hipóxia influencia as propriedades estaminais-como de células cancerosas da próstata. Neste relatório, nós investigamos os efeitos da hipoxia em linhas de células cancerosas humanas da próstata, PC-3 e DU145. Em comparação com normoxia (20% O

2), 7% O

2 induzidas expressões mais elevadas de HIF-1α e HIF-2α, que foram associados com a regulação positiva de OCT3 /4 e Nanog; 1% O

2 induzida ainda maiores níveis desses fatores. O regulada

NANOG

expressão de mRNA em hipóxia foi confirmado para ser predominantemente retrogene

NANOGP8

. As taxas de crescimento similares foram observados para células cultivadas sob condições hipóxicas e normóxicas para 48 horas; No entanto, o ensaio de formação de colónia revelou que 48 horas de pré-tratamento hipoxia resultou na formação de colónias mais. O tratamento com 1% O

2 também estendeu o G

0 /G

1 fase, resultando em mais células populacionais lado, e as expressões de CD44 e ABCG2 induzidas. A hipoxia também aumentou o número de células positivas para a expressão ABCG2, que foram predominantemente encontradas para ser CD44

células brilhantes. Correspondentemente, o CD44 classificadas

células brilhantes expressaram níveis mais elevados de ABCG2, OCT3 /4 e Nanog de CD44

células dim, e pré-tratamento hipóxico aumentou significativamente as expressões desses fatores. CD44

células vivas sob normoxia formado significativamente mais colônias e esferas comparados com os CD44

células dim, e pré-tratamento hipóxico até aumentou este efeito. Nossos dados indicam que as células cancerosas da próstata sob hipóxia possuem maiores propriedades estaminais-como

Citation:. Ma Y, Liang D, Liu J, K Axcrona, Kvalheim G, Stokke T, et al. (2011) linhas celulares de cancro da próstata em hipóxia apresentam uma maior Propriedades Stem-like. PLoS ONE 6 (12): e29170. doi: 10.1371 /journal.pone.0029170

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de agosto de 2011; Aceito: 22 de novembro de 2011; Publicação: 28 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Radium Hospital Foundation Norwegian Research com o número de concessão 333005 para ZS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tumores somáticas, incluindo cancro da próstata, contêm um pequeno subconjunto de células-tronco-like, chamadas de células-tronco do câncer, com capacidades de auto-renovação, diferenciação e início de novos tumores. Tem sido demonstrado que as células estaminais do cancro pode escapar da radioterapia e da quimioterapia, e são capazes de formar tumores metastáticos em outros órgãos [1], [2]. células-tronco cancerosas preferencialmente residir no microambiente hipóxico-nichos específicos, muitas vezes existente dentro dos tumores [3], [4]

Os hipóxia fatores induzíveis (HIFs) são reguladores chave encontrada em células de mamíferos sob baixa tensão de oxigênio.; eles estão envolvidos com múltiplas funções, tais como a sobrevivência celular, angiogénese, e manutenção de células estaminais, e desempenham um papel essencial na homeostase celular e sistémica, em resposta à hipoxia [5]. HIFs são heterodímeros;

HIF1A

(HIF-1α) e

EPAS1

(HIF-2α) são os dois principais isoformas da subunidade α, e partilham um elevado grau de homologia de sequência. OCT3 /4 (também chamado POU5F1) e Nanog são marcadores de células estaminais embrionárias que são importantes para a transcrição e na manutenção da auto-renovação das células estaminais embrionárias e as células germinativas primordiais. Eles também têm sido identificados em diferentes tumores, incluindo somáticas cabeça e pescoço, pulmão, colo-rectal, do ovário, da próstata e cancros [6] – [11]. Comparativamente, as expressões destes genes são regulados negativamente em todos os tipos de células somáticas diferenciadas,

in vitro

, bem como

in vivo

[12], [13].

NANOG

, também chamado

NANOG1

, tem vários pseudogenes, e entre eles

NANOGP8

tem mais tarde foi confirmado para ser um retrogene. Ambos

NANOG1

e

NANOGP8

expressões foram identificados em tipos de células cancerígenas diferentes [14], [15], incluindo as células de câncer de próstata [16].

Um número de marcadores de superfície foram utilizados para isolar células estaminais /progenitoras câncer putativos. No cancro da próstata, as células progenitoras precoces estão associados com vários marcadores de superfície específicos, tais como CD44, CD133, e CXCR4 [17] – [19]. tecnologia população lateral também tem sido usado para isolar células estaminais do cancro com a capacidade de bombear para fora a Hoechst 33342 [20]. O efluxo do corante é atribuído aos membros da família de cassete de ligação de ATP, tais como (proteína de resistência do cancro da mama, BCRP) ABCG2. A sobre-regulação de ABCG2 também é responsável pela resistência quimioterapêutico em certas células cancerosas [21]. Em cânceres de mama e próstata, estudos anteriores identificaram CD44

+ ou CD117

+ /ABCG2

+ células com características tronco-like, como o aumento /propriedades tumorigénicas clonog�icas, expressões mais elevados de genes stemness e mais forte capacidade de formar tumores em modelos animais [19], [22], [23].

hipóxia ajuda as células estaminais embrionárias para manter stemness e as tensões mais elevadas de oxigénio conduzem células em proliferação e diferenciação, que são mais susceptíveis à convencional modalidades de tratamento [24], [25]. Resultados semelhantes foram observados em células de adultos, como fibroblastos, adipócitos, e vários tipos de células cancerosas [26] – [28]. No entanto, os efeitos de hipoxia em células de cancro da próstata ainda não foram completamente elucidados. Portanto, no presente estudo examinámos a linhas de células de cancro da próstata PC-3 e DU145 a diferentes tensões de oxigénio, a fim de compreender melhor o efeito da hipoxia nas propriedades estaminais do tipo de células. factores stemness, OCT3 /4 e Nanog, foram expressos em níveis mais elevados em células cultivadas hipóxica e estas células apresentaram elevado potencial de formação de colónia em comparação com as células sob condições normóxicas. Além disso, o regulada

NANOG

expressão de mRNA em hipóxia foi confirmada derivou principalmente do retrogene

NANOGP8

. Nessas linhas celulares de cancro da próstata, hipóxia também aumentou a fração de células da população lado, estendeu o G

0 /G

1 fase e resultou em expressões níveis ABCG2 e CD44 mais elevados. Experimentos adicionais demonstraram que CD44

células brilhantes exibiram significativamente maior stemness, como verificado pelo ensaio de formação de colónias, ensaio de crescimento esfera, e expressão do fator stemness analisa.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas celulares de cancro da próstata humano, PC-3 e DU145, foram adquiridos a partir de ATCC (American Type Culture Collection, EUA) e mantida no nosso laboratório para este estudo. Para a cultura de células convencional, as células foram semeadas em frascos de cultura com meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As culturas foram mantidas a 37 ° C num incubador humidificado numa atmosfera de 20% de O

2, 5% de CO

2, e 75% de N

2.

O Xvivo fechado Incubação (sistema Xvivo 300 C, BioSpherix, Nova Iorque, EUA) foi utilizado neste estudo, a fim de manter com precisão diferentes tensões de oxigénio em câmaras diferentes. Após 24 horas de cultura em cultura de células convencional (permitindo células se fixem sobre os frascos), as células foram transferidas para as câmaras diferentes, com 1% de O

2, 5% de CO

2, e 94% de N

2; 7% O

2, 5% de CO

2, e 88% N

2; ou 20% O

2, 5% de CO

2 e 75% de N

2 por períodos variáveis ​​de tempo antes de ser colhida para análise adicional.

Semiquantitativa transcrição reversa-PCR (RT- PCR)

o ARN total foi extraído a partir das células cultivadas usando o kit RNeasy (Qiagen, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para eliminar qualquer ADN, ADNase I foi utilizado no procedimento de isolamento de ARN. concentrações das amostras de ARN foram quantificados usando um espectrofotómetro (Nanodrop ND-1000, EUA) em DO260 /280.

O DNA complementar (cDNA) foi subsequentemente sintetizado a partir de 5 ug de ARN total, utilizando a transcriptase reversa MultiScribe (Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições de transcrição inversa foram: 25 ° C durante 10 minutos, 37 ° C durante 12 minutos, 85 ° C durante 5 minutos, seguido pela manutenção a 4 ° C. O ADNc foi armazenado a -70 ° C para posterior análise por PCR

A amplificação por PCR do ADNc foi realizada utilizando um sistema de PCR (DOPPIO VWR, Reino Unido) e o seguinte programa:. desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 minutos; seguido de 30 ciclos (28 ciclos para GAPDH) de emparelhamento a 60 ° C durante 30 segundos, e extensão a 72 ° C durante 30 segundos; seguido por terminação com um passo de alongamento de 10 minutos a 72 ° C. Os iniciadores utilizados para RT-PCR foram: para Nanog, F 5′-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘e 5′-R AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3′, amplificação de um fragmento de 66 pb; para OCT3 /4, F 5’-ACATGTGTAAGCTGCGGCC-3 ‘e 5′-R GTTGTGCATAGTCGCTGCTTG-3′, amplificação de um fragmento de 297 pb; para HIF-1α, F 5’-AGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAA-3 ‘e 5′-R CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTATCA-3′, amplificação de um fragmento de 113 pb; para HIF-2α, F 5’-GACCAGCAGATGGACAACTTGTAC-3 ‘e 5′-R CAGAAAGATCATGTCGCCATCTT-3′, amplificação de um fragmento de 84 pb; e para GAPDH, F 5’-CCTCAAGATCATCAGCAATGC-3 ‘e 5′-R TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3’, amplificação de um produto de 101 pb. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes

Os produtos de PCR amplificados foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida a 7,5%, corado com GelRed (Molecular Probes, Invitrogen), e visualizado com um sistema de imagem Syngene (L:. BOX Syngene , EUA).

As expressões de mRNA de

NANOG1

e

NANOGP8

foram medidos por PCR quantitativa usando um Sistema Detector Sequence Taqman ABI 7900 (Applied Biosystems). Os iniciadores e sondas específicos publicados [29] foram utilizados neste estudo. Para

NANOG1

: iniciador directo foi 5′- CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT -3 ‘, iniciador inverso foi 5′- AGAAGCCGTCTCTGGCTATAGATAA -3’, e a sonda foi CTGCTAAGGACAACATTGAT; para

NANOGP8

: iniciador directo foi 5′- CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT-3 ‘, iniciador inverso foi 5′- ACGAGTTTGGATATCTTTAGGGTTTAGAATC-3’, e a sonda foi CCTTGGCTGCCGTCTCTG. Todos os iniciadores e sondas marcadas com FAM-MGB foram obtidos de Applied Biosystems. A GAPDH foi usada como um dos valores CT em 20% O

2 controle interno e foram usados ​​como calibradores para avaliar

NANOG1 Comprar e

NANOGP8

níveis de expressão em resposta à hipóxia. Os experimentos foram realizados em duplicado. Os níveis de expressão do

NANOG1

e

NANOGP8

foram analisados ​​através do método ΔΔCt [29].

Immunoblotting

As células foram rapidamente lavadas com gelo frio solução salina tamponada com fosfato (PBS) e raspadas para tampão RIPA (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM de NaCl, 1% NP40, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS; Thermo Scientific Pierce, Alemanha), com inibidores de protease (0,1 uM de aprotinina, PMSF 1,0 mM, leupeptina a 1 uM, 1 jiM de pepstatina) adicionado imediatamente antes da utilização. As amostras foram centrifugadas a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C e os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos. As concentrações de proteína foram medidas com um ensaio de proteína Bio-Rad de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram aquecidas com um aquecedor de bancada (Modelo 111002, Boekel Scientific, EUA), a 100 ° C durante 5 minutos em tampão de SDS-carga (500 mM de Tris-HCl pH 6,8; 10% de glicerol, 2% de SDS, 0,6 M de DTT, 0,05% de azul de bromofenol), e, em seguida, uma quantidade igual de proteína (50 ug) por amostra foi sujeito a 10% SDS-PAGE e transferidos para membrana de transferência de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad, EUA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite seco não gordo em TBS-Tween durante 60 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários a diluição óptima de leite em TBST /5% durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos optimizados utilizados neste estudo incluíram: HIF-1α (1 ug /ml MAB1536, R D), HIF-2α (1 ug /ml de MAB2886, R D), GAPDH (0,2 ug /ml AF5718, R D ), OCT3 /4 (1 ug /ml MAB1759, R D), Nanog (1 ug /ml AF1997, R D), e ABCG2 (0,5 ug /ml B7059, Sigma-Aldrich). As membranas foram depois incubadas com anticorpos e imunocomplexos conjugado com HRP secundário foram visualizados por quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Reino Unido). experiências de transferência de Western foram repetidas pelo menos três vezes.

a preparação de blocos celular

As células foram cultivadas até 80% de confluência e depois foram digeridos com 0,25% de tripsina e EDTA (Invitrogen, EUA), colhido, e centrifugou-se a 2000 rpm durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram descartados, 3 gotas de plasma e 2 gotas de trombina foram adicionados à sedimentação, e os conteúdos foram misturados cuidadosamente por rotação do tubo. Um minuto depois, a mistura foi coagulada e 4% de formalina tamponada foi adicionado ao tubo de fixação. A massa coagulada foi então colocada em papel de linho e utilizado para construir um bloco de parafina pelo processo convencional.

A imunocitoquímica

blocos celulares foram cortados em secções de parafina de 4 ^ m que foram depois desparafinizadas usando PT aparelho -link. Em seguida, as secções foram lavadas com tampão de lavagem DAKO, incubaram-se com peróxido de hidrogénio durante 5 minutos, e, em seguida, incubadas com o anticorpo primário durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos utilizados e as suas concentrações foram: HIF-1α (mouse, 1:200; número de catálogo: NB100-150, Novus), HIF-2α (coelho, 1:100; número de catálogo: NB100-122, Novus), OCT3 /4, (de cabra, 10 ug /ml; número de catálogo: AF1759, R D) e Nanog (cabra, 5 mg /ml; número de catálogo: AF1997, R D)

Depois de mais uma lavagem com DAKO. tampão de lavagem, foi adicionado murganho /coelho reagente FLEX EnVision + Linker e as amostras foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente, seguido por incubação com FLEX EnVision + com HRP durante 30 minutos à temperatura ambiente. As amostras com anticorpos primários de cabra foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com IgG de rato anti-cabra, antes da adição do reagente de rato FLEX EnVision + Linker e FLEX EnVision + HRP como descrito acima. Os cortes foram enxaguados, reacção de cor desenvolvida com o reagente DAB, contrastadas em hematoxilina durante 20 segundos, desidratado, e montado sob tampa de vidro desliza em preparação para avaliação por microscopia.

contagem celular (taxa de proliferação celular)

a proliferação celular foi avaliada pela contagem do número de células usando a célula Contador Electrónica condessa automatizado (Invitrogen, EUA). Após tripsinização, as células flutuantes foram recolhidas para criar uma suspensão de células que não continham agregados de células óbvias. Em cada preparação, 10 ul de suspensão de células foi misturada com corante azul de tripano a 0,4% (1:01) antes de ser carregado para uma lâmina de câmara de contagem de células para contagem das células. O número de células viáveis ​​que eram capazes de excluir o corante foi contado para cada condição experimental. Para cada amostra, o número de células foi contado pelo menos três vezes.

Colónia ensaio de formação de

Usando placas de seis poços, 500 células por poço foram mantidas em tensões de oxigénio de 1%, 7% , e 20% durante 48 horas. Todas as placas foram então colocadas numa incubadora com 20% de O

2 durante 2 semanas para a observação da formação de colónias. As colónias foram fixadas com 4% de formalina tamponada durante 15 minutos, e em seguida corado com 1% de violeta de cristal durante 30 minutos. As placas foram lavadas suavemente com PBS e secas antes da avaliação microscópica de colónias. As colónias que continham mais do que 30 células foram contadas. a eficiência de formação de colónias foi calculada como se segue: eficiência de formação de colónias /= colónias de células de entrada × 100%. Os dados são representativos de três experiências independentes.

ciclo celular análise

Após incubação sob diferentes tensões de oxigénio, incluindo 1% ou 20% de O

2, as células PC-3 e DU145 foram colhidas e fixadas com metanol a -20 ° C durante a noite. Estas células foram utilizadas para preparar uma suspensão de célula única ao qual foram adicionados 1,5 ug /ml de Hoechst 33258 antes de as células foram mantidas em gelo durante 30 minutos. Depois disso, as amostras foram analisadas com um citómetro de fluxo LSRII (Becton Dickinson, San José, CA, EUA).

população lateral ensaio

Células cultivadas em 80% de confluência (aproximadamente 1 x 10

6 células) foram colhidas e suspensas em 1640 contendo soro pré-aquecido de RPMI 2% fetal de bovino e 2 mM de tampão HEPES. Hoechst (solução stock de 1 mg /ml; Sigma) 33342 corante foi então adicionado a uma concentração final de 5 ug /ml, e a mistura foi incubada com intermitente com agitação durante 90 minutos a 37 ° C, na presença ou ausência de verapamil (50 uM; Sigma). Em seguida, as células foram lavadas com HBSS arrefecido em gelo, com 2% de FBS, centrifugada a 4 ° C, e ressuspensas em HBSS gelado contendo 2% de FBS. O iodeto de propídio foi adicionado às células em suspensão a uma concentração final de 2 ug /ml, a fim de revelar as células viáveis. Antes da análise, as células foram filtradas através de um filtro de células de 70 mícrons a obter uma suspensão de célula única. Os agregados celulares foram descartados da análise pela discriminação gibão e células individuais foram analisadas em um LSRII citômetro de fluxo (BD Biosciences). Hoechst 33342 dye estava animado em 350 nm e as células lado a população foram visualizados pelo uso de vermelho (red, 660/10 nm) vs. azul (azul, 424/44 nm) de detecção.

ABCG2 /CD44 e fenótipo de células activadas por fluorescência (FACS)

Após 48 horas de incubação a tensões de oxigénio de 1% e 20%, as células PC-3 e DU145 foram tripsinizadas, contadas, lavadas com tampão FACS frio ( PBS + BSA a 0,03%), e ressuspensas a uma concentração final de 10

6 células /ml. As células foram pré-bloqueadas com 5% de BSA durante 30 minutos em gelo antes de serem coradas com os anticorpos primários (anticorpo monoclonal anti-CD44 conjugado directamente com APC (allophycoyanin) e anticorpo monoclonal anti-ABCG2 directamente conjugado com Fe (phycoerythin); BD Pharmingen Company) em gelo, no escuro, durante 30 minutos. As suspensões de células foram lavadas duas vezes, ressuspensas em 400 ul de tampão de FACS, e filtrou-se através de uma malha de nylon de 70? m. As amostras foram analisadas num citómetro de fluxo (Becton Dickinson, San José, CA, EUA) para a detecção de ABCG2 e CD44, e um classificador de células FACS DiVa foi utilizado para separação de células. Após cultivo a 1% ou 20% de O

2 durante 48 horas, as células PC-3 e DU145 foram classificadas com base na expressão de CD44. Para as células positivas de CD44, apenas as células que expressam de topo 10% foram seleccionados (chamado CD44

brilhante); para as células CD44 negativas, as células que expressam 10% inferior foram isolados (chamado CD44

dim). Para cada amostra, as células viáveis ​​foram fechado e simples; APC rato IgG2b (BD Pharmingen, EUA) e FE rato IgG2b (BD Pharmingen, EUA) controlos isotípicos foram usados ​​como controles negativos.

Sphere ensaio de formação de

O ensaio utilizado foi baseado no descrito anteriormente métodos [30]. Após as CD44

células vivas foram classificados com o método tal como descrito acima, único CD44

brilhante e CD44

células dim foram plaqueadas a uma densidade de 300 células por poço, em fixação ultrabaixa placas de seis poços (Ultra placas de cluster baixos, Life Sciences). Estas células foram cultivadas em meio livre de DMEM /F12 de soro (Invitrogen) suplementado com 20 ng /ml de EGF e 20 ng /ml de bFGF durante dez dias sob condições de normóxia antes de as esferas foram avaliadas sob miscopy inversa e contadas (mais de 30 células dentro de um esfera foi considerado como sendo uma esfera completa). Os dados são representativos de três experiências independentes

Análise estatística

Para cada experiência, os dados são apresentados como média ± SEM de pelo menos três experiências independentes.; SPSS (versão 16.0) foi usada para análise de dados. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste ANOVA one-way e de Student

t

-test (

P Art 0,05 foi considerado significância estatística).

Resultados

hipóxia induz a expressão de HIF-1α, HIF-2α, OCT3 /4 e Nanog

HIF-1α e HIF-2α, os principais fatores de transcrição que respondem à hipóxia, foram examinados em células cancerosas humanas da próstata PC- 3 e DU145 que foram expostos a diferentes tensões de oxigênio por períodos variáveis ​​de tempo. Em 20% O

2 tensão, HIF-1α e HIF-2α foram fracamente expresso em ambos os níveis de mRNA e proteína; níveis relativamente mais elevados de HIF-1α e expressão de HIF-2α foram observados a 7% O

2 tensão, e os níveis mais elevados foram observados em 1% de O

2 tensão (Figura 1A). Em níveis de tensão de oxigénio reduzido, estes dois factores já foram regulados positivamente, após 6 horas de cultura. Suas expressões atingiu os níveis mais altos em 12 horas de cultivo em 7% O

2 tensão, mas chegou a níveis mais altos a apenas 6 horas de cultura em 1% O

2. A expressão da proteína após 48 horas de cultura a diferentes tensões de oxigénio também foi estudada por imunocitoquímica (Figura 1B). As expressões de HIF-1α e HIF-2α foram consistentemente mais elevados nas células tratadas com hipoxia, de acordo com os resultados obtidos por RT-PCR e immunoblotting

.

(A) Em comparação com as células cultivadas em 20 % S

2, as células cultivadas em 7% o

2 mostram os níveis mais elevados de HIF-1α e HIF-2α, e as células cultivadas em 1% de o

2 mostram os níveis mais elevados de HIF-1α e HIF-2α tanto por RT-PCR e immunoblotting. (B) A imunocitoquímica revela níveis superiores de expressão de HIF-1a e HIF-2α nas células cultivadas sob 7% O

2 e os mais elevados níveis de expressão de HIF-1a e HIF-2α nas células cultivadas sob 1% S

2 para ambas as linhas celulares. As secções de carcinoma da mama foram utilizados como controlos positivos para ambos os HIF-1α e HIF-2α. Todas as fotos foram originalmente feita em 200 × e todas as inserções foram tomadas em 400 ×.

OCT3 /4 e Nanog são frequentemente utilizados como marcadores para as células indiferenciadas e desempenham um papel essencial na manutenção da capacidade de auto-renovação em células-tronco adultas [31], [32]. As expressões destes factores de transcrição foram também examinados em células PC-3 e DU145, que foram cultivadas em diferentes tensões de oxigénio. Em ambos os níveis de mRNA e proteína (Figura 2A), expressões fracos da OCT3 /4 e Nanog foram revelados nestas duas linhas de células cultivadas em 20% O

2 tensão, enquanto as suas expressões foram upregulated em células cultivadas sob 7% e 1% O

2 condições. Em ambas as linhas celulares, as expressões de esses dois fatores foram superiores a 1% O

2 do que em 7% O

2. Como também foi observada em análises de imunotransferência (Figura 2A), OCT3 /4 e Nanog começou a aumentar substancialmente tão cedo quanto 6 horas depois as células foram transferidas para 1% O

2, e atingiu níveis máximos às 12 horas tanto para células linhas. Quando as células foram colocadas em 7% O

2, as expressões destes dois factores foram também substancialmente elevada após 6 horas, e atingiu níveis mais elevados em 12 horas de cultura; no entanto, estes níveis de expressão foram menores do que os observados em células expostas a 1% de O

2. Resultados semelhantes também foram obtidos por imunocitoquímica (Figura 2B). Após a exposição a condição hipóxica, reforçada expressões OCT3 /4 e nanog foram observados em ambas as células PC-3 e DU145.

(A) Em comparação com as células cultivadas em 20% de O

2, as células cultivadas a 7% o

2 mostram os níveis mais elevados de expressão OCT3 /4 e nanog, e as células cultivadas em 1% de o

2 mostram os níveis mais altos de expressão OCT3 /4 e nanog em PC-3 e células DU145 linhas por tanto por RT-PCR e immunoblotting. (B) A imunocitoquímica revela correspondente níveis mais elevados de OCT3 /4 e nanog expressões a 7% O

2 e os mais altos níveis de OCT3 /4 e nanog expressões em 1% de O

2, em comparação com as células cultivadas em 20% O

2 para ambas as linhas celulares. seminoma secções de tecido humano foram utilizadas como controlos positivos para esses dois anticorpos. Todas as fotos foram originalmente feita em 200 × e todas as inserções foram tomadas em 400 ×.

Para determinar se a elevated

NANOG

expressão foi derivada de

NANOG1

ou

NANOGP8

, RT-PCR quantitativo análises foram realizadas ainda mais, com as correspondentes células cultivadas sob condições de normóxia como calibradores. foi repetidamente verificou-se que a expressão NANOG1

nas células sob normoxia estava em nível muito baixo, com Ct valores médios 37,24 e 37,37 para as células de células PC-3 e DU145, respectivamente. No entanto, o

expressão NANOGP8

nas células sob normoxia foi relativamente elevada, com valores médios Ct 33,56 e 33,51 para as células de células PC-3 e DU145, respectivamente. Embora os níveis mais altos

NANOG1

e

NANOGP8

expressões pode ser observada em ambas as linhas de células em hipóxia, o elevado

NANOG

expressão foi confirmada predominantemente

NANOGP8

, com até 6 vezes e aumento de 10 vezes na expressão nas células PC-3 e DU145 sob 1% de o

2, respectivamente (Figura 3). Uma vez que o

expressão NANOG1

nas células sob normoxia foi extremamente baixa, o aumento de 2,6 vezes e 3,1 vezes na expressão deste gene nas células PC-3 e DU145 sob 1% de O

2 representada ainda nível de expressão muito baixa.

em comparação com as células sob normoxia, não são elevados

NANOG1

e

NONOGP8

expressões nas células com menos de 7% o

2 para ambas as linhas celulares, com um aumento de até 1,8 vezes de

NANOG1

expressão e de até 2,5 vezes de

NONOGP8

aumento em ambas as linhas celulares; as células com menos de 1% O

2 expressar níveis ainda mais elevados de

NANOG1

e

NONOGP8

, com 2,6 vezes e aumento de 3,1 vezes em

expressão NANOG1

em as linhas celulares de PC-3 e DU145, respectivamente, e com 6 vezes e aumento de 10 vezes em

NONOGP8

expressões nas linhas celulares de PC-3 e DU145, respectivamente.

a hipoxia aumenta a capacidade de formação de colónias e se estende G

0 /G

1 fase

Desde hipóxia aumentou a expressão de fatores stemness, nós próxima investigou se hipóxia influenciou a proliferação destas células. As células PC-3 e DU145 foram cultivadas sob normoxia (20% de O

2) ou condições de hipoxia (1% O

2 e 7% O

2) durante 48 horas para o ensaio de proliferação. Como mostrado na Figura 4A, para cada linha de células não houve diferenças estatisticamente significativas na proliferação das células cultivadas em diferentes tensões de oxigénio (

P

0,05), embora as células cresceram ligeiramente mais lento do que em condições de hipoxia normóxia. Em seguida, foi perguntado se a hipóxia-pré-tratamento poderia influenciar clonogenicty nestas células. As células foram inicialmente expostas a diferentes tensões de oxigénio durante 48 horas, seguido por transferência para uma câmara de normóxia (20% O

2) durante 14 dias para o ensaio de formação de colónia. Em comparação com as células que foram continuamente cultivadas em 20% de O

2, mais colónias foram observadas em células que foram pré-tratadas em 7% O

2, e ainda mais colónias foram observadas nas células pré-tratadas em O 1%

2 (Figura 4B). Em comparação com as células cultivadas sempre sob normoxia, estatisticamente significativamente maior eficiência de formação de colónias foi identificado nos PC-3 e DU145 ells pré-tratados com hipoxia (Figura 4C). A análise do ciclo celular demonstrou um L estendida

0 /L

1 fase em que as células que foram expostas a 1% de O

2 durante 48 horas, em comparação com as células cultivadas em 20% de O

2 como controles (

P Art 0,05). (Figura 4D e e), indicando mais células em um estado de repouso sob hipóxia

(a) curvas de proliferação celular não mostram nenhuma diferença estatística para o crescimento celular sob diferentes tensões de oxigênio (

P 0,05

). (B) ensaio de formação de colónias para ambas as linhas de células mostra mais colónias nas células pré-tratadas em 7% O

2 por 48 horas e ainda mais colónias nas células pré-tratadas com menos de 1% de O

2 (C ) os histogramas para a eficiência de formação de colónias mostra estatisticamente mais elevada eficiência em células pré-tratadas em condições de hipoxia (7% ou 1% de o

2) para ambas as linhas celulares (

P

0,0001). (D) A citometria de fluxo mostra estendido L

0 /L

uma etapa para ambas as linhas celulares, que foram cultivadas em 1% O

2 durante 48 horas, em comparação com as células sempre mantidos sob condições de normóxia. analisa (E) estatísticos revelam significativamente alargado G

0 /G

1 estágio nas células cultivadas sob hipóxia para ambas as linhas de células (

P Art 0,05).

a hipoxia aumenta a fração de células com fenótipo

células estaminais população Side-like, assumiu para conter células-tronco do câncer de próstata putativos, são conhecidos para bombear o corante Hoechst 33342 [20], [33]. As células que exibem esta actividade foram ainda avaliadas durante o cultivo em diferentes tensões de oxigênio. As fracções mais elevados destas células populacionais lado foram observados em culturas mantidas a 1% O

2 tensão durante 48 horas, em comparação com as células cultivadas em 20% de O

2 (Figura 5A e B).

células PC-3 e DU145 foram cultivadas em 1% de O

2 e 20% de O

2 coditions durante 48 horas para analisar o fenótipo haste semelhante através de citometria de fluxo de ensaio. (A) As imagens representativas mostram que as células da população lado foram induzidos em ambas as linhas celulares após tratamento hipóxico. (B) A análise estatística mostrou diferença significativa na população de lado. (C) A citometria de fluxo análises mostram níveis mais elevados de ABCG2 intensidade expressão em ambas as linhas de células em hipóxia. (D) Histograma mostra diferença estatisticamente significativa na expressão ABCG2. (E) A citometria de fluxo análises mostram maior intensidade a expressão de CD44 em ambas as linhas de células em hipóxia. (F) Histograma mostra diferença estatisticamente significativa na expressão de CD44.

ABCG2 e CD44 têm sido descritos como câncer de próstata marcadores tronco-like com base em investigações clínicas e estudos em linhas celulares de cancro da próstata [19], [ ,,,0],33]. Por isso, as expressões ABCG2 e CD44 nas células PC-3 e DU145, que foram incubadas em 1% ou 20% de O

2 tensões durante 48 horas foram examinados com citometria de fluxo. Tal como mostrado nas Figuras 5C e D, lançou eram 1,20 vezes e aumento de 1,42 vezes na expressão ABCG2 nas células PC-3 e DU145 sob 1% de O

2, respectivamente, em comparação com as células sempre cultivado sob condições de normóxia. De igual modo, houve 1,50-dobragem e 1,45-de dobragem aumentos na expressão de CD44 nas células PC-3 e DU145 sob 1% de O

2, respectivamente, em comparação com as células sempre cultivado sob normoxia (Figuras 5E e F).

Desde hipóxia poderia induzir tanto ABCG2 e expressão de CD44 em ambas as linhas celulares, investigamos ainda mais a relação entre CD44 e ABCG2. coloração dupla destes dois marcadores de superfície revelou que o ABCG2 induzido por hipoxia

+ células eram principalmente CD44

células vivas, eo CD44

células dim sob a mesma condição de cultura foram principalmente negativos para a expressão ABCG2 (Figura 6A ).

(A) coloração dupla de CD44 e de superfície ABCG2 marcadores com citometria de fluxo ensaio mostra os níveis mais elevados expressões desses fatores em ambas as linhas de células sob hipoxia durante 48 horas.

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