PLOS ONE: MMP-10 /estromelisina-2 Promove Invasão de Cabeça e Pescoço Cancer

Abstract

Fundo

periostina, induzida por IFN proteína transmembrana 1 (IFITM1) e Wingless tipo MMTV integração familiar local, 5B membro (Wnt-5b) foram previamente identificados como a invasão promovida genes de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP), comparando os perfis de expressão gênica entre pai e um clone altamente invasivo. Temos relatado anteriormente que periostina e IFITM1 promoveu a invasão de células CECP. Aqui demonstramos que Wnt-5b superexpressão promoveu a invasão de células CECP. Além disso, a estromelisina-2 (metaloproteinase de matriz-10; MMP-10) foi identificado como um gene sobre-regulada comum entre periostina, IFITM1 e células CECP Wnt-5b que sobre-expressam, utilizando conjuntos de dados de microarray. Neste estudo, nós investigamos os papéis de MMP-10 na invasão do CECP.

métodos e resultados

Foi examinada a expressão de MMP-10 em casos CECP por imuno-histoquímica. Alta expressão de MMP-10 foi frequentemente observado e foi significativamente correlacionado com a capacidade de invasão e metástase em casos CECP. Em seguida, examinamos os papéis de MMP-10 na invasão de células CECP

in vitro

. a sobre-expressão ectópica de MMP-10 promoveu a invasão de células CECP, e knockdown de MMP-10 suprimiu a invasão de células CECP. Além disso, a MMP-10 knockdown suprimida invasão periostina e Wnt-5b-promovido. Curiosamente, a sobre-expressão de MMP-10 induziu a actividade de p38 diminuiu e MMP-10 knockdown induziu a um aumento da actividade de p38. Além disso, o tratamento com um inibidor de SB203580 p38 em células CECP inibiu a invasão.

Conclusões

Estes resultados sugerem que a MMP-10 desempenha um papel importante na invasão e metástase de carcinoma epidermóide, e que invasão impulsionado por MMP-10 é parcialmente associada com a inibição de p38 MAPK. Sugerimos que a MMP-10 pode ser utilizado como um marcador para a previsão de metástases em HNSCC

citação:. Deraz EM, Kudo Y, Yoshida H, H Obayashi, Tsunematsu t, Tani H, et al. (2011) MMP-10 /estromelisina-2 Promove Invasão de Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 6 (10): e25438. doi: 10.1371 /journal.pone.0025438

editor: Torbjorn Ramqvist, Instituto Karolinska, na Suécia

Recebido: 24 Janeiro, 2011; Aceito: 05 de setembro de 2011; Publicação: 05 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Deraz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi financiado em parte pelo Ministério da Educação, Ciência e Cultura do Japão concede-in-aid (Y. Kudo e T. Takata) e Grant Kurozumi Memorial Foundation (Y. Kudo). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é um dos tipos mais comuns de cancro humano, com uma incidência anual de mais de 500.000 casos em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços das estratégias de tratamento, a taxa de mortalidade e falência de opções de tratamento em pacientes com CECP ainda são altos. Alta mortalidade e mau prognóstico de HNSCC são previstos pela ocorrência de metástases em linfonodos, que é um evento comum em pacientes com câncer [2]. HNSCC desenvolve através da acumulação de múltiplas alterações genéticas e epigenética num processo multi-passo [3]. Tentativas de identificar os genes envolvidos na metástase são fundamentais para a detecção precoce do comportamento HNSCC. O processo de metástase consiste em passos sequenciais e selectivos, incluindo a proliferação, a indução da angiogénese, descolamento, motilidade, invasão em circulação, a agregação e a sobrevivência na circulação, a prisão de células em leitos capilares distantes e extravasamento em parênquima de órgãos [4], [5] . A identificação de novos invasão e metástase em moléculas relacionadas HNSCC e uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais as células de carcinoma de sofrer durante as etapas de invasão e metástase são de importância fundamental para conceber estratégias melhor terapêutica para o tratamento desta doença.

micromatrizes de expressão de genes têm sido surgido e a sua utilização generalizada levou à identificação de genes candidatos potenciais. Outras investigações dos comportamentos biológicos e evolução clínica significativa destes genes em particular no HNSCC é de grande interesse. Nós previamente estabelecido uma linha celular HNSCC, MSCC-1, a partir de metástase ganglionar [6]. Além disso, nós isolamos um clone altamente invasivo MSCC-inv1 a partir de células MSCC-1 usando um

in vitro

dispositivo de ensaio de invasão [7]. Em seguida, comparou-se o perfil de transcrição das células-mãe (MSCC-1) e um clone altamente invasiva (MSCC-INV1) por análise de microarranjo, a fim de identificar os genes que diferem na sua expressão [8]. Vários genes foram sobre-expressos selectivamente no clone altamente invasivo. Entre estes genes, periostina (factor de 2 específico do osteoblasto (fasciclina I como)) era o gene mais altamente expresso e a segunda foi IFITM1 (proteína transmembranar induzida por IFN-1). Na verdade, nós demonstramos que periostina e IFITM1 promovido invasão ambos

in vitro

e

in vivo

[8], [9]. Também identificamos Wingless tipo MMTV família local de integração, membro 5B (Wnt-5b) como o terceiro gene altamente expresso em MSCC-inv1. Aqui, nós confirmou a capacidade de Wnt-5b para promover a invasão de células CECP

in vitro.

Além disso, identificamos metaloproteinase-10 (MMP-10) como um gene regulada comum por moléculas de invasão promover incluindo periostina , IFITM1 e Wnt-5b. As metaloproteinases de matriz (MMPs) constituem uma família de proteinases dependentes de zinco, que são capazes de degradar componentes da matriz extracelular tais como colagénios e proteoglicanos e que têm um papel no desenvolvimento normal e danos nos tecidos em diversas condições fisiopatológicas envolvendo artrite, a cicatrização de feridas e crescimento tumoral [10 ]. MMPs podem ser classificados em subgrupos, incluindo; colagenases, estromelisinas, gelatinases e tipo membrana MMPs [11]. Alguns membros de MMPs estão envolvidas na invasão e metástase em HNSCC tais como MMP-2, uma membrana do tipo-MMP (MT1-MMP), MMP-9 e [12], [13]. A sobre-expressão destas MMPs tem sido correlacionado com a invasão, metástase, e de prognóstico reservado. No presente estudo, investigamos os papéis de MMP-10 na invasão do CECP.

Resultados

Wnt-5b promove a invasão do CECP

Wnt-5b é um membro da família de genes Wnt, um grupo de glicoproteínas segregadas que desempenha um papel importante na oncogénese e em diversos processos do desenvolvimento e desencadeia respostas intracelulares por meio de várias vias de sinalização. Ao comparar o perfil de transcrição das células-mãe e o clone altamente invasivo por meio de análise de microarray, Wnt-5b era o terceiro gene altamente expresso no clone altamente invasiva e depois periostina IFITM1. Em primeiro lugar, examinou se Wnt-5b estava envolvido na invasão do CECP. A maior expressão de Wnt-5b no clone altamente invasivo em comparação com as células-mãe foi verificada por meio de RT-PCR (Figura 1A). Foi examinada a expressão de ARNm de Wnt-5b em seis linhas de células de carcinoma epidermóide. Wnt-5b expressão de ARNm foi observada em quase todas as linhas de células de carcinoma epidermóide, com excepção de células HSC4 (Figura 1A). Para esclarecer o papel de Wnt-5b na invasão do CECP, geramos o Wnt-5b superexpressão células por transfecção de Wnt-5b em células HSC4 sem expressão de Wnt-5b. Depois de obter o clone estável de Wnt-superexpressão-5B células (Figura 1B), que foram utilizados para a verificação da capacidade de invasão pela

in vitro

ensaio de invasão. Wnt-5b superexpressão significativamente reforçada a invasão de células CECP

in vitro

(Figura 1B). Para confirmar a invasão de Wnt-5b-promovido de células CECP, examinou-se o knockdown de Wnt-5b utilizando siRNA em células HSC2 com elevada expressão de Wnt-5b. O tratamento de siARN Wnt-5b reduzida a expressão de ARNm de Wnt-5b e inibiu significativamente a invasão (Figura 1B). Embora Wnt-5b não afectou o crescimento celular (Figura 1C), é promovida de forma significativa a motilidade celular de células CECP como demonstrado pelo ensaio de cicatrização da ferida (Figura 1D). Curiosamente, Wnt-5b siARN inibiu significativamente a motilidade celular de células CECP (Figura 1D). Além disso, comparamos o perfil de expressão gênica entre controle e-Wnt-5b superexpressão células HSC4 por análise de microarray (Data S1). S100A8, SERPINB4, osteopontina e SERPINB3 foram regulada e TGF-SS2, CDH11 e trombospondina 1 foram reprimidos em células-superexpressão-5B Wnt (Tabela S1).

A,

Expressão da Wnt- 5b nas linhas de clones e células de carcinoma epidermóide altamente invasivas. Expressão de ARNm de Wnt-5b em MSCC-1, MSCC-INV1, bem como linhas de células de seis CECP; HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, HO-1-N-1, e Ho-1-L-1 foi analisada por RT-PCR. Expressão de ARNm de Wnt-5a foi também examinada em linhas celulares 6 CECP. GAPDH foi usada como um controlo de carga.

B,

Wnt-5b promoveu a invasão de células CECP. Para a geração de Wnt-5b que sobre-expressam células, Wnt-5b vector de expressão foi transfectado em células sem expressão HSC4 Wnt-5b. Obteve-se o clone estável e a expressão de Wnt-5b foi examinado por transferência de Western com anticorpo policlonal anti-Wnt-5b (painel superior esquerdo). Utilizou-se células transfectadas vector vazio (vazios) como um controlo. expressão de p-actina foi utilizado como um controlo de carga. A invasão de Wnt-sobre-expressam 5b células (painel superior direito) foi examinado pelo

in vitro

ensaio de invasão. 1,5 × 10

5 células foram colocados no compartimento superior da inserção de cultura de célula. Após 12 h de incubação, as células penetraram no lado inferior da membrana foram fixados em formalina e corados com hematoxilina. HSC2 células com expressão de Wnt-5b foi transfectado por siARN de Wnt-5b (siWnt-5b) ou ARNsi de controlo (siControl). Uma sequência mexidos que não mostra homologia significativa com ratazana, rato ou de sequências de genes humanos foi utilizada como um controlo. O efeito do knockdown foi avaliada por RT-PCR (painel inferior esquerdo). GAPDH foi usada como um controlo de carga. A capacidade de invasão das células Wnt-knocked-down-5B foi examinado pelo

in vitro

ensaio de invasão (painel inferior direito). Após 24 h de incubação, as células penetraram no lado inferior da membrana foram fixados em formalina e corados com hematoxilina. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes. * Significativamente diferentes a partir de células transfectadas vector vazio ou ARNsi de controlo de células transfectadas a

P

0,01.

C, a proliferação celular

de Wnt-superexpressão-5B e células-Wnt-5b knocked-down. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços, e as células tripsinizadas foram contados pelo contador de células em 0, 2, 4 e 6 dias. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes.

células D,

Migração de Wnt-sobre-expressam 5b células e Wnt-5b-knocked-down. A migração das células foi determinada por ensaio de cicatrização de feridas. Às 24 h depois de coçar as células, imagens de contraste de fase (10 × de campo) do processo de cicatrização de feridas foram fotografadas digitalmente com um microscópio invertido. A distância das áreas das feridas foram medidos nas imagens, fixado em 100% para 0 h, e a percentagem média das distâncias total das zonas da ferida foi calculado. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes. * Significativamente diferente a partir de células transfectadas com vector vazio ou ARNsi de controlo de células transfectadas a

P

. 0,01

MMP-10 é identificado como um gene alvo comum para periostina, IFITM1 e Wnt superexpressão -5b

para identificar os genes alvo comum para periostina, IFITM1 e superexpressão Wnt-5b, foram comparados os perfis de expressão genética entre as células de controlo e células HSC2 HSC2 periostina-sobre-expressam, controle Ca9-22 células e IFITM1- superexpressando Ca9-22 células, e células de controlo e células HSC4 HSC4 Wnt-overexpressing-5b (Figura 2A). Como resultado, vários grupos de genes com funções biológicas variáveis ​​no desenvolvimento normal e no processo de malignidade foram encontrados para ser comum em periostina, IFITM1, e células que sobre-expressam Wnt-5b-(Figura 2B). Uma série de genes alvo comuns com comportamentos biológicos variáveis, incluindo a adesão celular, proliferação celular, apoptose, ciclo celular e os outros foram identificados. Análise do gene ontologia foi feito utilizando o software gene da mola GX para identificar as funções biológicas destas moléculas (Figura 2B). Comuns genes regulados entre Periostin- e IFITM1-sobre-expressão, Periostin- e Wnt-5b-sobre-expressão e IFITM1- e Wnt-5b-superexpressão estão listados na Tabela S2, S3 e S4, respectivamente. Vários genes foram altamente regulada entre Periostin-, IFITM1-, e as células CECP-Wnt-5b superexpressão (Tabela S5). Entre eles, a estromelisina-2 (MMP-10) foi incluído. As MMPs são conhecidos como uma família de proteinases dependentes de zinco, que são capazes de degradar componentes da matriz extracelular e que têm um papel no desenvolvimento de tumores [10]. No entanto, pouco se sabe sobre o envolvimento de MMP-10 na invasão e metástases de células cancerosas. Portanto, nós nos concentramos em MMP-10 como uma molécula regulada comum induzida por factores relacionados com invasão de CECP e examinou o seu papel na invasão do CECP.

A,

esquema mostra a estratégia para identificar o objectivo comum de moléculas relacionadas invasão. Periostina, IFITM1, e Wnt-5b são identificadas como as moléculas relacionadas com a invasão por comparação do perfil de expressão do gene entre o pai (células MSCC-1) e um clone altamente invasivo (células MSCC-Inv1). Para identificar alvos comuns de moléculas relacionadas invasão, foram comparados os perfis de controlo vs. periostina-sobre-expressando células HSC2, controle vs. células Ca9-22 IFITM1-sobre-expressam e controle vs. células HSC4 Wnt-sobre-expressam 5b de expressão gênica. nível de expressão ectópica de periostina, IFITM1 e Wnt-5b em cada célula são mostrados por meio de RT-PCR. expressão de GAPDH foi usada como um controlo de carga.

B,

Vários genes regulados positivamente foram encontradas entre periostina e IFITM1, periostina e Wnt-5b, e Wnt-5b e IFITM1. Ao usar o software Gene ontologia, identificamos as funções biológicas destes genes. A tabela mostra esses genes regulados positivamente comuns compreendendo diversas famílias com funções biológicas variáveis.

High expressão de MMP-10 está bem correlacionada com padrões de invasão e metástase em HNSCC

Em primeiro lugar, examinou o expressão de MMP-10 em tecidos da mucosa oral 30 e 116 casos normais CECP por imuno-histoquímica. As informações clínicas de 116 pacientes, incluindo idade, localização, tamanho do tumor, padrão de invasão, metástase, estágio do tumor, classificação TNM, tratamento, sobrevivência e MMP-10 expressão é mostrado no Data S2. Para demonstrar a especificidade do anticorpo de coloração imuno-histoquímica de MMP-10, foi realizada a coloração imuno-histoquímica sem anticorpo secundário ou sem anticorpo primário como um controlo negativo (Figura S1). Observou-se elevada expressão de MMP-10 em 89 de 116 (76,7%) casos CECP, ao passo que o epitélio não-neoplásicas não mostraram expressão de MMP-10 (Figura 3A). Em seguida, comparamos a expressão de MMP-10 com padrão de invasão, o agrupamento palco e metástases em linfonodos (Tabela 1). Utilizou-se a classificação do Jacobsson (Patterns I-IV) para avaliação do padrão de invasão (Figura S2) [14]. Fora de 116 casos CECP, 9, 12, 62 e 33 casos mostraram o padrão I, II, III e IV, respectivamente (Tabela 1). Curiosamente, a incidência de MMP-10 casos positivos no teste padrão III e IV, foi significativamente mais elevada do que no padrão I e II (Figura 3B). É bem conhecido que os tipos III e IV são correspondente à fraca diferenciação e alta frequência metastática [14]. A correlação entre a expressão de MMP-10 e padrão de invasão foi estatisticamente significativa (P 0,001) (Tabela 1). Também comparamos a expressão de MMP-10 com o estadiamento grupo. Quarenta e nove casos CECP estavam disponíveis para agrupamento fase (I-IV) de acordo com os critérios da Sociedade Japonesa para o cancro principal e [15]. A maioria dos casos (97,1%) mostraram alta expressão de MMP-10 em grupo estágio avançado (III e IV), enquanto que 46,7% dos casos mostraram alta expressão de MMP-10 em grupo nas fases iniciais (I e II). A correlação entre a expressão de MMP-10 e o agrupamento fase foi estatisticamente significativa (P 0,001) (Tabela 1). Além disso, a MMP-10 de expressão foi significativamente correlacionado com metástases nos linfonodos (P 0,001) (Tabela 1 e Figura 3B). Vinte e nove dos 89 casos CECP com alta expressão de MMP-10 tinham metástases linfonodais, enquanto 5 de 27 casos CECP com baixa expressão de MMP-10 teve metástase ganglionar (Figura 3B). Além disso, examinamos a correlação entre a expressão de MMP-10 e sobrevivência em casos CECP. Quarenta e dois casos CECP estavam disponíveis para análise de sobrevivência. Curiosamente, apesar de não haver significância estatística (

P

= 0,21), pacientes com alta expressão de MMP-10 tendeu a mostrar mau prognóstico (Figura 3C).

A,

expressão imuno-histoquímica da MMP-10 em 116 casos CECP e 30 epitélios normais. epitélio normal é completamente negativa para a MMP-10 em comparação com casos CECP em que a maioria das células tumorais mostraram altamente expressão de MMP-10. caso representativo de baixa expressão de MMP-10 no epitélio normal oral e caso HNSCC (de Jacobsson classificação do padrão I), e casos representativos de alta expressão de MMP-10 (baixa e alta ampliação) em casos CECP (de Jacobsson classificação do padrão IV) são mostrados. barra de escala é mostrado em cada imagem.

B,

Correlação entre MMP-10 expressão e de invasão e metástase em casos CECP. gráfico da esquerda mostra a relação entre MMP-10 expressão e padrão de invasão. classificação do Jacobsson (Patterns I-IV) foi utilizado para a avaliação do padrão de invasão (Figura S1) [14]. * Significativamente diferente do padrão I ou II a

P

0,01. Gráfico à direita apresenta a relação entre a expressão de MMP-10 e metástase. * Significativamente diferente da baixa expressão de MMP-10 a

P

0,01.

C,

MMP-10 expressão e mau resultado. Quarenta e dois casos CECP italianos estavam disponíveis para análise de sobrevivência. As curvas de Kaplan-Meier mostrar sobrevivência de pacientes com CECP com alta expressão de MMP-10 (•, N = 34) ou baixa expressão de MMP-10 (▴, N = 8).

MMP-10 promove a invasão de HNSCC

próxima examinados MMP-10 mARN e proteína em 6 linhas de células de carcinoma epidermóide por RT-PCR e análise de transferência de Western, respectivamente. Alta expressão de MMP-10 ARNm e proteína foi observada em Ca9-22, HO-1-L-1 e Ho-1-N-1 de células (Figura 4A). Em células HSC2, HSC3 e HSC4, MMP-10 de expressão foi baixa (Figura 4A). a expressão da proteína MMP-10 correspondeu a nível de expressão de ARNm. Para investigar se o MMP-10 promove a invasão de HNSCC

In vitro

, geramos células MMP-10 sobre-expressam usando células HSC2 e HSC3 com baixa expressão de MMP-10 (Figura 4B). Confirmou-se a maior actividade de MMP-10 em meios condicionados de células de MMP-10 sobre-expressam pela estromelisina zimografia (Figura 4B). Embora a MMP-10 sobre-expressão não afectou a proliferação de células (dados não mostrados), que dramaticamente melhorada a actividade invasiva em ambas as células e HSC2 HSC3 (

P

0,05) (Figura 4C). Para confirmar ainda mais a invasão de MMP-10-mediada de células CECP, examinou-se o knockdown de MMP-10, utilizando siARN em Ca-9-22 e Ho-1-N-1, células com elevada expressão de MMP-10. Para MMP-10 knockdown, usamos 3 siRNAs diferentes (# 1, # 2 e # 3). Todos os ARNic incluindo cocktail de 3 siRNAs reduzida de MMP-10 de expressão (Figura S3). Utilizou-se cocktail de 3 siRNAs nos seguintes estudos. MMP-10 knockdown inibiu a expressão de MMP-10 ARNm e proteína em Ca9-22 e Ho-1-N-1 de células (Figura 4D). MMP-10 knockdown suprimiu significativamente a invasão de células CECP (Figura 4E). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a MMP-10 desempenha um papel importante na invasão de células CECP.

A,

expressão de MMP-10 mRNA e proteína em seis linhas de células de carcinoma epidermóide. Expressão de ARNm de MMP-10 em HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, HO-1-N-1, e Ho-1-L-1 foi analisada por RT-PCR. GAPDH foi usada como um controlo de carga. nível de expressão da proteína MMP-10 foi avaliada nas seis linhas de células de carcinoma epidermóide por análise de Western blot. Imagens de exposição de curta e longa da expressão da proteína MMP-10 são mostrados. ß-actina foi utilizado como um controlo de carga.

B,

Geração de MMP-10-superexpressão células. Obtivemos vários clones por transfecção com MMP-10 em células HSC2 e HSC3 pBICEP-FLAG-marcados. A expressão ectópica de MMP-10 foi determinada por transferência de Western com anticorpo anti-FLAG (painel da esquerda). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A actividade enzimática da MMP-10 foi detectado por zimografia estromelisina (painel da direita). forma ativa da MMP-10 (cabeça de seta) foi detectada em meio condicionado de MMP-10-superexpressão células.

C, atividade

invasiva de células HSC2 e HSC3 MMP-sobre-expressam 10 HSC2 (painel esquerdo) e HSC3 (painel direito) células em comparação com o vector vazio transfectadas (Vazio) pelo

in vitro

ensaio de invasão. As células foram fixadas após incubação de 12 h ou 20 h em células ou células HSC2 HSC3, respectivamente. A figura mostra o lado manchado inferior da membrana em que as células penetrado (painel superior). Os gráficos mostram o número de células invadidas vector em células transfectadas de MMP-10 sobre-expressam e vazios (painel inferior). As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes. * Significativamente diferente a partir de células transf ectadas de vector vazio a

P

0,01.

D,

MMP-10 siRNA suprimiu a invasão das células CECP. Cocktail de 3 diferentes de MMP-10 siRNAs foi transientemente transfectada em Ca-9-22 e Ho-1-N-1 de células com expressão de MMP-10. Uma sequência mexidos que não mostra homologia significativa com ratazana, rato ou de sequências de genes humanos foi utilizada como um controlo. Após 48 h de transfeco, a expressão de MMP-10 ARNm e proteína foi examinada por RT-PCR e transferência de Western (WB), respectivamente. GAPDH mRNA e proteína β-actina foram utilizados como um controlo de carga. A análise densitométrica de expressão de MMP-10 foi executada. MMP-10 /GAPDH rácio é mostrado.

E,

Supressão de invasão de MMP-10 knockdown no Ca9-22 e Ho-1-N-1 células. A invasão de MMP-10 células knocked-down foi examinado pelo

in vitro

ensaio de invasão em comparação com células transfectadas controle de siRNA. Uma sequência mexidos que não mostra homologia significativa com ratazana, rato ou de sequências de genes humanos foi utilizada como um controlo. Após 24 h de incubação, as células foram fixadas e o número de células foi contado invadidas. A figura mostra o lado manchado inferior da membrana em que as células penetrado (painel esquerdo). O gráfico mostra o número de células invadidas (painel da direita). As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes. * Significativamente diferente a partir de células transfectadas de controle de siRNA em

P

. 0,01

MMP10 knockdown suprime a invasão periostina e Wnt-5b-promovido das células CECP

Os nossos resultados actuais revelou que a MMP-10 é um gene regulado positivamente comum entre periostina, IFITM1, e a sobreexpressão de Wnt-5b. Comparou-se a expressão de MMP-10 em periostina, IFITM1, e células de Wnt-5b-overexpressing com que em células de controlo. MMP-10 foi encontrado para ser regulado positivamente por Wnt-periostina ou 5b (Figura 5A), mas não por IFITM1 (dados não mostrados). Na nossa análise de microarray, foi observado aumento de 17,4 vezes de MMP-10 de expressão em células que sobre-expressam periostina HSC2 e 5,8 vezes de aumento da expressão de MMP-10 foi observada em células HSC4 Wnt-5b que sobre-expressam. Por isso, nós examinamos o papel potencial de MMP-10 em periostina e invasão de Wnt-5b-promovido em HNSCC. Foi examinado o efeito de MMP-10 na invasão knockdown em periostina células que sobre-expressam Ca9-22 e em células que sobre-expressam HSC4 Wnt-5b. A expressão da proteína MMP-10 foi reduzida por MMP-10 knockdown no Periostin- e Wnt-5b que sobre-expressam células (Figura 5B). Curiosamente, a MMP-10 knockdown suprimiu significativamente a invasão Periostin- e Wnt-5b-promovida (Figura 5C), o que indica que a MMP-10 pode desempenhar um papel na invasão impulsionado por Periostin- e Wnt-5b-a sobre-expressão em HNSCC. Também examinamos MMP-10 knockdown em células periostina-overxpressiong HSC2 (Figura S4). Em semelhantes a periostina-overxpressiong células Ca9-22, MMP-10 siRNA suprimiu as capacidades invasivas em células HSC2 periostina-overxpressiong. Além disso, a MMP-10 knockdown inibiu significativamente a invasão das células de controlo Ca9-22, enquanto que a MMP-10 knockdown inibiu ligeiramente a invasão no HSC2 controlo e células HSC4 (Figura 5C e Figura S4). Em células Ca9-22, foi observado elevado nível de expressão de MMP-10, mas não em células HSC2 e HSC4 (Figura 4A). Como as células Ca9-22 mostrou endógena expressão de MMP-10 em níveis mais elevados, nós pensamos que a MMP-10 siRNA suprimida capacidades invasivas através da regulação negativa da expressão endógena MMP-10 em células Ca9-22. O nível de supressão por MMP-10 foi knockdown muito provavelmente dependente do nível de expressão de MMP-10.

A,

A expressão de ARNm de MMP10 foi examinado por RT-PCR em CA9 controle -22 células, periostina células que sobre-expressam Ca9-22, células HSC4 de controlo e células que sobre-expressam Wnt HSC4-5B. expressão de GAPDH foi usada como um controlo de carga.

B,

células Wnt-superexpressão-5B MMP-10 knockdown em Periostin- e. Cocktail de 3 diferentes de MMP-10 foi siRNAs transientemente transfectados para células de Ca-9-22-overexpressing periostina e células que sobre-expressam HSC4 Wnt-5b. Uma sequência mexidos que não mostra homologia significativa com ratazana, rato ou de sequências de genes humanos foi utilizada como um controlo. Após 48 h de transfeco, a MMP-10 nível de proteína foi examinada por análise de Western blot, com MMP-10-anti- anticorpo de MMP-10 siRNA células transfectadas que sobre-expressam periostina. ß-actina foi utilizado como um controlo de carga.

C,

A invasão de MMP-10 siRNA transfectadas periostina-superexpressão células Ca-9-22 (painel esquerdo) e células HSC4-superexpressão-5B Wnt (painel direito) foi examinado pelo

in vitro

ensaio de invasão. Após 18 h de incubação de células HSC4 e 24 h de incubação de células Ca9-22, as células foram fixadas e o número de células foi contado invadidas. A figura mostra o lado manchado inferior da membrana em que as células penetrado (painel superior). Os gráficos mostram o número de células invadidas em células de controlo (painel inferior) e knockdown. As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes. * Significativamente diferente do controlo em

P

. 0,01

invasão MMP-10-promovido está associada com a inibição p38

A fim de conhecer o mecanismo de MMP-10 promoveu invasão, observou-se a actividade das moléculas de sinalização de células, tais como p38, FAK, RSK, Akt, Src, e ERK por transferência de western utilizando anticorpo específico para a fosforilação da MMP-10 e células que sobre-expressam o controlo. Entre estas moléculas, p38 foi inactivada por MMP-10 sobre-expressão (Figura 6A). Para confirmar ainda mais o envolvimento de inibição de p38 na invasão de MMP-10-promovido, a capacidade invasiva de controlo e-MMP-10 sobre-expressando células após o tratamento com o inibidor de p38, SB203580 foi examinada. Curiosamente, o tratamento com SB203580 promoveu significativamente a invasão de células de controlo com a actividade de p38 (Figura 6B). Por outro lado, o tratamento SB203580 não promover a invasão de MMP-10 de células que sobre-expressam sem a actividade de p38. Além disso, examinamos se um inibidor de p38 resgatou o bloco de invasão induzida por MMP10 knockdown no MMP-10 superexpressão células HSC2 e HSC3. MMP-10 MMP-knockdown em que sobre-expressam 10 células promoveu a capacidade invasiva, após o tratamento com inibidor da p38 (Figura S5). No entanto, o inibidor de p38 não totalmente resgatar a capacidade invasiva suprimida por MMP-10 siRNA (Figura S5). Além disso, constatou-se que as células adição de meio condicionado a partir de MMP-10-sobre-expressam inibiu a actividade de p38 em células e HSC2 HSC3 (Figura 6c). Também examinamos a atividade p38 ea invasão por MMP-10 knockdown em células MSCC-Inv1. Em células MSCC-Inv1, MMP-10 knockdown regulada ligeiramente atividade p38 (Figura 6D) e inibiu a atividade invasiva (Figura 6E).

A, a inibição

p38 foi observada em MMP-10 superexpressando células. Níveis de formas totais e fosforiladas de p38, FAK, RSK, Akt, Src, e ERK em controlo e MMP-10 células por Western blotting overexpresing.

B,

Invasão de controle e MMP-10 células com superexpressão após o tratamento pelo inibidor de p38. A invasão de foi examinado pelo

in vitro

ensaio de invasão em células transfectadas vetor vazias e MMP-10 células com superexpressão com o tratamento SB203580. As células transf ectadas de vector vazio foram usadas como controlo. Após 12 h de incubação, as células foram fixadas e o número de células foi contado invadidas. A figura mostra o lado manchado inferior da membrana em que as células penetrado (painel superior). Os gráficos mostram o número de células invadidas (painel inferior). As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes. * Significativamente diferente a partir de células transf ectadas de vector vazio sem tratamento SB203580 a

P

0,01.

C, atividade p38

após o tratamento com meio condicionado de MMP-10 células com superexpressão. Os meios condicionados de MMP-10 com superexpressão células HSC2 e HSC3 foi recolhido após 48 h de chapeamento. Após a adição de meios condicionados por 0, 6, 12 e 24 h, as células HSC2 ou HSC3 foram recolhidos. A expressão de fosfo-p38 e p38 foi examinado por análise de Western blot.

D,

MMP-10 siRNA regula positivamente a atividade p38 em células de CECP. Cocktail de 3 diferentes de MMP-10 siRNAs foi transitoriamente transfectado para células MSCC-Inv1. Uma sequência mexidos que não mostra homologia significativa com ratazana, rato ou de sequências de genes humanos foi utilizada como um controlo. Após 48 h de transfeco, a expressão da proteína MMP-10 foi analisada por Western blotting. Níveis de formas totais e fosforiladas de p38 também foram examinados por transferência Western. expressão de p-actina foi utilizado como um controlo de carga.

E,

Supressão de invasão de MMP-10 knockdown em células MSCC-Inv1. A invasão foi examinado pelo

in vitro

ensaio de invasão. Após 6 horas de incubação, as células foram fixadas e o número de células foi contado invadidas. A figura mostra o lado manchado inferior da membrana em que as células penetrado (painel superior). O gráfico mostra o número de células invadidas (painel inferior). As barras mostram os valores médios e os desvios-padrão de três experiências independentes. * Significativamente diferente do controlo em

P

. 0,01

Discussão

invasão e metástase são o principal problema e o maior obstáculo para o tratamento de CECP. Portanto, é importante para identificar novas moléculas envolvidas na invasão e metástase de carcinoma epidermóide. Foram identificados vários genes relacionados invasão através da comparação dos perfis de expressão genética entre as células-mãe e um clone altamente invasivo [8]. Periostina e IFITM1 foram identificados como os mais altos genes em um clone altamente invasivo e seu envolvimento na invasão foram confirmadas pelo

in vitro

e

in vivo

estudos [8], [9]. Aqui, demonstramos que o Wnt-5b promoveu a invasão de células CECP (Figura 1).

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