Abstract
Fundo
Os microRNAs (miRNAs), endógeno pequena RNAs não-codificante, são detectados de forma estável no plasma humano. O diagnóstico precoce do câncer gástrico (GC) é muito importante para melhorar o efeito de terapia e prolongar a sobrevida dos pacientes. Nosso objetivo foi identificar se quatro miRNAs (miR-223, miR-21, miR-218 e miR-25) intimamente associados à tumorigênese ou metástase de GC pode servir como novos biomarcadores potenciais para a detecção de GC.
Metodologia
Nós inicialmente mensurados os níveis plasmáticos de quatro miRNAs em 10 pacientes do GC e 10 indivíduos de controle saudáveis por quantitativa transcrição reversa reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR), e, em seguida, em comparação plasma resultados miRNA com as expressões em tecidos de câncer a partir de oito pacientes do GC. Finalmente, a presença de miR-223, miR-21 e miR-218 no plasma foi validado em 60 pacientes do GC e 60 indivíduos de controle saudáveis, e as áreas sob a curva ROC (ROC) destes miRNAs foram analisados.
resultados
Descobrimos que os níveis plasmáticos de miR-223 (
P Art 0,001) e miR-21 (
P Art 0,001) foram significativamente maiores em pacientes do GC do que nos controles saudáveis, enquanto que miR-218 (
P Art 0,001) foi significativamente menor. A análise de ROC proporcionou os valores da AUC de 0,9089 para miR-223, 0,7944 para miR-21 e 0,7432 para miR-218, e análise ROC combinada revelou o maior valor AUC de 0,9531 em discriminar pacientes GC de controles saudáveis. Além disso, os níveis plasmáticos de miR-223 (
P Art 0,001) e miR-21 (
P
= 0,003) foram significativamente maiores em pacientes GC com a fase I do que nos controles saudáveis. Além disso, os níveis plasmáticos de miR-223 foram significativamente maiores em pacientes com GC
helicobacter pylori
(Hp) de infecção do que aqueles sem (
P
= 0,014), e significativamente mais elevados em indivíduos saudáveis de controle com a infecção Hp do que aqueles sem (
P
= 0,016).
Conclusões
Plasma miR-223, miR-21 e miR-218 são novos biomarcadores potenciais para a detecção de GC .
Citation: Li Bs, Zhao Yl, Guo G, Li W, Zhu Ed, Luo X, et al. (2012) Plasma microRNAs, miR-223, miR-21 e miR-218, como novos biomarcadores potenciais para detecção de câncer gástrico. PLoS ONE 7 (7): e41629. doi: 10.1371 /journal.pone.0041629
editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 21 Dezembro, 2011; Aceito: 27 de junho de 2012; Publicado: 30 Julho 2012 |
Direitos de autor: © Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Natural Science Foundation da China (NSFC, No. 81.071.412). Os financiadores não tiveram papel importante na recolha de dados e análise, mas não papel no desenho do estudo, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico é a quarta neoplasia maligna mais comum no mundo e a segunda principal causa de morte por câncer em ambos os sexos em todo o mundo. As taxas de mortalidade mais elevadas são estimados na Ásia Oriental [1]. A taxa de sobrevida em 5 anos para o câncer gástrico é inferior a 20% -25% nos EUA, Europa e China [2]. Atualmente, a ressecção cirúrgica completa é o tratamento mais eficaz, oferecendo uma (90%) excelente chance de cura para pacientes com câncer gástrico precoce [3]. Para o cancro gástrico avançado, apesar da cirurgia curativa, cerca de 80% dos doentes morrem dentro de um curto espaço de tempo de recorrência loco-regional (87%) e /ou metástase distante (30%) [4]. Portanto, a melhoria no diagnóstico precoce pode aumentar a chance de cura em pacientes GC início ou prolongar a sobrevida dos pacientes com GC em estágio inicial. No entanto, a maioria dos GCs em fase inicial são difíceis de detectar [5]. Os marcadores sorológicos convencionais para GC, como antígeno de carboidrato 19-9 (CA19-9) e antígeno carcinoembrionário (CEA), a falta de sensibilidade suficiente e especificidade para facilitar a detecção precoce.
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos, não -coding RNAs que posttranscriptionally regulam a expressão do gene. expressão aberrante de miRNAs tem sido correlacionada com várias doenças, incluindo cancros [6]. Estudos anteriores indicaram que os perfis de expressão em tecidos de miARN pode ser considerado como biomarcadores de diagnóstico do cancro em [7] – [9]. No entanto, este método de diagnóstico é limitada na sua eficácia como amostras de tecido não são convenientes para aceder e são invasivos de obter. Um número crescente de artigos relatam que miARNs circulantes são detectados de forma estável em vários fluidos corporais, incluindo soro e plasma [10], [11]. Circulando miRNAs como novos biomarcadores estáveis seria um dos meios mais promissores de diagnóstico, pois plasma e soro são de fácil acesso e não invasivo de obter. Recentemente, vários biomarcadores de soro ou plasma miRNA promissoras para a detecção de GC foram identificados [12], [13].
Para explorar essa novela plasma assinaturas miRNA pode distinguir pacientes com GC (particularmente em estágio inicial GC) de ser saudável controles, foram selecionados quatro miRNAs (mIR-223, miR-218, miR-25 e miR-21), que tinha sido relatada a ser frequentemente desregulado no tecido GC e estreitamente correlacionada com tumorigênese ou metástase de GC [14] – [21] . Nós suposto que os níveis de plasma de três miARNs (miR-223, o miR-218 e miR-25) foram aberrante em pacientes GC, bem como aqueles de miR-21, o que sugere que esta assinatura pode servir como um biomarcador para a detecção de GC [12]. No entanto, os níveis plasmáticos de miR-21 em pacientes de GC em diferentes fases TNM não foram identificados. Neste estudo, foram comparados os níveis plasmáticos dos quatro miRNAs em pacientes GC para controles saudáveis, e avaliada a viabilidade dos quatro miRNAs como novos biomarcadores não invasivos para a detecção de GC.
Materiais e Métodos
pacientes e amostras
Todas as amostras foram coletadas de indivíduos consentindo de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Terceira Universidade médica Militar. No total, 70 pacientes com GC antes de quaisquer tratamentos e 70 indivíduos de controle saudáveis de Southwest Hospital (Chongqing, China) foram incluídos em nosso estudo, entre 2010 e 2011. Para os pacientes do GC 70, analisamos a histologia dos tecidos GC, incluindo 56 adenocarcinoma, 13 de adenocarcinoma mucinoso e 1 carcinoma do anel de sinete, e determinou os locais de tumor, incluindo 34 no corpo gástrico, 24 em antro gástrico, 8 em cárdia gástrica e 4 em outros (Upper estômago, ângulo gástrica, coto gástrico). Os pacientes do GC foram classificados de acordo com os estágios clínicos TNM, incluindo 12 fase I (idade média, 53 anos [intervalo, 36-70 anos]; 8 do sexo masculino, 4 do sexo feminino), 11 de fase II (idade média, 61 anos [range, 36-77 anos]; 7 masculinos, 4 femininos), 36 estágio III (idade média, 55 anos [intervalo, 30-71 anos]; 26 do sexo masculino, 10 do sexo feminino), e 11 estádio IV (idade média, 53 anos [range , 46-66 anos]; 9 machos e 2 fêmeas) .O estatuto da infecção pelo Hp foram testados usando Anti-HP Anticorpos ELISA de diagnóstico Kits (S20010005), (BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO, LTD), que mostra 43 pacientes GC com infecção Hp. e 27 sem. Para os 70 indivíduos de controle saudáveis, 44 do sexo masculino e 26 do sexo feminino foram incluídos, ea idade média foi de 51 anos [variação, 26-75 anos]. Os resultados do teste de infecção Hp mostrou 31 indivíduos de controle saudáveis com infecção pelo Hp e 39 sem. (Tabela 1).
de plasma isento de células foi isolado a partir de todas as amostras de sangue dentro de 2 horas da colheita utilizando um protocolo de dois passos (1500 rpm durante 10 min, 12000 rpm durante 2 min) para evitar contaminação por ácidos nucleicos celulares. O plasma foi transferido para um tubo fresco, deixando uma altura fixa de 0,5 cm sobrenadante do plasma acima do sedimento para evitar perturbar o sedimento [11]. Foi armazenado a -80 ° C em 450 mL alíquotas. Oito pares de amostras de tecidos foram recolhidos a partir de oito pacientes GC com os níveis mais altos de plasma de miR-223 e miR-21, e os níveis mais baixos de plasma de miR-218 do que os controlos saudáveis, após a ressecção cirúrgica, e cerca de cortar a quadrados de 1 mm e imediatamente congelada em azoto líquido.
Extração de RNA
os ARNs totais foram extraídos a partir de 400 ul de plasma, utilizando o Kit de miRvana PARIS (Ambion) de acordo com o protocolo do fabricante, e fluido com 105 ul de pré-aquecida ( 95 ° C solução) eluição. Para permitir a normalização da variação de amostra-a-amostra na fase de isolamento de ARN, 10 ml de 0,05 mM sintética
C. elegans
miR-39 (RNA sintético oligo-nucleótidos sintetizados por GenePharma) foi adicionado a cada amostra desnaturada depois de combinar a amostra de plasma com A desnaturação solução [11]. Para os tecidos congelados, o RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante, e finalmente ressuspenso em 60 ul de (95 ° C) de água pré-aquecido isento de nuclease.
quantitativa Reverse transcriptase reacção em Cadeia da polimerase (qRT-PCR)
A reacção de transcrição reversa foi levada a cabo usando um Taqman MicroRNA transcrição reversa Kit (Applied Biosystems). Sintetizou-se ADNc em 5 volumes il contendo 1,67 ul de extracto de ARN, 0,5 � de 10 x tampão de transcrição reversa, com 0,05 ul de dNTPs 100 mM, 0,063 ul de ARNase (20 L Inibidor ul
-1), 0,33 ul de Mutiscribe transcriptase reversa (50 U ul
-1), 0,5 l de primer específico para o gene e 1.887 mL de água livre de nuclease. As reacções foram incubadas a 16 ° C durante 30 min, seguido de 42 ° C durante 30 min, em seguida 85 ° C durante 5 min antes de ser realizada a 4 ° C. O cDNA sintetizado foi diluída 2 vezes por água livre de armas nucleares. As reacções de PCR quantitativas foram realizadas usando 2 mL de solução de cDNA, 5 ul de TaqMan 2 × perfeito Mistura de PCR (Takara), 0,25 ul de iniciadores específicos de gene /sonda (TaqMan ® microARN Ensaios, da Applied Biosystems. Tabela S1) e 2,75 ul de água livre de nuclease em um volume final de 10 mL, e executado em um Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc) termociclador. As misturas de reacção foram incubadas a 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 30 s. O limiar de ciclo (
C
t) Os valores foram calculados com o software Bio-Rad IQ5 2.1 Standard Edition Sistema Óptico 2.1.94.0617.
As concentrações plasmáticas de miRNA foram calculados utilizando um padrão curva construído usando miARNs sintéticos [22]. Os miARNs referência padrão foram amplificados para cada reacção. No entanto, a expressão de miRNAs de amostras de tecido foi normalizada utilizando a 2
-ΔΔ
C
método t do
C
valores t dos miRNAs de interesse em relação ao RNU6B.
Normalização de dados experimentais qRT-PCR a partir de plasma usando Synthetic C. elegans miR-39
C. elegans
miR-39, que não tem homologia de sequência com miARNs humanos, foi selecionado para normalizar os dados experimentais de qRT-PCR. quantidades conhecidas de síntese
C. elegans
miR-39 foram diluídas para produzir
C
valores de t dentro do
C
faixas de valores t das curvas padrão de miRNA. Nós empiricamente adicionados 10 ml de 0,05 mM sintética
C. elegans
miR-39 a 400 ul de plasma depois de combinar a amostra de plasma com desnaturação Solution. O
C. elegans
miR-39 foi amplificado, assim como outros miARNs. A seguinte fórmula foi usada para ajustar o
C
valores de t de miRNAs (MIR-223, miR-21, miR-218 e miR-25) em todas as amostras de plasma: Normalized_
C
valor t para o miRNA na amostra = Raw_
C
t valor – [(SpikeIn_ Average_
C
valor t da amostra dada) – (Median_ SpikeIn_
C
t)] [11]. O normalized_
C
valor t foi então usado para calcular a concentração de cada miRNA.
Análise Estatística
O teste de Mann-Whitney foi usado para comparar as diferenças em concentrações de miRNA de plasma e os rácios de miRNA entre o grupo de câncer e o grupo saudável. A dois lados χ
2 teste foi usado para comparar as diferenças de sexo, idade ou estado de infecção Hp entre os pacientes do GC e os controles saudáveis. ANOVA foi utilizado para analisar a relação entre os níveis de miR-223, miR-21, o miR-218 e as fases TNM. Receptor-operando curvas characteristic (ROC) e a área sob a curva ROC (AUC) foram usadas para avaliar a viabilidade do uso de níveis plasmáticos de miARNs como ferramentas de diagnóstico para a detecção de GC. O índice de Youden foi usado para selecionar os valores de corte ótimos. A
valor P
inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS 13.0 e gráficos foram gerados usando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, Caligornia).
Resultados
Caracteriza de Assuntos
Cento e quarenta indivíduos, incluindo 70 pacientes do GC e 70 indivíduos de controle saudáveis, foram recrutados para este estudo. Não foram encontradas diferenças significativas no sexo ou idade entre as pacientes do GC e os controles saudáveis (
P
= 0,371,
P
= 0,398, χ
2 de teste, respectivamente). estado da infecção Hp foi significativamente diferente entre os pacientes do GC e os controles saudáveis (
P
= 0,042) (tabela 1).
Avaliação de RT-PCR quantitativo para medir os miRNAs no plasma
para definir a faixa dinâmica e sensibilidade do miRNA quantificação por PCR em tempo real, os sintéticos miRNAs de cadeia simples foram diluídos em série 10 vezes a partir de concentrações de 0,1 a 0,000001 fmol para miR-223, miR-218, miR- 25 e miR-21 sobre a recomendação do Painel de Referência GenePharma miRNA. A linearidade da RT-PCR quantitativa entre os valores logarítmicas dos miRNAs de entrada e o
C
valores de t foi confirmada para cada miRNA sintética, miR-223, miR-218, miR-25 e miR -21 (R
2 = 0,997, R
2 = 0,998, R
2 = 0,993 e R
2 = 0,999, respectivamente) (Figura 1).
de Dez dobrar diluição em série de miARN sintético foi utilizado para gerar as curvas padrão. A linearidade foi confirmada dentro destas concentrações para miR-21, o miR-223, o miR-218 e miR-25 variando ,1-,000001 fmol. (
miR-21
: y = -3.337x + 14,77 (R
2 = 0,999);
miR-223
: y = -3.121x + 17,37 (R
2 = 0,997);
miR-218
: y = -3.071x + 17,79 (R
2 = 0,998);
miR-25
: y = -3.114x + 17,47 ( R
2 = 0,993)).
blindagem preliminar de Plasma miRNAs que pode monitorar GC
Quatro miRNAs, miR-223, miR-218, miR-25 e mir -21, foram expressas de forma aberrante em tecidos GC. Para investigar se os níveis de quatro miRNAs presente desregulação no plasma de pacientes com GC, inicialmente medidos os níveis plasmáticos de quatro miRNAs em 10 pacientes do GC e 10 controles saudáveis. Como esperado, os níveis plasmáticos de miR-223 e miR-21 foram significativamente mais elevados em pacientes de GC do que em controlos saudáveis (
P
0,001), ao passo que o miR-218 eram significativamente mais baixos (
P
0,001). No entanto, os níveis plasmáticos de miR-25 não foram significativamente diferentes entre os pacientes do GC e os controles saudáveis (
P
= 0,970) (Figura 2 (A-D)). Tem sido relatado que os níveis de miR-21 no plasma GC poderiam reflectir aqueles em tecido GC principal [12]. Para investigar se os níveis de três miARNs (miR-223, o miR-218 e miR-21) no plasma GC pode reflectir aqueles em tecido GC primária, foi testada a níveis de três miARNs em oito pares de tecido GC e tecido normal adjacente amostras dos pacientes 8 GC cujos níveis de miR-223 de plasma, de miR-21 foram significativamente mais elevados, e miR-218 foi significativamente menor. Tal como mostrado na Figura 2E, os níveis de miR-223 de expressão foram mais elevados em tecidos de GC primárias do que nos controlos, em sete dos oito pacientes analisados (87,5%) e miR-21 em oito pacientes (100%), ao passo que o miR-218 estava inferior em sete pacientes (87,5%), sugerindo que os níveis destes três miRNAs no plasma GC refletido aqueles em tecido GC primário.
gráficos de dispersão de pontos dos níveis plasmáticos de quatro miRNAs em pacientes com câncer gástrico (GC, n = 10) e sujeitos de controlo saudáveis (NC; n = 10). gráficos de dispersão de pontos mostram os níveis plasmáticos de
miR-223
(A),
miR-21
(B),
miR-218
(C) e
miR-25
(D). As linhas nos gráficos de dispersão de pontos denotam as medianas. (E) Bombos de os níveis de expressão de miR-223, miR-21 e miR-218 em tecidos GC primários e tecidos normais emparelhados. Os níveis de miR-223 de expressão foram mais elevados em tecidos de GC primárias em sete dos oito pacientes analisados (87,5%) e miR-21 em oito pacientes (100%), ao passo que o miR-218 foi inferior em sete pacientes (87,5%) do que em tecidos normais emparelhadas. Todos os ensaios foram repetidos três vezes em duplicados.
Os níveis plasmáticos de miR-223, miR-21, miR-218 e miR-25 foram validados em larga escala
Para avaliar os níveis de plasma acima de quatro miARNs como marcadores de diagnóstico para a detecção de GC, GC mais 60 doentes e 60 indivíduos de controlo saudáveis foram adicionados neste ensaio de validação. Como mostrado na Figura 3, os níveis de miR-223 e miR-21 foram significativamente mais elevadas no plasma de GC do que no controlo (
P
0,001), enquanto que o miR-218 foi significativamente menor (
P
0,001). No entanto, os níveis plasmáticos de miR-25 não foram significativamente diferentes entre os pacientes do GC e os controles saudáveis (
P
= 0,082) (Figura S1). Os valores da concentração dos quatro miARNs medidos no plasma de sujeitos foram apresentados na Tabela S2. ROC análises da curva foram realizados para avaliar o valor diagnóstico para os três miRNAs plasma e revelou que os três miRNAs plasma foram biomarcadores valiosos para distinguir GC dos controles normais com AUCs (áreas sob a curva ROC) da CI 0,9089 (95%: 0,8598 para 0,9580 ) para miR-223, 0,7944 (IC 95%: 0,7211-0,8677) para miR-21 e 0,7432 (IC 95%: 0,6628-0,8236) para miR-218. No valor de corte ideal de 0,7286, com o valor de sensibilidade + especificidade-1 considerada como máxima para miR-223, a sensibilidade e a especificidade foram de 84,29% e 88,57%; no valor de corte de 0,5000 para o miR-21, a sensibilidade e especificidade foram de 74,29% e 75,71%, e ao corte de 0,3858 para o miR-218, a sensibilidade e especificidade foram de 94,29% e 44,29%. Para elevar o valor de diagnóstico, a curva ROC combinação análises foram realizadas por (miR-223 multiplicado por miR-21) dividido por miR-218. A proporção de (miR-223 × miR-21) /o miR-218 apresentaram o maior valor de AUC de 0,9531 (IC 95%: 0,9222-0,9839) e o valor de corte ideal de 0,7715, a sensibilidade e a especificidade foram de 84,29% e 92,86% , o que indicou que o assinatura combinação tem um forte potencial valor de diagnóstico para a detecção de GC.
os diagramas de caixa mostram as concentrações plasmáticas de miR-223 (a), o miR-21 (B), o miR-218 (C) e (miR-223 × miR-21) /o miR-218 (D) em pacientes GC (GC, n = 70) e controlos saudáveis (NC; n = 70). As linhas dentro das caixas representam as medianas. Os bigodes de diagramas de caixa: Min Max. Os gráficos de características de operação do receptor (ROC) mostram a área sob as curvas (AUCs) de miR-223 (E), o miR-21 (F), o miR-218 (G) e (miR-223 × miR-21) /miR-218 (H) para distinguir os pacientes GC dos controles saudáveis. O intervalo entre o 5
th e 95
th percentis denota o nível de confiança e os resultados do relatório mostram como Fraction. Todos os ensaios foram repetidos três vezes em duplicados.
Os níveis plasmáticos de miR-223, miR-218 e miR-21 no GC pacientes com diferentes
Estado Clínica
Os níveis plasmáticos de estes três miRNAs nos pacientes GC em diferentes fases TNM (12 com I, 11 com II, 36 com III ou 11 com IV) foram analisados para determinar se os três miRNAs plasma pode detectar em estágio inicial GC. Como mostrado na Figura 4A, os níveis plasmáticos dos três miARNs não foram significativamente diferentes em quatro fases (de miR-223,
P
= 0,244; miR-218,
P
= 0,664; miR plasma -21,
P
= 0,596), no entanto, cada um dos quatro estágios, incluindo pacientes em estágio I tinha significativamente elevados miR-223 e miR-21 quando comparados com os controles saudáveis (P 0,01), e miR -218 diminuiu significativamente no estágio II, III e IV (
P Art 0,01), ao passo que miR-218 não foram significativamente diferentes entre o grupo I e os controles saudáveis (
P
= 0,071). Além disso, comparou-se os níveis dos três miARNs no plasma dos pacientes com metástases GC com aqueles sem. Como mostrado na Figura 4B, os níveis plasmáticos de três miRNAs não apresentaram diferenças significativas entre os pacientes do GC com metástase e aqueles sem (miR-223,
P
= 0,320; miR-218,
P
= 0,979;. miR-21,
P
= 0,310)
(a) os diagramas de caixa das concentrações plasmáticas de miR-223 (painel esquerdo), miR-21 (painel do meio ) e miR-218 (painel direito) em controlos saudáveis (NC; n = 70) e do cancro gástrico (GC, n = 70) pacientes em diferentes fases TNM (12 com I, 11, com II, 36 com III e 11 com IV ). parcelas (B) da caixa das concentrações plasmáticas de miR-223 (painel esquerdo), miR-21 (painel do meio) e miR-218 (painel direito) em pacientes GC com ou sem metástase. As linhas dentro das caixas representam as medianas. Os bigodes de diagramas de caixa: Min Max
Relação entre os níveis plasmáticos de miR-223, miR-21, miR-218 e Hp Estado Infecção de Assuntos
Além disso. , testou-se o estado de infecção por Helicobacter pylori em 140 indivíduos, como descrito acima, e analisados os níveis plasmáticos das três miARNs nos 70 pacientes GC (43 com infecção Hp e 27 sem) e os 70 sujeitos de controlo saudáveis (31 com infecção Hp e 39 sem) para avaliar a relação entre os níveis plasmáticos de três miRNAs e estado de infecção Hp dos sujeitos. Como mostrado na Figura 5, os níveis plasmáticos de miR-21 (
P
= 0,875,
P
= 0,527) e miR-218 (
P
= 0,097,
P
= 0,539) não foram significativamente diferentes entre os pacientes do GC com infecção Hp e os que não, e entre os controles saudáveis com infecção pelo Hp e aqueles sem, respectivamente. No entanto, miR-223 foi significativamente maior nos pacientes do GC com infecção Hp do que aqueles sem (
P
= 0,014), e significativamente maior nos controles saudáveis com infecção pelo Hp do que aqueles sem (
P
= 0,016). Os níveis plasmáticos de miR-223 (
P Art 0,001) e miR-21 (
P Art 0,001) foram significativamente elevados nos pacientes com infecção GC Hp ou cuja sem quando comparado com os controles saudáveis com infecção pelo Hp ou cujos sem, ao passo que miR-218 foi significativamente menor (
P Art 0,05). Estes dados fornecem fortes evidências de que as três assinaturas de miRNA pode distinguir pacientes GC com ou sem infecção Hp de controles saudáveis.
Os diagramas de caixa das concentrações plasmáticas de miR-223, miR-21 e miR-218 em pacientes GC com
H. pylori
infecção (Com, n = 43) e sem (Sem, n = 27), e no controle de indivíduos saudáveis com
H. pylori
infecção (Com, n = 31) e os que não têm (Sem, n = 39). Nota: *,
P Art 0,05; **,
P Art 0,01. Os diagramas de caixa mostram os níveis plasmáticos de miR-223 (A), o miR-21 (B) e miR-218 (C). As linhas dentro das caixas representam as medianas. Os bigodes de diagramas de caixa: Min. A Max
Discussão
Neste estudo, os níveis de quatro miRNAs (MIR-223, miR-218, miR-21 e miR- 25) no plasma de 70 pacientes do GC e 70 controles saudáveis foram analisados. Consistente com os estudos anteriores por tsujiura et al [12], o nosso ensaio, também mostraram que os níveis plasmáticos significativamente mais elevados de miR-21 em pacientes de GC. Nós descobrimos que os níveis de miR-223 eram significativamente mais elevados no plasma em GC do que o controlo, enquanto que o miR-218 foi significativamente menor. As análises de ROC combinada revelaram uma maior AUC de 0,9531 com sensibilidade 84.29% e 92.86% de especificidade para a proporção de (miR-223 × miR-21) /o miR-218 em discriminar GC dos controlos. Analisamos também os níveis plasmáticos de miR-223, miR-21, miR-218 em pacientes GC em diferentes status clínico (fase TNM ou metástase) e da relação entre os níveis plasmáticos de três miRNAs e estado de infecção Hp dos sujeitos.
Embora o miR-223 tem sido relatado para ser quase exclusivamente expressa na medula óssea [23], a sua sobre-expressão foi observada em muitos tipos de cancro, tais como o carcinoma do esófago [16], o carcinoma hepatocelular [24], e GC [14], [15]. Recentemente, Xiaohua Li relatou que miR-223 só foi sobre-expressos em células de câncer gástrico metastático e estimulado não metastático migração células cancerosas gástricas e invasão [25]. Por que os níveis plasmáticos de miR-223 foram significativamente maiores em pacientes com GC-fase inicial? No microambiente GC, muitas células associados a tumores, tais como macrófagos, células mielóides, células dendríticas e células T, possuem a capacidade de libertar os exossomas, que shuttle tanto ARNm e microARN a outras células ou circulação [26]. Para GC em estágio inicial, miR-223 pode ser regulado para cima em algumas células associadas a tumores e entregue para o sangue periférico via exosmes. Evidências recentes indicaram que miR-223 liberado por macrófagos foi transportado em células de cancro da mama e regulamentou a capacidade de invasão das células cancerosas da mama [27]. Demonstrou-se que a restauração do miR-218 suprime a expressão Robo1 e inibe a invasão de células de câncer gástrico e metástase
in vitro
e
in vivo
[17]. A sobre-expressão de miR-218 resultou numa redução da actividade significativamente o crescimento celular e a invasão de células de células AGS comparada com a do controlo [20]. Gao C et al [21] relataram que os níveis de expressão de miR-218 foram significativamente reduzidos nos tecidos de GC, na mucosa gástrica por H. pylori-infected, e em células de H. pylori AGS-infectados. Em nosso estudo, os níveis plasmáticos de miR-218 não foram significativamente diferentes entre os pacientes do GC com infecção Hp e os que não, ou entre indivíduos de controle saudáveis com infecção pelo Hp e aqueles sem. Os níveis de miARN pode ser diferente entre o plasma e GC mucosa gástrica. MiR-21 é sobre-expressos em vários cancros, incluindo o cancro da mama [28], o cancro do pulmão [29], o cancro do cólon [30], e GC [18], [19]. Embora tsujiura et al [12] relataram que os níveis plasmáticos de miR-21 estavam significativamente aumentados em pacientes com GC, os seus níveis no plasma de doentes em diferentes GC veados TNM não foram identificados.
O aumento do número de trabalhos relatados que miRNAs circulantes podem servir como biomarcadores não invasivos para a detecção de GC. Recentemente, Hanshao Liu relatado que o soro de miR-378 foi significativamente elevados nos pacientes com GC fase TNM I, sugerindo que esta assinatura de miARN pode servir como um novo biomarcador não invasivo para detecção precoce de GC [31]. Mas o estado da infecção Hp nos pacientes do GC e controles saudáveis não foram mencionados. É bem sabido que a infecção Hp é uma das principais causas de CG, incluindo o adenocarcinoma gástrico, linfoma de MALT gástrico. Se os níveis de plasma /soro dos miARNs circulantes específicas só foram desregulado em pacientes GC com infecção Hp mas não na que aqueles sem, os miARN pode servir como biomarcadores para a detecção de pacientes com infecção HP, em vez da detecção de pacientes com GC.
neste estudo, embora foram analisados os níveis plasmáticos de miR-223, miR-21 e miR-218 em pacientes GC em diferentes fases TNM, o número de amostras GC em estágio inicial foi modesto. O número de miRNAs de plasma testados no conjunto de treinamento foi limitado. Na investigação futuro, poderemos ter acesso a mais número de amostras GC em estágio inicial para avaliar o papel de plasma miR-223, miR-21, miR-218 ou outros miRNAs plasma associado a GC na detecção precoce da GC.
para a finalidade de pesquisar biomarcadores baseados no sangue eficazes para a detecção de GC para prolongar a sobrevivência de pacientes com GC cedo, muitos investigadores têm-se centrado no circulante miARNs, que foram recentemente descritos para servir como um biomarcador eficaz e não invasivo para detectar vários cancros ou outras doenças [32] – [35]. Embora a sensibilidade e especificidade de circulação de biomarcadores para a detecção de miRNA GC são muito mais elevados do que a dos marcadores biológicos (CA19-9 e CEA) usados atualmente, é um longo caminho a percorrer antes de circular miRNAs como um diagnóstico clínico são usados para detectar GC , porque os níveis de um miARN circulante pode ser significativamente maior ou menor em várias doenças. Estudos futuros circulantes de biomarcadores miRNA podem se concentrar em combinar os perfis dos miRNAs circulantes de todas as doenças comuns para obter os biomarcadores específicos para a detecção de doenças única expressão. Embora Jianning Canção [36] recomendou miR-16 e miR-93 genes de referência como adequados para a análise de miRNA soro para pacientes do GC e controles saudáveis, o tamanho da amostra é modesto. Os métodos de normalização utilizados para determinar os níveis de miRNAs circulantes devem ser unificados.
Em conclusão, nós identificamos que três miRNAs plasma (miR-223, miR-21 e miR-218) pode potencialmente servir como novos biomarcadores não invasivos para a detecção de GC. Se miR-223 e miR-21 tem uma capacidade de detectar em estágio inicial GC será identificada em estudos futuros.
Informações de Apoio
Figura S1.
Validação dos níveis plasmáticos de miR-25 em pacientes de GC e controlos saudáveis. Os diagramas de caixa das concentrações plasmáticas de miR-25 em pacientes GC (GC, n = 70) e controles saudáveis (NC, n = 70). As linhas dentro das caixas representam as medianas. Os bigodes de diagramas de caixa: Min Max. Não foi observada diferença significativa entre os pacientes do GC e controle de indivíduos saudáveis
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041629.s001
(TIF)
Tabela S1. Tours A microRNAs maduros e sua correspondência primer /sonda AB ensaio ID.
doi: 10.1371 /journal.pone.0041629.s002
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Tabela S2.
Os valores da concentração dos quatro miARNs medidos no plasma de sujeitos.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041629.s003
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Reconhecimentos
Agradecemos Yun Zhao para obter suporte técnico