PLOS ONE: Interleucina-6 Expressão sob estresse gravitacional devido à vibração e Hipergravidade em células foliculares cancro de tiróide

Abstract

Sabe-se que a exposição de linhas celulares

in vitro

vôos parabólicos para muda seus padrões de produção de expressão de genes e proteínas. Parabólicos voos e voo espacial, em geral, são acompanhados por hipergravidade transiente e a vibração, o que pode afetar as células e, por conseguinte, tem que ser considerada também. Para estimar o possível impacto da hipergravidade transitória e vibração, nós investigamos os efeitos dessas forças separadamente usando instalações terrestres dedicadas. Nós colocado tiróide folicular ML-1 e CGTH W-1 células cancerosas em uma centrífuga específica (de música multi Amostra Incubadora de centrífuga; SAHC braço curto Centrífuga Humana) simulando as fases hipergravidade que ocorrem durante um (P1) e 31 parábolas (P31) de parabólica vôos, respectivamente. No dispositivo Vibraplex, as mesmas linhas celulares foram tratadas com ondas de vibração correspondente aos que ocorrem durante um voo parabólico toda duração de duas horas. Depois de vários tratamentos, as células foram colhidas e analisadas por quantitativa PCR em tempo real, com foco em genes envolvidos na formação (

ACTB

,

MYO9

,

TUBB

,

VIM

,

TLN1

, e

ITGB1

) e modulação (

EZR

,

RDX

, e

MSN

) o citoesqueleto, bem como os fatores de crescimento de codificação (

EGF

,

CTGF

,

IL6

, e

IL8

) ou proteínas quinases (

PRKAA1

e

PRKCA

). A análise revelou alterações em vários genes em ambas as linhas celulares; no entanto, menos genes foram afetados no ML-1 do que as células CGTH W-1. Curiosamente,

IL6

era o único gene cuja expressão foi alterada em ambas as linhas de células por cada tratamento, enquanto

PKCA

transcrição permaneceram inalterados em todos os experimentos. Conclui-se que um mecanismo PKCa-independente do

IL6

ativação do gene é muito sensível às forças físicas nas células da tireóide cultivadas

in vitro

como monocamadas

Citation:. Ma X, Wehland H, Aleshcheva L, Hauslage J, K Wasser, Hemmersbach R, et al. (2013) A interleucina-6 Expressão sob estresse gravitacional devido à vibração e Hipergravidade em células foliculares cancro de tiróide. PLoS ONE 8 (7): e68140. doi: 10.1371 /journal.pone.0068140

editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Abril 2013; Aceito: 25 de maio de 2013; Publicação: 02 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Espacial alemã Agência DLR (BMWi conceder 50WB1124), bem como pela Agência Espacial Europeia (ESA concessão CORA-GBF-2010-203 com número do contrato 4000102119) e da Universidade de Aarhus, na Dinamarca. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

In vivo

tumores compreendem células neoplásicas, células estromais não-malignas e células hematopoiéticas migratórios [1]. Os diferentes tumores são dominadas por células cancerígenas heterogêneas fenotipicamente e funcionalmente, que orientam as complexas interações entre os tipos de células e regulam o crescimento do tumor, progressão, metástase e angiogênese [2]. Assim, as células neoplásicas ou cancerosas são o constituinte principal dos tumores malignos. Sua análise pode indicar possíveis caminhos de desenvolvimento tumor maligno e tratamento.

Estamos focados em carcinomas foliculares, que são tumores epiteliais malignos que expressam padrões foliculares. Normalmente, eles são encapsulados [3] – [5].

In vivo

, as células neoplásicas que impulsionam o progresso do câncer são células epiteliais em diferentes fases de desdiferenciação. células de cancro folicular da tiróide neoplásica estão representados pelas linhas de ML-1, FTC-133 e CGTH-W1 para este estudo [5] – [7]. Nos últimos anos, as células de cancro da tiróide têm sido mostrados para serem afectadas incubado num posicionamento da máquina aleatório (RPM) ou um clinostat, dispositivos desenvolvido para simular a microgravidade na Terra [8] – [12]. Encontrámos alterações no crescimento de duas a três dimensões de células de cancro da tiróide cultivadas em RPM, acompanhada por uma alteração na concentração de diversas proteínas e a expressão de um número considerável de genes [8] -. [12]

O RPM é um dispositivo projetado para simular a microgravidade na Terra. Para este efeito, as amostras são rodadas em torno de todas as três direcções espaciais de uma maneira aleatória. No decurso da experiência, a direcção do vector de gravidade muda constantemente e os seus efeitos podem ser anulados com o tempo [13]. O comportamento alterado das células cancerosas incubadas nesta máquina pode ser devido à gravidade alterada (microgravidade simulada). Para provar isso, expusemos as células cancerosas da tireóide e células endoteliais à microgravidade real de curto prazo gerados em aeronaves durante os voos parabólicos. A exposição a microgravidade verdadeira conduziu a resultados semelhantes, mas não idênticas, em comparação com as experiências RPM [14], [15]. Estas diferenças podem ser devido ao facto de a rotação não simula microgravidade para o nosso sistema celular escolhido e parâmetros investigados, ou que é interrompido por microgravidade fases hipergravidade e acompanhada por vibrações. Durante um vôo parabólico, cada um dos 31 parábolas normalmente voadas inclui 22 s de microgravidade e períodos de 1

g

e 1,8

g

, bem como a vibração causada pelo mecanismo [14], [16].

para investigar os efeitos mecânicos complexos que afetam as células durante um voo parabólico, é importante para caracterizar a influência de hipergravidade de curto prazo e vibração em células sem expô-los à microgravidade. Assim, foram realizados testes de simulação e hipergravidade vibração separadas, utilizando métodos que simulavam o perfil de aceleração de um ou parábolas 31, bem como as vibrações que ocorrem durante todo o voo. Além disso, nós nos concentramos sobre a expressão das citocinas IL-6 e IL-8, bem como proteínas quinases.

Métodos

Cultura celular

As linhas celulares de cancro da tiróide humanos ML-1 [5] e CGTH-W1 [6] foram semeadas em T75 cm

2 ou T25 cm

2 frascos de cultura e alimentados meio RPMI 1640 (Invitrogen, Eggenstein, Alemanha) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Biochrom, Berlim, Alemanha), 100 unidades de penicilina /ml, e 100 g de estreptomicina /mL, e cresceu até confluência.

Experimentos hipergravidade

hipergravidade foi gerada usando o exemplo de várias Incubadora Centrífuga ( música, dlr, Colónia, Alemanha), que foi colocado numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO

2. Conduzido por um programa de computador especial, as células foram expostas a um perfil hipergravidade que ocorre durante uma parábola (P1) e 31 parábolas (P31). Este dispositivo foi usado para tratar as células, cujos ARNm foi determinada posteriormente. Confluently células cultivadas a partir de frascos de cultura de células T75 foram tripsinizadas e transferidas para tubos de 5 mL. Os tubos foram cheios com meio de cultura de células e as células deixadas a equilibrar antes da centrifugação. Correspondendo aos tempos de fixação das células durante um voo parabólico, as células foram expostas quer a um ciclo de dois 20-S-1,8 longa

g

fases interrompidas por uma pausa de 22 s (P1) ou 2 h com duração de 1,8

g

fases (P31). Além disso, foram realizadas experiências sobre o braço curto Centrífuga Humana (SAHC, dlr, Colónia, Alemanha), com células de balões de cultura de célula T75 devido à elevada quantidade de material necessário para a análise. Neste dispositivo, que expuseram as células a uma fase hipergravidade contínua de cerca de 2 horas correspondente a 31 parábolas. Foram coletadas n = 5 estática 1

g

controles e n = 5 1.8

g

hiper

g

amostras para análises de Western blot (n = 5; P31), como bem como n = 5 estática 1

g

controles (P1), n ​​= 5 estática 1

g

controles (P31), e n = 5 1.8

g

hiper-

g

(P1 e P31) para PCR em tempo real, respectivamente. A 1

g

controles foram cultivadas em paralelo em uma incubadora idêntica vizinho.

Experimentos vibração

frascos de cultura T25 com 90% de monocamadas confluentes foram fixados na plataforma Vibraplex em um incubadora a 37 ° C com 5% de CO

2 no ar e tratou-se de acordo com um protocolo publicado anteriormente [14]. Resumidamente, aplicando Vibraplex, as células foram expostas a vibrações comparáveis ​​aos que ocorrem durante os voos parabólicos [16]. Frequências que variam de 0,2 Hz a 14 kHz foram ajustados, correspondentes às três fases: puxar para cima (1,8

g

), queda livre (microgravidade, μ

g

), e puxe (1,8

g

), como registrado e analisado por Schmidt [16] ao longo de aproximadamente 2 horas, que é o tempo que os 31 parábolas de missões parabólicos reais últimos. Em seguida, o meio foi removido e as células raspadas e recolhidas em 3 ml de fosfato frio solução salina tamponada (PBS). Após uma centrifugação subsequente (4000 rpm), o sedimento foi armazenado a -80 ° C para análise de transferência de Western e PCR.

A 1

g

controlos foram cultivadas em separado no mesmo incubador. Foram coletadas n = 5 estáticos 1

g

controlos e n = 5 amostras de vibração 2 horas para análises de Western blot (n = 5; P31), bem como n = 5 amostras para PCR em tempo real, respectivamente.

RNA de isolamento

células para quantitativa PCR em tempo real foram fixadas com RNA

depois

(Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha), na proporção de 4:01. Subsequentemente, os frascos foram armazenados a 4 ° C. Imediatamente antes da utilização, o RNAlater foi substituído por PBS (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha). As células foram raspadas utilizando raspadores de células (Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha), transferidas para tubos e sedimentadas por centrifugação (2500 ×

g

, 10 min, 4 ° C). O RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante para isolar ARN total. As concentrações de RNA e qualidade foram determinadas por espectrofotometria a 260 nm utilizando um instrumento NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA). O ARN isolado tinha uma razão A260 /280 de . 1.5

ADNc para a quanti-PCR em tempo real foi, em seguida, obtidos com o kit de síntese de ADNc First Strand (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) usando 1 ug de ARN total em 20 uL inverter-mistura de reacção de transcrição.

quantitativa PCR em tempo real

Quantitative real-time PCR foi usada para determinar os níveis dos genes de interesse de expressão. O software Primer Express foi utilizada para conceber iniciadores adequados com um t

m de cerca de 60 ° C (Tabela 1).

Os iniciadores foram sintetizados por TIB Molbiol (Berlim, Alemanha). Todos os ensaios foram executados em um Real-Time PCR System StepOnePlus usando o SYBR®Green Power Mix PCR Master (Biosystems ambas aplicadas, Darmstadt, Alemanha). O volume de reacção foi de 25 ul, incluindo 1 ul de ADNc molde e uma concentração do primário final de 500 nM. As condições de PCR foram as seguintes: 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 30 s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C, seguido por um passo de análise de curva de fusão (gradiente de temperatura de 60 ° C a 95 ° C com + 0,3 ° C por ciclo). Se todos os produtos de amplificação mostrou uma única T

m similar ao previsto pelo software Primer Express, as reacções de PCR foram considerados específicos. Cada amostra foi medida em triplicado e foi aplicado o comparativo C

T (ΔΔC

T) método para a quantificação relativa dos níveis de transcrição. 18S rRNA foi usado como um gene de manutenção para normalizar os dados de expressão.

Análise Western Blot

Após o tratamento, as amostras para a análise de transferência de Western foram fixadas por adição de etanol até uma concentração final de 70 %. Para a análise, SDS-PAGE, imunotransf erência e densitometria foram realizadas em seis repetições de acordo com protocolos de rotina [17] – [19]. foram usados ​​anticorpos contra os seguintes antigénios: α-tubulina, pan-actina, β-actina, moesina e ezrina (as diluições foram 1:1000, excepto para pan-actina, 1:4000). Todos os anticorpos foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology Inc. (MA, EUA). Para a quantificação densitométrica das bandas, as membranas manchadas foram digitalizados e analisados ​​usando o programa Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) [20]. Uma vez que nenhuma proteína adequado foi encontrado que pudesse servir como um controle de carga, nas condições experimentais investigadas, nós cuidadosamente carregado quantidades iguais de proteína (40 ug em 10 ul) em cada pista gel e normalizou os dados densitométricos a este valor.

STRING 9,0 Rede Análise

As proteínas investigadas foram tabulados. Para cada proteína, o número de entrada e o gene nome UniProtKB foi adquirida na UniProtKB e estes nomes foram utilizados para a geração de rede com STRING 9,0 (www.string-db.org) [21]. Os números de entrada UniProtKB foram inseridos no formulário de entrada como “múltiplas proteínas” e “Homo sapiens” foi seleccionado como o organismo. O ponto de vista da rede resultante foi baixado imagem a.jpg como.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 16.0 (SPSSS, Inc, Chicago, IL, EUA). Nós empregamos quer ANOVA one-way ou aplicáveis ​​o teste de Mann-Whitney-U onde. As diferenças foram consideradas significativas ao nível do

p Art 0,05. Todos os dados são representados como média ± desvio padrão.

Resultados

genes selecionados e Proteínas

Para testar a influência da vibração e hipergravidade no comportamento das células, investigamos dois cancro da tiróide linhas de celular. Avaliamos proteínas do citoesqueleto porque tínhamos observado anteriormente que o citoesqueleto foi afetada durante os voos parabólicos [14]. Assim, nós nos concentramos em genes e proteínas envolvidas na formação (actina, miosina, tubulina, vimentina, talina e integrina) e modulação (Ezrin, radixina e moesin) o citoesqueleto. Além disso, exploramos estes elementos de codificação de crescimento (IL-6, IL-8, FEG, e CTGF) e cinases de proteínas (PRKCA e PRKAA1). Apesar da diversidade funcional das proteínas, eles formam uma rede de interacções (Fig. 1), com a excepção de PRKAA1, a subunidade catalítica de proteína-quinase de AMP activada (AMPK), que desempenha um papel chave na regulação do metabolismo da energia celular.

variação na expressão de mRNA induzido por vibração

Ambas as linhas celulares continuou a crescer durante o tratamento de vibração duração de duas horas. Depois, a observação microscópica revelou que a fixação das células ainda persistia. No entanto, a determinação de concentrações de ARNm das proteínas demonstrou que as células ML-1 e CGTH-W1 foram afectados de modo diferente por vibração. Enquanto apenas

IL6

concentrações de mRNA de células diminuiu em ML-1, as concentrações dos outros transcritos investigados permaneceram inalterados (Fig. 2). Em CGTH W-1 células, o mRNAs de

CTGF

,

IL6

,

ACTB

,

MSN, ITGB1

e

PRKAA1

foram regulada, enquanto que

TUBB

mRNA foi regulada para baixo. Todos os outros níveis de mRNA não foram afetados pela vibração (Fig. 3). Assim, ML-1 células pareciam ser mais resistente contra vibrações do que as células CGTH-W1.

Gene Diferencial expressão induzida por Curto Prazo Hipergravidade

Durante um vôo parabólico , as células são expostas a vibrações, bem como para hipergravidade. Em experiências de vôo anteriores [14], [15], observou-se que as principais alterações celulares ocorreu durante a primeira parábola. Portanto, aqui, que as células expostas a um perfil de aceleração que ocorre durante a primeira parábola. Mesmo durante estes períodos curtos (2 x 20 segundos) de centrifugação, alterações significativas na transcrição dos nossos genes de interesse ocorreu. Em células mL-1, detectamos significativa diminuição da regulação das concentrações de mRNA de

IL6

e

IL8

, ao passo que não foi observada nenhuma mudança significativa para

TUBB, MYO9, VIM, Esdras; RDX; MSN, EGF, CTGF, PRKCA,

e

PRKAA1

(Fig. 4).

Em CGTH W-1 células, o mRNAs de

CTGF, IL6 , IL8, ITGB1, VIM, TLN1, MYO9B

e

RDX

foram reprimidos, enquanto que as concentrações dos outros mRNAs testados permaneceu un-afetada (Fig. 5). Mais uma vez, ML-1 células apareceu mais resistentes do que as células CGTH W-1, especialmente no que diz respeito às proteínas do citoesqueleto.

mRNA Diferencial Expressão induzida pela exposição repetida a Hipergravidade

Embora o principal efeito de um voo parabólico é observada após o primeiro parábola, foram expostas as células para hipergravidade que ocorre durante um total de 31 parábolas e examinaram os níveis de mRNA depois. A exposição repetida a hipergravidade reverteu os efeitos da primeira parábola sobre

IL6

e

IL8

níveis de mRNA em células ML-1. Agora,

IL6

e

IL8

transcrições foram up-regulada, em conjunto com

CTGF, EZR

e

RDX

mRNAs (Fig. 4).

na linha de células CGTH W-1, a expressão de

ITGB1, VIM, MYO9, RDX, IL6,

e

IL8

diminuiu após P31, enquanto que as concentrações do outros sete tipos de ARNm permaneceram inalterados (Fig. 5). Estes resultados demonstraram que o hipergravidade que ocorre durante 31 parábolas principalmente-regula a transcrição dos nossos genes-alvo em células ML-1, mas sub-regula-los em células CGTH W-1.

Alterações na proteína intracelular concentrações induzida pela vibração ou Hipergravidade que ocorre durante 31 Parábolas

os dados publicados sobre as correlações entre os níveis de mRNA intracelulares e concentrações de proteína são incompatíveis [22] – [24]. Por conseguinte, foram investigados os concentrações de proteína de actina, tubulina, moesina e ezrina, em adição com as concentrações de mRNA. Usando um anticorpo que se liga a todas as variantes de cadeias de actina (pan-actina), observou-se que as concentrações de proteína pan-actina foram reduzidos em cada linha de células depois de cada tipo de tratamento, quando comparado com 1

g

células de controlo ( Fig. 6A, 7A). Os níveis de proteína de cadeias alfa-tubulina foram diferentes em ML-1 e células CTGH W-1. Em células ML-1, as concentrações de proteína diminuíram após o tratamento de vibração e a exposição hipergravidade, enquanto o inverso foi observado em células CGTH W-1 (Fig. 6C e 7C). Nestes casos, uma comparação directa entre a proteína e as concentrações de mRNA não foi possível porque vários genes codificam as proteínas marcadas pelos anticorpos. Quando foi utilizado um anticorpo dirigido contra apenas cadeias de beta-actina, que são codificadas pelo

ACTB

gene, não se observaram alterações nas células ML-1 após tratamento de vibração e concentrações aumentadas após exposição a hipergravidade. Em células CTGH W-1, a sobre-regulação desta proteína foi observada após a vibração e uma regulação negativa após exposição hipergravidade (Fig. 6B e 7B). Assim, a proteína e as mudanças de ARNm correspondeu bem em células CGTH W-1 após exposição a vibrações (Fig. 3, 7B), mas não seguinte hipergravidade repetida (Fig. 5, 7B). Houve também uma correlação em células ML-1 entre a proteína e as mudanças de ARNm em resposta à vibração (Fig. 2), mas não para exposição hipergravidade (Fig. 4) [14]. Além disso, análises de Western blot foram realizadas de moesina e de ezrina. Em células ML-1, apenas a ezrina foi influenciado por vibração, enquanto moesina e ezrina foram afectados por hipergravidade (Fig. 6D e 6E). Em células CGTH W-1, ambos os tipos de proteínas foram regulados negativamente pela vibração, mas apenas moesin expressão da proteína diminuiu sob hipergravidade (Fig. 7D e 7E). Nestes casos, as concentrações de proteína e mRNA correspondeu apenas em três dos oito análises (Fig. 3-7).

Discussão

Para estudar a possível influência da vibração ou hipergravidade em células de cancro da tiróide, que seleccionado proteínas que estão envolvidas na manutenção ou modular as estruturas celulares. A razão para a escolha deles era devido às observações anteriores de que estas proteínas reagem com mais sensibilidade quando as células são expostas a microgravidade [8], [10], [12]. Além disso, procurou-se encontrar um alvo de proteína /gene direta das forças mecânicas que por sua vez desencadeou mudanças em outras proteínas [25].

As proteínas cujos genes foram investigados têm diferentes funções celulares. Actina, miosina, tubulina, vimentina e são os principais componentes do citoesqueleto, de apoio e de reforço da estrutura de células [26]. Ezrin e moesina pertencem à família MTC, que também inclui radixina. Estas proteínas podem interagir com ambas as proteínas da membrana do plasma e actina filamentosa [27], e regular a organização e dinâmica do citoesqueleto de actina em geral [28]. Ligado a filamentos de actina via a talina, a integrina penetra a membrana celular e interage com a matriz extracelular que rodeia as células. Esta ligação é necessária para transmitir sinais a partir do ambiente da célula para o interior [29]. fator epitelial de crescimento (EGF), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) e as interleucinas 6 e 8 são produzidos pelas células da tireóide e agir em seu citoesqueleto de uma maneira autócrina [30].

No presente estudo, a comparação de proteína e as concentrações de mRNA relacionados revelou fraca correlação com a matéria de beta-actina, Ezrin e moesin. Isto pode ser explicado pela recente descoberta de que a abundância de proteínas celulares é predominantemente controlada ao nível da tradução [31]. Ainda assim, os dados de expressão de genes pode fornecer informações importantes sobre a variações na estrutura celular induzida por vários estímulos.

a proteína quinase C alfa pertence à família da cinase de proteína C e é um regulador do citoesqueleto, [33] [32]. Ao nível da proteína, que é activado pela cinase mTORC2 [34]. a expressão do gene da PKC-alfa pode ser modificada por agentes químicos, factores de crescimento e hormonas [35]. No nosso sistema, as forças físicas aplicada às células não influenciou esta enzima. Em muitos sistemas, a PKC-alfa activa a expressão do gene de IL-6 [36], [37], que é uma citoquina multifuncional expressa por tireócitos humanos [38], [39]. Observou-se que

IL6

expressão foi modificado, enquanto que a expressão do gene PKC-alpha permaneceram inalterados. Assim, concluiu-se que as mudanças observadas na

IL6

níveis de mRNA ocorreu independentemente de PKC alfa. É conhecido a partir da literatura que diferentes mecanismos reguladores são responsáveis ​​por

IL6

expressão do gene [40]. Em 5 FRTL células da tireóide,

IL6

expressão do mRNA é reforçada por mecanismos que envolvem a via de cAMP /PKA [41]. Além disso, a tensão mecânica ou aumenta alongamento produção de IL-6 em células epiteliais do pulmão humano e células do músculo liso através de NFkB [42], [43]. Para o melhor de nosso conhecimento, que era até agora desconhecida ou não o estresse biomecânico induzida a produção de IL-6 em células da tireóide. Nós fizemos anteriormente observar que

IL6

expressão do gene foi reforçada em FTC-133 células de câncer de tireóide, que permaneceram aderentes durante 24 horas no RPM [12]. Em células endoteliais, foi observada a IL-6 Sensibilidade a microgravidade simulada.

IL6

ativação do gene foi maior em células aderentes e formando-tubo após 5 dias no RPM do que em

células 1 g

controle. Durante os dois dias seguintes,

IL6

ARNm concentração diminuiu em células aderentes, mas aumentou em células formadoras de tubo [44]. Estas alterações bem correlacionados com os dos níveis de proteína IL-6, como quantidades mais elevadas de IL-6 as proteínas foram segregadas para o sobrenadante da cultura quando as células endoteliais foram incubadas na RPM durante 24 horas em comparação com as células de controlo. Este efeito foi abolida na presença de bFGF [45].

De um ponto de vista científico, no entanto, é muito mais interessante que as concentrações de mRNA de factores de crescimento variou sensivelmente mais sob a influência das forças mecânicas geradas hipergravidade por vibração e que os níveis de mRNA de proteínas que se acumulam ou modulam o citoesqueleto directamente.

IL6

níveis alterados no âmbito de cada tratamento. Além

EZR

em células mL-1 e

TUBB

em células CGTH-W1, todas as mudanças de transcrição ocorreram no mesmo sentido que a alteração do

IL6

gene. Além disso, alterações na IL-6 em quantidades de proteínas de sobrenadantes de cultura foram observados mais cedo, quando as células endoteliais foram cultivadas sob condições de gravidade alterados em um RPM [45]. Assim, podemos concluir que a IL-6 desempenha um papel importante quando as forças mecânicas agir em células da tireóide humanos

in vitro

. Se esta conclusão é verdadeira, seria explicar por que tantas alterações genéticas são observadas após as células foram expostas à microgravidade [46], enquanto organismos inteiros são influenciados moderadamente durante os períodos comparáveis ​​de exposição. Nos seres humanos,

IL6

expressão de genes é regulada por hormônios como estrogênio e testosterona [40]. Hormônios que controlam

IL6

expressão estão ausentes quando as células isoladas são cultivadas

in vitro

.

No futuro, será importante ter esses efeitos em conta na realização de experiências em microgravidade real. Especialmente as configurações com mais longos ou mais fases de hipergravidade e vibração, como vôos parabólicos, serão mais afetados por eles. Para mais longas missões no espaço a bordo da hipergravidade ISS não deve ser um fator, mas um certo nível de vibrações provenientes das máquinas diferentes, bem como dos próprios (por exemplo, durante o treino) astronautas também estará sempre presente e precisa ser considerado . Usando células diferentes, o nosso grupo tem tentado recentemente para analisar o impacto da hipergravidade e vibração sobre o efeito global da expressão do gene alterado durante os voos parabólicos [47], e esses primeiros resultados parecem sugerir que, enquanto hipergravidade e vibração induzir efeitos opostos daqueles de microgravidade nas células, ausência de peso é o estímulo mais forte global. No entanto, mais experimentos devem ser conduzidos para refinar esses resultados e eles também têm de ser complementadas por estudos de longo prazo. Estes dados seria de grande importância para o nosso experimento futuro voo espacial (as células cancerosas da tireóide no espaço) na ISS em novembro deste ano.

Em conjunto, observou-se uma influência da vibração e hipergravidade na expressão gênica de tireóide células cancerosas. Notavelmente, os dois tipos de células reagiram de forma diferente. ML-1 células apareceram mais resistentes contra as vibrações do que as células CGTH-W1. Portanto, experimentos de controle sobre centrífugas adequadas e vibração são necessárias para interpretar os dados obtidos a partir dos experimentos de microgravidade.

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a Sra Heidi Schou Knudsen pelo seu excelente assistência técnica.

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