Sumário

Vitamina E δ-tocotrienol tem sido demonstrado ter actividade anti-tumoral, mas o mecanismo molecular preciso pelo qual ela inibe a proliferação de células de cancro permanece obscura. Aqui, demonstramos que δ-tocotrienol exercida células de inibição do crescimento de células do cancro do pâncreas significativa ductal (PDCA) sem afectar o crescimento celular normal humano pancreático ductal epitelial. Nós também mostraram que a inibição do crescimento induzida por δ-tocotrienol ocorreu concomitantemente com G

1 paragem do ciclo celular e aumento da p27

acumulação nuclear KIP1. Esta descoberta é importante considerar que a perda de p27 nuclear

expressão KIP1 é um fator prognóstico adverso bem estabelecida no PDCA. Além disso, δ-tocotrienol inativada RAF-MEK-ERK sinalização, um caminho conhecido para suprimir p27

expressão KIP1. Para determinar se p27

indução KIP1 é necessário para a inibição δ-tocotrienol da proliferação celular PDCA, nós silenciada de forma estável o

CDKN1B

gene, que codifica p27

KIP1, em células MiaPaCa-2 PDCA e demonstrou que p27

KIP1 silenciamento paragem do ciclo celular suprimida induzida por δ-tocotrienol. Além disso, δ-tocotrienol induzida p27

KIP1 expressão de mRNA, mas não a sua degradação de proteínas. p27

a actividade do promotor do gene foi induzida por KIP1 δ-tocotrienol através do local de ligação a E2F-1 do promotor, e esta actividade foi atenuada por E2F-1 esgotamento usando E2F-1 pequeno ARN interferente. Finalmente, diminuição da proliferação, mediada por Ki67 e p27

expressão KIP1 por δ-tocotrienol, foi confirmado

in vivo

em um modelo de cancro pancreático nu rato xenotransplante. Nossas descobertas revelam um novo mecanismo, dependente de p27

indução KIP1, pelo qual ô-tocotrienol pode inibir a proliferação em células PDCA, proporcionando uma nova lógica para p27

KIP1 como um biomarcador de eficácia δ-tocotrienol na prevenção do câncer de pâncreas e terapia

Citation:. Hodul PJ, Dong Y, Husain K, Pimiento JM, Chen J, Zhang A, et al. (2013) Vitamina E δ-tocotrienol Induz p27

Detenção Cell-Cycle KIP1 Dependente em células do cancro do pâncreas através de um mecanismo de E2F-1-dependente. PLoS ONE 8 (2): e52526. doi: 10.1371 /journal.pone.0052526

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de julho de 2012; Aceito: 15 de novembro de 2012; Publicação: 05 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hodul et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) K12 concessão Acadêmico clínica em concessão Oncologia (a PJ Hodul) e por doações Moffitt Fundação (Kurtz Penhor 09-33412-06-01, Cancer Research GI 09-33412-07- 01, e Fundação Família Steinmann 09-33412-08-05). Este trabalho também foi apoiado pelo NIH concede 1R01 CA-129227-01A1, 5RO1 CA-098473-05, DAVOS 69-15099-99-01 (a MP Malafa), e Bankhead-Coley 08BR-02. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este estudo envolve a propriedade intelectual no qual M. Malafa e S. Sebti são nomeados como inventores. Drs. Malafa e Sebti e Moffitt Cancer Center têm direito a receber receitas de licenciamento da exploração de tal propriedade intelectual. Um pedido de patente dos Estados Unidos foi arquivado em 26 de junho de 2007, tendo o título de “Delta-tocotrienol Tratamento e Prevenção do cancro do pâncreas” (OTML súmula número 06A069). A propriedade intelectual incluídos no pedido de patente foi licenciada para BioGene Life Science, uma empresa com sede em Cingapura. Este contrato de licença concede direitos BioGene vida ciência para a descoberta do Dr. Malafa. BioGene Ciências da Vida é uma subsidiária integral da Davos Life Science. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pâncreas é um dos cânceres mais letais nos Estados Unidos, ocupando o quarto lugar entre as principais causas de mortes relacionadas ao câncer [1]. Apesar da evolução do tratamento, a taxa de mortalidade para pacientes com câncer pancreático geral manteve-se inalterada durante décadas. As investigações sobre novas terapias e agentes quimiopreventivos são claramente justificada.

Estudos têm sugerido que o aumento da ingestão de frutas na dieta, vegetais e grãos de cereais pode diminuir risco de câncer pancreático [2], [3], [4]. Tocotrienóis, encontrados em grãos de cereais, constituem um dos grupos mais fortes de compostos anti-tumorais bioativos [5]. Os tocotrienóis são um grupo de quatro (α-, β-, δ-, γ-) insaturado, compostos de ocorrência natural de vitamina E que não só inibem a proliferação de uma variedade de células tumorais humanas, incluindo cancro da mama, cólon, pulmão, e hepatocelular [ ,,,0],6], [7], [8], mas também exibem propriedades quimiopreventivas [9], [10]. No entanto, como os tocotrienóis atenuar a proliferação do tumor é pouco compreendida.

anteriormente demonstrado que δ-tocotrienol apresenta a actividade anti-tumoral mais potente entre as quatro isoformas de tocotrienol em células de cancro pancreático [11], [12]. Numa fase em curso I dose de escalada ensaio clínico em doentes com cancro pancreático, resultados preliminares revelaram que δ-tocotrienol teve nenhuma toxicidade óbvio até 3200 mg /dia, que é 5 vezes a dose clínica biologicamente ativa previsto [13]. Estes dados reforçam a promessa de δ-tocotrienol de intervenção câncer pancreático. Para traduzir esses achados na clínica, é importante para identificar biomarcadores de actividade relevantes δ-tocotrienol para de fase precoce hipóteses-driven ensaios clínicos.

Para isso, investigamos como δ-tocotrienol inibe câncer de pâncreas o crescimento celular e identificou o p27 inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK)

KIP1 como um alvo molecular de δ-tocotrienol. funções de p27

KIP1 como um supressor de tumor, pela sua capacidade para bloquear a proliferação celular. p27

KIP1 é um supressor de tumor atípico, pois as mutações de seu gene são extremamente raros. No entanto, as células tumorais têm evoluído outros mecanismos para inactivar p27

KIP1, incluindo o aumento da degradação proteolítica ea exclusão do núcleo. Na verdade, p27

perda de KIP1 tem sido associada com a progressão do câncer de pâncreas e de mau prognóstico [14], [15], [16], [17]. Aqui, nós relatamos pela primeira vez que a p27

KIP1 desempenha um papel central na induzida por δ-tocotrienol G

1 prisão. Observamos também que a indução de p27

KIP1 por δ-tocotrienol ocorre no nível de transcrição envolvendo a ativação do promotor E2F-1-mediada e indução mRNA.

Materiais e Métodos

Chemicals

purificada δ-tocotrienol foi inicialmente fornecido pelo Dr. Barry Tan (Hadley, MA) (90% δ-tocotrienol e 10% γ-tocotrienol; IC

50: 15-20 μΜ) e, posteriormente, pela vida Davos Sciences (Singapura) (97% δ-tocotrienol; IC

50: 50 μΜ) dissolvido em etanol como uma solução mãe e diluída até à concentração desejada com DMEM

Linhas Celulares e Cultura

MiaPaCa-2, SW1990, e BxPC-3 de cancro pancreático células foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas a ~ 70% de confluência em DMEM suplementado com FBS a 10%. HPDE6 C7, uma linha ducto pancreático humano de células epiteliais imortalizadas por transdução com os genes de E6 /E7 de HPV-16 (generosamente fornecida pelo Dr. Ming-som Tsao, Universidade de Toronto, Ontário, Canadá [18]), foi cultivada em sérica meio de queratinócitos livre como descrito anteriormente [18]. Fibroblastos de rato embrionários (MEFs) tendo uma expressão estável de p27

KIP1 (+ /+) e p27

KIP1 (- /-) foram fornecidos pelo Dr. Pledger (Moffitt Cancer Center) [19], [20] e cultivadas em DMEM com 10% de FBS.

a transfecção e Geração de clones estáveis ​​

MiaPaCa-2 /p27 shRNA

KIP1 e MiaPaCa-2 /vector foram gerados por transfecção de células de MiaPaCa-2 com p27

KIP1 shRNA já clonado no vector pSuperiorRetroPuro (OligoEngine, Seattle, WA), uma simpática oferta do Dr. J. Chen (Moffitt Cancer Center) [21]. Foram seleccionados os clones resistentes à puromicina-estável. As transfecções foram realizadas com Metafectene (Biontex Laboratories, Planegg, Alemanha), por protocolo do fabricante.

siRNA Knockdown de p27

KIP1 em MiaPaCa-2 Células

Pré-concebido, siRNA para inibidor de CDK 1B (P27

KIP1, # 118714) e siRNA inespecífica (# 4611) foram adquiridos da Ambion (Austin, TX). MiaPaCa-2 foram plaqueadas células durante a noite em placas de 12 poços, sem nenhum antibiótico. transfecção transiente de ARNip foi levada a cabo usando o reagente Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguindo as instruções do fabricante. Em breve, P27 5 nM

KIP1 ou ARNsi de controlo foi misturada com meio Opti-MEM (Invitrogen) para um volume total de 90 mL e, em seguida, complexado com 2 mL de Oligofectamine e 8 uL de Opti-MEM (volume total de complexo foi de 100 uL). Antes da transfecção, o meio antigo foi rejeitado, as células foram lavadas com Opti-MEM fresco, e 400 uL de Opti-MEM fresco foram colocados em cada poço antes de se adicionar o complexo ARN-Oligofectamine. Após 8 horas, a 500 ul de DMEM contendo 30% de FBS e antibióticos não foram adicionados a cada poço, e as células foram incubadas durante mais 40 horas. Após a transfecção de 40 horas, as células foram tratadas com δ-tocotrienol durante mais 24 horas e colhidas para análise de azul de tripano e Western blot. As células em cultura

Extracção de proteínas e análise por Western blot

foram lisadas em mamíferos reagente de extracção de proteínas (Pierce, Rockford, IL), segundo o protocolo do fabricante. Anticorpo para o P27

KIP1 foi adquirido a partir de BD Bioscience (San José, CA). As membranas foram bloqueadas em leite 5%, quer em PBS (pH 7,4) contendo 0,1% de Tween 20 ou de 1% de albumina de soro bovino (BSA) em TBS (pH 7,5) contendo 0,1% de Tween 20. Os anticorpos específicos-fosfo foram incubadas em BSA a 2% em TBS (pH 7,5) contendo 0,1% de Tween 20; todos os outros anticorpos foram diluídas em leite a 5% em PBS (pH 7,4) contendo 0,1% de Tween 20 durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) foram diluídos em leite a 5% em PBS (pH 7,4) contendo 0,1% de Tween 20 ou TBS (pH 7,5) contendo 0,1% de Tween 20, a uma diluição 1:1000 durante 1 hora à temperatura ambiente. As transferências de Western foram visualizadas usando quimioluminescência aumentada (Pierce). Utilizou-se anticorpo monoclonal de beta-actina (catálogo # 8H10D10) a partir de Cell Signaling para garantir carga de proteína igual e expressão.

Anchorage independente de ensaios de crescimento

Para ensaios de crescimento em agar mole, as células foram semeadas em 1 × 10

3 células /cavidade em triplicado em pratos de 12 poços de cultura em 0,35% de agar sobre uma camada de agar a 0,6%. Várias concentrações de δ-tocotrienol ou veículo foram incluídas na camada de agar a 0,3% de células. As culturas foram alimentadas e tratadas com o composto ou veículo por semana até que colónias cresceram até um tamanho adequado para a observação (~3-4 semanas). As colónias foram fotografadas após incubação com 1 mg /ml de MTT durante a noite e contadas. O crescimento de colónias tratadas-δ-tocotrienol foi comparado com colónias tratados com veículo (controle). Três experiências separadas foram realizadas.

FACS e Ensaio de Proliferação celular

em crescimento exponencial de células pancreáticas foram cultivadas até 70% de confluência em placas de 96 cavidades e incubadas com concentrações crescentes de δ-tocotrienol ou veículo durante 24-72 horas. Os poços foram examinados para o crescimento celular e a proliferação usando o ensaio colorimétrico MTT. IC

50 resultados para cada linha celular foram determinadas para cada ponto de tempo de 24 horas. Para a análise do ciclo celular, as células pancreáticas foram cultivadas até 70% de confluência em placas de 100 mm e, em seguida, privadas de soro durante 48 horas para permitir a sincronização. Após 48 horas, o meio foi aspirado e meio fresco com δ-tocotrienol (IC

50) ou veículo foi adicionado durante 24 horas. meio tratado foi então recolhida, as monocamadas foram lavadas com PBS frio, as células foram tripsinizadas, e os sedimentos celulares foram recolhidos. Os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com PBS, fixadas em metanol frio, e lavada de novo com PBS para remover o metanol. Após re-suspensão em 300-500 ul de PBS, as células foram digeridos com 20 ug /ml de RNase e ADN celular foi corado com iodeto de propídio (50 ug /mL) por 3 horas de incubação à temperatura ambiente no escuro. distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo utilizando uma célula activado por fluorescência sistema (SCAF) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As células

A análise por microscopia confocal

tratados MiaPaCa-2 (50000) por 250 mL de 20% de FBS-PBS foram adicionados a cada ranhura cytofunnel e centrifugadas a 570 rpm durante 5 minutos a alta aceleração. As lâminas foram removidas e secas ao ar à temperatura ambiente. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 minutos, lavada três vezes com 1X PBS, com agitação, durante 5 minutos /lavagem e, em seguida permeabilizadas em 0,5% de Triton X-100 durante 5 minutos à temperatura ambiente. As células foram bloqueadas com 2% de BSA-PBS (100 uL) durante 30 minutos, e

KIP1 anticorpo p27 (1 :500) diluição preparado em 2% de BSA foi aplicado directamente. As lâminas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente numa câmara húmida e fechada. As células foram então lavadas três vezes com 1X PBS, com agitação, durante 5 minutos /lavagem. Preparou-se anticorpo secundário (Alexa Fluor 594) em PBS (1:500) e adicionado a células fixadas. As lâminas foram de novo incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente em atmosfera húmida e fechada e, em seguida, lavada três vezes com 1X PBS durante 5 minutos /lavagem. Vectashield (50 uL) com DAPI foi adicionado, e lamelas foram aplicadas. Após incubação a 4 ° C em condições de pouca luz, as lâminas foram examinadas em um microscópio confocal.

citosólico e proteína nuclear Extração

As proteínas foram extraídas utilizando Kit citoplasmática Reagente de Extracção NE-PER e Nucleares (Pierce ). Trataram células MiaPaCa-2 foram isoladas de 20 ul volume embalado de células (40 mg) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por 5 minutos de centrifugação a 500 x g. O sobrenadante foi descartado, as pelotas de células foram secas e CER-1 contendo inibidores de protease arrefecido em gelo (200 mL) foi adicionado. Tubos foram agitados vigorosamente durante 15 segundos e incubadas em gelo durante 10 minutos. Em seguida, CERII gelada (11 mL) foi adicionado a tubos, que foram agitadas durante 5 segundos e incubada em gelo durante 1 minuto, agitadas outra vez durante 5 segundos, e depois centrifugou-se a 14000 × g durante 5 minutos. O sobrenadante (extracto citosólico) foi transferido para tubos frescos pré-refrigerada e armazenado a -80 ° C. Nós ressuspenso do sedimento insolúvel contendo núcleos em 100 ul de NER gelado contendo inibidores de proteases. Os tubos foram agitados durante 15 segundos e mantido em gelo durante 10 minutos. Este passo foi repetido quatro vezes (40 minutos). Os tubos foram centrifugados a 14000 × g durante 10 minutos, e o sobrenadante (extracto nuclear) foi transferido para tubos pré-refrigerada e armazenado a -80 ° C.

Luciferase Reporter Assay

MiaPaCa-2 As células foram semeadas em placas de 6 poços a 2 x 10

5 células /poço. Cada poço foi transfectado no dia seguinte com 2 mg de p27

plasmídeo KIP1 repórter luciferase (p27 full-length

Kip1-1609, diferentes mutantes 5 ‘supressão de p27 do mouse

KIP1 promotor repórter luciferase, ou pGL- 3 ADNc de base vector vazio; todos os plasmídeos fornecidos pelo Dr. Pledger), juntamente com ARNsi de E2F-1, ou não-alvo ARNsi (Santa Cruz). Metafectene foi utilizado como o reagente de transfecção, conforme as instruções do fabricante. Os lisados ​​foram recolhidos 24 horas após o tratamento δ-tocotrienol (IC

50 50? M). A actividade de luciferase foi medida pelo kit de sistema de ensaio de luciferase (Promega). Para a normalização da eficácia de transfecção, 200 ng de Renilla reniformis plasmídeo de expressão de luciferase (pRL-TK vector, Promega) foi incluído na transfecção.

MiaPaCa-2 células de RT-PCR foram semeadas Análise

em placas de 6 poços e tratadas com δ-tocotrienol (IC

50 50? M) ou do veículo (como controlo) durante 24 horas. As células foram então colhidas em tampão de lise 1X, e o ARN foi isolado utilizando o kit /proteína Allprep ARN de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Valencia, CA). A transcrição reversa do RNA total foi realizada utilizando o kit SuperScript III (Invitrogen). Os seguintes iniciadores para a frente e reverso, respectivamente, foram usados ​​para a reacção de PCR: p27

KIP1, 5′-TAACCCGGGACTTGGAGAAG e 5′-GCTTCTTGGGCGTCTGCTC para amplificar um produto de 450 pb; para a actina, 5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCT e 5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC para amplificar um produto de 353 pb. Para evitar overamplification, p27

os níveis de expressão de mRNA KIP1 foram determinados por RT-PCR em diferentes ciclos de amplificação (20, 25, 30, e 40 ciclos de PCR) e analisados ​​por electroforese em gel de agarose. Os resultados representativos no ciclo de 40 são mostrados.

ciclohexamida Blocos da síntese da proteína

Depois de 12 horas de tratamento δ-tocotrienol (IC

50 50 mM), δ-tocotrienol foi removido por lavagem MiaPaCa -2 células três vezes com PBS; ciclo-hexamida (40 ug /mL) foi então usado para bloquear a síntese de proteínas. p27

KIP1 taxa de rotatividade foi analisada por Western Blot.

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo foi aprovado pela University of South Florida Institutional Animal Care e Use Committee (Aplicação 2805). Atividade

Anti-tumoral em Nude Xenoenxerto modelo do rato

Nós usamos fêmea atímicos nu (nu /nu) ratos, 5-6 semanas de idade (Charles River, Wilmington, MA), para os nossos estudos com animais. Os animais foram mantidos em gaiolas limpas limitado a 4 ratos por gaiola. Os ratos foram tratados com amplo comida e água e examinadas em uma base diária. Se tumores interferiu com a deambulação, causada sinais de perda de peso 10%, aflição respiratória, ou cresceu a . 2 cm de tamanho, os ratos foram humanamente sacrificados por exposição a concentrações crescentes de dióxido de carbono

células MiaPaCa-2 foram recolhidas e ressuspensas em PBS (1 × 10

6 células /50 ul) e um volume igual de Matrigel (BD Biosciences). Amostras de células (100 ul) foram então injectados por via subcutânea no flanco direito. Uma vez que os tumores atingiram entre 250 e 300 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de 10 e doseados por meio de sonda oral com 0,1 ml de veículo (azeite purificado) ou δ-tocotrienol (100 mg /kg) por dia, durante 3 semanas. Os volumes dos tumores foram determinados duas vezes por semana, por medida de distâncias (

l

) e largura (

w

) e calculando o volume: V = (

l

+

w

) /2 × (

l

×

w

) × 0,5236. A significância estatística entre o controlo e os animais tratados foi determinada utilizando

t

-teste.

A imuno-histoquímica de Student e Deslize quantificação

Os tumores a partir de experiências de xenotransplante foram fixados em paraformaldeído a 4%, pH 7,2 . Após a fixação, as amostras de tecido foram processadas em blocos de parafina. Os anticorpos primários utilizados neste estudo foram monoclonal de rato (p27, p-MAPK, e Ki-67) os anticorpos criados contra os antigénios correspondentes de origem humana em secções embebidas em parafina. coloração imuno-histoquímica foi realizada num Ventana BenchMark XT (Tucson, AZ) automatizado corrediça Stainer, utilizando 4 mícrons de espessura a partir de secções de parafina de cada um dos blocos de tumor representativos seleccionados. Os cortes foram desparafinados, re-hidratados, e incubou-se com 3% H

2O

2 para bloquear a peroxidase endógena. Depois de antigénio desmascarar usando solução CC1 proprietária durante 60 minutos em linha (padrão) a 100 ° C, as secções foram incubadas com os anticorpos para p27 (Kip 1, cloneSX53G8) (diluição proprietárias, celular Marque, Rocklin, CA) e o Ki-67 (Proprietary diluição, Ventana, Tucson, AZ). Os tempos de incubação foram de 32 minutos para p27 e Ki-67, de acordo com as instruções do fabricante. /Anticorpo monoclonal de coelho fosfo-p44 42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (catálogo n ° 4376, Cell Signaling, Danvers, MA.) Foi utilizado a uma concentração de 1: 200 em diluentes PSS (Ventana) e incubou-se durante 32 minutos. O anticorpo secundário anti-coelho Ventana foi usado durante 20 minutos. As secções foram então sujeitas ao bloco de biotina, utilizando um kit de biotina endógena Ventana (Ventana). As secções foram incubadas com o anticorpo secundário marcado com biotina e estreptavidina-peroxidase durante 30 minutos cada (Dako Diagnostics). Uma solução de 3,3′-diaminobenzidene tetrahidrocloreto (Sigma, St. Louis, MO) foi utilizada como um cromogénio seguido de azida de sódio e 20 mL de H

20

2 em 100 ml de Tris-HCl (50