PLOS ONE: o mecanismo de ação do Myc Inhibitor denominado Omomyc poderão dar pistas sobre como alvo Myc para o cancro Therapy

Abstract

Recentes evidências apontam para Myc – um fator de transcrição bHLHZip multifacetada desregulamentado na maioria dos humanos cancros – como um alvo prioritário para a terapia. Como segmentar Myc é menos claro, dado o seu envolvimento numa variedade de funções chave das células saudáveis. Aqui nós relatamos sobre o mecanismo da molécula interferir Myc ação denominado Omomyc, que demonstrou eficácia terapêutica surpreendente em modelos transgênicos câncer do mouse

in vivo

. Omomyc acção é diferente da que pode ser obtida por nocaute do gene ou ARN de interferência, de abordagens destinadas a bloquear todas as funções de um produto de gene. Esta molécula – em vez disso – parece causar uma perturbação específica de ponta que destrói algumas interacções de proteínas do nó de Myc e outros mantém intacta, com o resultado de a remodelar o transcriptoma Myc. Omomyc seletivamente metas interações proteína Myc: liga-se c- e não N-Myc, Max e Miz-1, mas não se ligam Mad ou selecione proteínas HLH. Especificamente, ele impede que Myc ligação ao promotor E-caixas e transativação de genes alvo, mantendo Miz-1 dependente de ligação aos promotores e transrepress�. Isto é acompanhado por grandes alterações epigenética como diminuição acetilação e metilação aumentada em H3 lisina 9. Na presença de Omomyc, a interactoma Myc é canalizada para a repressão e a sua actividade é exibida para alternar a partir de uma pró-oncogénica a um supressor de tumor um. Dado o impacto terapêutico extraordinária de Omomyc em modelos animais, estes dados sugerem que com sucesso segmentação Myc para a terapia de cancro pode necessitar de uma dupla semelhante acção, a fim de impedir a ligação de Myc /Max para E-caixas e, ao mesmo tempo, manter reprimir genes que seria reprimida por Myc

Citation:. Savino M, Annibali D, Carucci N, Favuzzi E, Cole MD, Evan GI, et al. (2011) O mecanismo de ação do Myc Inhibitor denominado Omomyc poderão dar pistas sobre como alvo Myc para terapia do câncer. PLoS ONE 6 (7): e22284. doi: 10.1371 /journal.pone.0022284

editor: Laszlo Tora, do Instituto de Genética e Biologia Molecular e Celular, França |

Recebido: 02 de novembro de 2010; Aceito: 23 de junho de 2011; Publicação: 21 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Savino et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação de AIRC, ASI, MIUR e Fondazione Guido Berlucchi (SN), a Bear Necessities subsídio da Fundação Pediátrica Câncer (LS), um CNR curto prazo comunhão mobilidade (SN) e pelo CNR – As bolsas de doutoramento da Universidade Sapienza (MS, DA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

myc reguladores transcricionais – C-, n- e L-myc – são básicos, hélice-laço-hélice, de fecho de leucina (bHLHZip) as proteínas que se ligam a uma variedade de locais genómicos quer a induzir ou reprimir a transcrição de genes importantes para o crescimento celular, metabolismo e diferenciação [1] – [4]. Estes factores – especialmente c-Myc e N-myc – estão desreguladas na maioria dos cancros humanos. Isso geralmente não é devido a

Myc

mutação genética, mas resulta de mutações que afetam a montante outros oncogenes ou supressores tumorais. actividade Myc, portanto, parece ser necessária para o desenvolvimento e manutenção da maioria dos tumores, mesmo quando iniciada por outras causas. Em tumores induzidos por Myc regulação positiva em ratinhos transgénicos, mesmo breve Myc de-activação desencadeia a regressão do tumor acompanhada por paragem do crescimento, diferenciação, e o colapso do sistema vascular do tumor [5]. Myc opera dentro de uma rede interactome altamente interligado e uma possível estratégia para a segmentação função oncogénica Myc é a interferência dominante das interações proteína Myc. A este respeito, Myc domínio de oligomerização – região de bHLHZip – provou ser capaz de inibir dominantemente Myc transformar capacidade em células de fibroblasto de embrião de rato [6], [7]. Este domínio medeia a interação direta com Max e específica sequência de ligação a sequências de consenso específicas – as caixas de e – em promotores de genes alvo ativados. O domínio bHLHZip também está envolvido na interacção com outros parceiros – como Miz-1 – que medeiam a repressão transcricional por Myc [4], [8]. Para interferir com as interacções proteína-proteína Myc, nós desenvolvemos uma molécula negativo dominante através da introdução de quatro mutações seleccionadas na região do bHLHZip humano de c-Myc. O ácido 90 amino miniprotein resultante – denominado Omomyc para a sua capacidade para formar homodímeros – é capaz de inibir a c-Myc associação /Max, para afectar de activação da transcrição por c-Myc, e para melhorar a c-Myc apoptose dependente em células de cultura de tecido [9 ], [10]. Foi mostrado para impedir c-Myc papilomatose induzida

in vivo

sem afetar a homeostase do tecido [11] sugerindo uma capacidade de alvejar as células tumorais sem danificar o tecido normal.

Apesar do seu papel generalizada em humanos câncer, Myc recebido com ceticismo considerável como um alvo terapêutico desde a sua exigência para a proliferação e manutenção de compartimentos de células-tronco adultas preocupação com a toxicidade da inibição Myc para tecidos saudáveis ​​[12] levantadas, [13]. Em parte graças ao trabalho em Omomyc o potencial de Myc como um alvo terapêutico já está estabelecida. Muitas dúvidas sobre a selectividade para tumores foram dissipadas por estudos que mostram que transitoriamente inibir Myc na pele, epitélio intestinal e outros tecidos não altera drasticamente homeostase do tecido [11], [14], [15]. A eficácia e segurança de Myc segmentação

à la Omomyc

foi conclusivamente demonstrado pela expressão reversível da Omomyc em modelos transgênicos [16], [17]. expressão sistémica de Omomyc atenuou a proliferação em tecidos que se dividem rapidamente, mas este foi bem tolerado; homeostase do tecido foi mantido, não apoptose foi observada em tecidos normais e de todos os efeitos secundários foram prontamente revertido após a remoção Omomyc. Em tumores de pulmão Ras-driven, o impacto da Omomyc foi impressionante. Os ratinhos que expressam continuamente Omomyc não conseguiu desenvolver o adenocarcinoma do pulmão. Em ratos que tinham desenvolvido cancro avançado anteriormente, a indução de Omomyc desencadeada a regressão do tumor que foi acompanhada por uma proliferação reduzida e aumento da apoptose do tecido tumoral [16]. Um impacto anticancerígeno análogo foi encontrado em um vírus símio 40 (SV40) modelo de tumor de ilhéus pancreáticos -driven [17], no cancro da mama (G. Evan, comunicação pessoal) e glioma (em preparação). Assim, manipulando a função de Myc de forma semelhante ao Omomyc pode ter o potencial de uma estratégia anti-cancro eficaz para vários tipos de tumores.

Em vista das propriedades marcantes desta molécula, que é extremamente relevante para elucidar o seu mecanismo de acção. Omomyc efeitos biológicos são simplesmente os resultados de

tout court

Myc função de ablação, como ocorreria com o gene Myc ou nocautes mRNA? Claramente, para explicar as propriedades notáveis ​​de Omomyc é importante para entender se elas resultam de direcionamento seletivo do interactome Myc e como eles impacto sobre as metas Myc ativados e reprimidos. Estas questões são abordadas no presente trabalho.

Nossos dados indicam que Omomyc não causa uma inibição global função de Myc mas age como uma perturbação específica de ponta do interactome Myc, canalizando a sua actividade para transrepress�. Esta pode ser a chave para o seu sucesso como um agente anticancerígeno.

Resultados

Omomyc seletivamente metas do Myc interactome

interação física direta com a proteína bHLHZip Max é crucial para a função de Myc : o complexo Myc /Max se liga a DNA – que reconhece e-boxes – e funciona como um activador da transcrição [18]. Omomyc é capaz de homodimerizar, para formar heterodímeros com proteínas c-myc e max, e para interferir com a formação do complexo de c-Myc /Max e ligação a E-boxes in vitro [9], [10]. Para melhor endereço Omomyc seletividade investigamos sua capacidade de se ligar N-Myc – que compartilha redundância funcional substancial com c-Myc e tem um papel importante na formação de tumores no sistema nervoso -, loucos – liga-se um fator bHLHZip estritamente relacionado que dimeriza com Max, e-caixas e atua repressor da transcrição como [4] -, Hb e Id1 – duas proteínas HLH representante de uma grande família de reguladores de transcrição implicados em processos de desenvolvimento [19]. Para avaliar a capacidade de se ligar N-Myc foi realizada imunoprecipita�es em células 293T ectopicamente expressar Omomyc fundido ao estrogênio ER receptor ™ – Omomer [10] – juntamente com FLAG marcado c- ou N-Myc. Descobrimos que Omomyc ligado a N-Myc de forma semelhante à de c-Myc (Figura 1A), de acordo com a identidade virtual das sequências de aminoácidos do domínio de proteínas da família bHLHZip Myc. Para avaliar a ligação de Max, Mad e as duas proteínas HLH Hb (uma proteína E) e Id1 nós realizados ensaios de pull-down com GST ligada Max, Mad, Hb e Id1 em extratos de células 293T ectopicamente expressar Omomyc marcado com FLAG. Considerando a ligação a Max era forte como relatado anteriormente [9], Omomyc ligação a Mad era pouco visível e ligação a Hb e Id1 era indetectável (Figura 1B). O sinal de fraca no pull-down GST-Mad é provável devido aos níveis muito elevados de expressão FLAG-Omomyc nas células transfectadas e não reflexivas de interação fisiológica entre as duas proteínas. Em resumo, descobrimos que a especificidade de ligação Omomyc para Max e proteínas Mad era o mesmo que Myc. Da mesma forma para Myc, Omomyc não parece interagir com as proteínas HLH e, portanto, não actua interrompendo redes proteína HLH cruciais para o controlo de diferenciação [20] – [22]. Em seguida, pediu meteorológicas Omomyc interagiu com hipoxia-inducible factor 1-alfa (HIF-1α), uma proteína que funciona como um regulador mestre de transcrição da resposta adaptativa à hipóxia, desempenha um papel essencial na angiogénese tumoral e mostra uma interacção considerável com Myc na regulação de vários genes glicolíticas [23] – [25]. HIF-1α contém um domínio bHLH e antagoniza Myc ligando-se a Max [24]. Para investigar Omomyc ligação a HIF-1α foi realizada imunoprecipi em células 293T que expressam ectopicamente FLAG com etiquetas Omomyc juntamente com HIF-1α. Encontrámos (Fig. 1C), que não se liga Omomyc HIF-1α, enquanto Max se como relatado. Em conjunto, esses experimentos indicam claramente que Omomyc é a rede Myc-Max-Mad específico e – dentro desta rede – afeta seletivamente Myc /Max dimerização, necessária para a ligação Myc para E-caixas e transativação de um grande número de genes

A) Omomyc liga de c-Myc e N-Myc. Immunoblotting (WB) com anticorpos bandeira e ER – como indicado – de imunoprecipita�es realizados com anticorpos bandeira em células 293T transfectadas com FLAG-c-Myc ou FLAG-N-Myc expressam vetores juntamente com a expressão vector Omomer. B) Omomyc liga Max, mas não louco e duas proteínas HLH representativas. Immunoblotting (WB) com anticorpos bandeira de GST ensaios suspensos realizados com GST, GST-MAX, GST-MAD, GST-ID1 e GST-HEB (10 ìg cada) em células 293T transfectadas com o vector expressando FLAG-Omomyc. células 293T transfectadas com ID2 ou FLAG-13I [65] vectores que expressam foram utilizados como controle positivo para GST-HEB e GST-ID1, respectivamente. Extratos de bactérias que expressam His-MAX foram usados ​​como controles positivos para GST-MAX e GST-MAD. O C) não se ligam Omomyc HIF-1α. Immunoblotting (WB) com HIF-1a, anticorpos Max e bandeira – como indicado – de imunoprecipita�es realizados com anticorpos bandeira em células 293T transfectadas com HIF-1α, Max e vectores que expressam FLAG-Omomyc. D) Omomyc liga Miz-1. Immunoblotting (WB) com anticorpos Miz-1 e ER – como indicado – de imunoprecipita�es realizados com anticorpos Miz-1 em células 293T cotransfectadas com Miz-1 e Omomer expressam vetores

Um aspecto chave do Myc. transrepressão é função de numerosos genes envolvidos no controlo do crescimento, a diferenciação e a supressão do tumor [4]. Esta atividade não parece implicar Myc a ligação directa para o e-caixas. Myc é recrutado para promotores de genes reprimidos apenas indiretamente, mediante a interação com proteínas que se ligam diretamente a tais promotores. O mais conhecido deles é Miz-1, uma proteína dedo de zinco envolvidos em Myc repressão dependente de inibidores do ciclo celular – p15-INK4b (dependente da ciclina quinase 4 inibidor B) e p21 (CDKN1: dependente da ciclina inibidor da quinase 1) – e em apoptose dependente de Myc em resposta a retirada do factor de crescimento [26] – [29]. Presumivelmente, em complexo com Max, contactos Myc região Miz-1 N-terminal por meio da D394 posições de aminoácidos S405 e [28] que estão localizadas na região de HLH. Como esses sites não estão mutado em Omomyc, a hipótese de que Omomyc reteve a capacidade de ligar-se Miz-1. Testamos essa possibilidade através de imunoprecipitação em células 293T ectopicamente expressar Omomer e Miz-1. A Figura 1D mostra que Omomyc interage directamente com Miz-1. Endógena Miz-1 foi relatada a acumular-se no citoplasma das células, com uma fracção menor no núcleo; Myc superexpressão desencadeia translocação nuclear de Miz-1 e sequestro em focos subnucleares discretas [30]. Para investigar a interação e localização intracelular de Omomyc, Omomyc /Miz-1 e /complexos de c-Myc Omomyc, nós transfectadas células 293T com FLAG marcado Omomyc ou c-Myc expressando plasmídeos juntamente com plasmídeos que expressam não marcado Miz-1 e c-Myc, e localização de proteínas detectadas por imunof luorescência com anti FLAG, c-myc, e os anticorpos Miz-1 (Figura 2). Em células transfectadas com plasmídeos de expressão únicos, Miz-1 foi principalmente (cerca de 90%) localizada no citoplasma como relatado anteriormente [30], Myc estava presente exclusivamente no núcleo como esperado, e Omomyc foi em grande parte no núcleo (cerca de 85% ) com uma parte menor no citoplasma (Figura 2). Omomyc falta o sinal de localização nuclear de proteínas Myc: pode entrar no núcleo devido ao seu tamanho pequeno, ou mediante a dimerização com Myc endógena ou Max. Quando co-transfectadas, proteínas Myc mais co-localizada com Omomyc no núcleo; uma fracção de Omomyc permaneceu no citoplasma – não associado ao Myc – provavelmente devido a um nível mais elevado de expressão. Myc expressão ectópica desencadeada translocação nuclear de Miz-1 (cerca de 40%) e a formação de focos subnuclear discreta, como relatado anteriormente [30]. Miz-1 foi parcialmente transferida no núcleo, na presença de uma sobre-expresso Omomyc bem (aproximadamente 35%). Endógena Miz-1 – que se encontra presente em quantidades baixas dentro das células [30] -. Irá presumivelmente ser principalmente no núcleo, na presença de uma sobre-expresso ou Myc Omomyc

fotomicrografias A) de imunofluorescência de células 293T transfectadas com Miz -1, c-Myc, FLAG-c-Myc e FLAG-Omomyc plasmídeos de expressão – como indicado acima painéis – e coradas com anticorpos contra a bandeira (verde), Miz-1 (vermelho) e c-Myc (vermelho) conforme indicado no interior painéis. Núcleos de os mesmos campos foram coradas em azul com DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). B) A quantificação dos experimentos mostrados em A), com base no exame de campo 15 microscopia e, pelo menos, três repetições biológicas.

Em conjunto, esses resultados mostram que a perturbação da interactome Myc por Omomyc não resulta apenas a partir da inibição da ligação de Myc a Max – que é necessário para a ligação de e-box e transactivação – mas também a partir da interacção de Omomyc com Miz-1, um parceiro de ligação de Myc envolvido na transrepressão

Omomyc afecta a. resposta transcricional de fibroblastos ao soro estimulação

proteínas Myc é capaz de se ligar a 10-20% de loci genómico e para modular a expressão de centenas de milhares de genes. Omomyc foi mostrado para danificar transativação do Myc activado gene alvo

cad

em fibroblastos Rat1 e não afetar a regulação negativa do Myc reprimida alvo

GADD45

[10]. Para obter uma visão em grandes alterações de expressão do gene influenciado por Omomyc, analisou-se a resposta de transcrição à estimulação sérica de fibroblastos Rat1 estavelmente infectadas com um Omomer produzir ou um retrovírus vazio (células Rat1-controlo Rat1-Omomer e, respectivamente, tal como descrito em [ ,,,0],10]). c-Myc é conhecida por ser regulada negativamente pela privação de soro e fortemente induzida por adição de soro – em conjunto com um número de outros genes precoces imediatos – atingindo um pico depois de 1 a 2 horas; indução de c-Myc desempenha um papel no ciclo celular reentrada [31] – [33]. Para além da proliferação de células, a resposta sérica de fibroblastos integra outros processos – e. g. ferida cura [34] – e os genes de soro regulada incluem genes que são regulados por Myc, bem como genes que não são. As células foram privadas de soro antes de estimulação com soro e expressão de mRNA foi analisada no momento de soro readição (tempo 0) e 90 ‘, posteriormente, – um ponto de tempo no qual a indução de Myc é máxima – de modo a que a indução de um alvo directo Myc devem aproximar seguir a expressão de Myc. expressão de mRNA foi analisada por meio de uma matriz de oligonucleótidos contendo sondas para sequências de cerca de 7.000 de comprimento completo e 1.000 (marcadores de sequências expressas) EST clusters. Os dados são acessíveis na base de dados GEO com o número de acesso seguinte: GSE25039. valores relativos de expressão de mRNA (Dobre Alterações) foram calculados tomando como referência as células Rat1 de controle no tempo 0; apenas os genes que mostram uma mudança de dobra, pelo menos +3 (genes regulados positivamente) ou -3 (genes regulados negativamente) foram tidos em conta. No momento da estimulação com soro, Omomer expressar e controlar células Rat1 apresentado um perfil praticamente idêntico a expressão do gene (Figura 3, parte superior). Aos 90 minutos de indução de soro de 111 seqüências foram regulada e 96 reprimidos em células Rat1 de controle. Surpreendentemente, a regulação baixa acentuada foi encontrada em células Rat1-Omomer: o maior número de sequências de genes 516 foram reprimidos e 143 regulada (Tabela S1). Em geral, o número total de sequências cuja expressão foi acima ou regulados negativamente na presença de Omomyc após 90 minutos de estimulação com soro elevou-se a 8,2% das sondas sobre a matriz. Entre as sequências regulados negativamente na presença de Omomyc, 475 representada genes com um GeneID conhecido (identificador do gene) e 41 outras regiões transcritas. Para saber se os genes reprimidos na presença de Omomyc também foram validados alvos Myc comparando-os com o conjunto de genes listados no banco de dados Gene Cancer Myc (www.myccancergene.org), uma coleção de genes responsivos Myc identificados em estudos independentes através uma variedade de técnicas de [35]. 115 (24%) dos 475 genes regulados negativamente na presença de Omomyc foram listadas na base de dados do gene alvo Myc: 45 foram listados como supra-regulada e 35 como regulada negativamente por Myc, enquanto que a regulação para cima ou para baixo dos restantes 35 genes era desconhecida. De salientar alvos diretos Myc dentro da lista de genes regulados negativamente na presença de Omomyc, a lista foi cruzada com os de dois estudos que utilizaram análise de chip para definir genoma ampla promotor ocupação por Myc em tronco embrionárias (ES) células [36], [37]. 31,5% dos genes regulados negativamente na presença de Omomyc tinha promotores que foram relatados como estando directamente ligados por Myc em células ES (Valor de P: 1,3 × 10

-24), em comparação com 19% na sua ausência (P- valor: 3 × 10

-2). Ao todo, 44,4% da Omomyc reprimidos genes acabou por ser alvos Myc genuínas de acordo com tanto o Myc banco de dados genes alvo ou a listagem de Myc promotores ligados em células ES (diagrama de Venn: Figura 4A). Os genes comuns a todos os três grupos estão agrupados em uma dimensão na Figura 4B. Tal grande – embora incompleta – sobreposição entre os genes cuja regulação negativa foi associada à activação Omomer em fibroblastos Rat1 e validado alvos Myc é altamente significativa. Que a sobreposição é incompleta é consistente com outras análises de expressão e de conjuntos computacionalmente derivados de genes [38], [39], e pode ser em parte devido a outros efeitos do soro. A Figura 3 (meio) mostra a classificação em categorias funcionais baseados em GO (Gene Ontology) termos. Como relatado para os genes associados com a actividade de c-Myc [36], [40], [41], os genes afectados pela Omomyc caem em várias categorias funcionais que envolvem o crescimento, metabolismo, vias de sinalização celular, progressão do ciclo celular e apoptose. Notavelmente, os genes regulados negativamente na presença de Omomyc foram enriquecidas em categorias – nucleótidos e o metabolismo do ácido nucleico – que estão representadas entre alvos regulados positivamente por c-Myc [36], [40] – [42], apoiando a noção de Omomyc como um inibidor Myc de transactivação mediada (figura 3, parte inferior). Alvos conhecidos para ser regulada positivamente por Myc e verificou-se ser regulada negativamente por Omomyc incluem genes que codificam proteínas directamente envolvidos na tradução e montagem de ribossoma – tais como o factor de iniciação da tradução Eif3s9, o factor de elongação Eef1a1, e a proteína ribossómica L3 e S4 – bem como genes que codificam enzimas metabólicas – isocitrato desidrogenase 2, lactato desidrogenase B e fosfoglicerato quinase 1 -, proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular – a subunidade complexo de promoção da anafase Anapc5, ciclina B1 e de ciclina D1 -, ​​o TIP49 ATPase /ADN da helicase (Ruvbl1) , e a HMGB1 proteína estrutural da cromatina. HMGB1 tem um importante papel na remodelação da cromatina e é um mediador da inflamação cuja sobre-expressão está associada a muitos tipos de tumores [43]. TIP49 é um cofactor importante Myc, envolvido em Myc transcrição e funções oncogénicas [44]. Vários genes que se encontram a ser regulada negativamente por Omomyc e conhecido por ser Myc reprimido alvos codificam para proteínas envolvidas em vias de sinalização, de adesão de células e de transcrição – como Akt1, erbB2, c-Jun e o receptor do factor de crescimento de fibroblastos FGFR1 – enquanto

Mxi1

codifica uma proteína que interage com Max e regula negativamente a função de Myc.

Mxi1

é reprimida pelo Myc [45], mas ativado por HIF-1α [46], [47]. Os defeitos neste gene têm sido relatados no cancro da próstata e num subconjunto de glioblastomas [48], [49].

Omomyc promove a regulação negativa de numerosos genes. Topo. Muitos mais genes foram regulados negativamente em células que expressam Rat1 Omomer (Omomer) do que nas células que não (controlo) a 90 ‘após a estimulação do soro de fibroblastos Rat1 na presença de tamoxifeno. O número de genes regulados positivamente foi semelhante. as células de controlo Rat1 no tempo 0 foram tomadas como referência. Meio. Distribuição em diferentes classes Processo Biológico – baseado na classificação Gene Ontology – de genes regulados negativamente a 90 ‘após a estimulação do soro em células Omomer e controle. Inferior. Os genes relacionados com o metabolismo de nucleótidos e ácido nucleico são as mais significativamente sobre-representado – como calculado pelo software Panther -. Entre os genes regulados negativamente na presença de Omomyc (Omomer células na presença de tamoxifeno)

a) diagrama de Venn que ilustra a sobreposição entre os genes regulados negativamente por Omomyc no presente estudo, os genes enumerados como alvos Myc no banco de dados de genes alvo Myc (www.myccancergene.org), e genes relatados para ser directamente ligado por c-Myc em ES células [29], [38]. Dentro da base de dados do gene alvo myc e os conjuntos de dados de células ES, apenas os genes que tinham uma sonda na matriz Affymetrix U34A foram tidos em conta. B), bona fide Myc genes alvo de sobreposição foram extraídas de nosso conjunto de dados e agrupados em uma dimensão. C) nível de expressão relativa (Dobre Alterar) – medida por PCR em Tempo Real a 90 min após a estimulação do soro na presença ou ausência de 4-OHT – de

CCND1

,

Eif3s9

,

PGK1

,

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

mRNAs no tipo selvagem (à esquerda) e Myc nula (à direita) células que expressam Rat1 tamoxifeno Omomyc indutível (Omomer).

CCND1

,

Eif3s9

,

PGK1

representam Myc activado metas;

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

representam Myc reprimida alvos. Expressão no momento da adição de soro (tempo 0) foi tomado como referência para o cálculo da Mudança Fold.

Para validar ainda mais nossos resultados, realizamos ensaios de Real Time PCR no tipo selvagem e fibroblastos Myc nula Rat1 expressando tamoxifeno induzível Omomyc (Figura 4C). Nós comparamos – a 0 e 90 minutos de estimulação com soro – os níveis de uma amostra seleccionada de genes afectados pela estimulação do soro que são conhecidos de expressão para ser ou reprimida –

Gadd45a

,

Mxi1

,

ErbB2

,

Akt1 Restaurant – ou ativado –

PGK1

,

Eif3s9

,

CCND1 Restaurant – por Myc [40], [45 ], [50]. Estes genes, como qualquer gene, não são os alvos exclusivos Myc, e outros factores de transcrição modulada ou não pelo soro pode contribuir para a sua regulação. Descobrimos que os níveis dos objectivos reprimidas Expression

Gadd45a

,

Mxi1

,

ErbB2

e

Akt1

em células Rat1 tipo selvagem não foram afetados ou até mesmo mais reprimida na presença de Omomyc enquanto regulação positiva das metas ativados

PGK1

,

Eif3s9

e

CCND1

foi comprometida (Figura 4C, à esquerda). Nas células nulas Myc, descobrimos que Omomyc não afectou significativamente a expressão do recalcado e não prejudicar a regulação positiva dos alvos activadas (Figura 4C, à direita). Portanto, o efeito da Omomyc na transcrição de Myc activado alvos parece exigir alguma actividade de Myc.

Em suma, estes resultados indicam que Omomyc não globalmente inibir a função de Myc na regulação da transcrição de genes-alvo e sugerem que ele seletivamente perturba o transcriptoma Myc, dificultando Myc transativação mediada e preservar Myc repressão mediada.

Omomyc afeta diferencialmente transativação e da repressão, influenciando Myc ligação ao alvo promotores de genes

para investigar os mecanismos envolvidos na regulação gênica por Omomyc, foram realizados ensaios de repórter e imunoprecipitação da cromatina (ChIP) luciferase em dois genes que codifica a nucleolin proteína nucleolar e da p21 inibidor da quinase dependente da ciclina, representando respectivamente alvos reais e diretas de activação Myc mediada ea repressão [51], [52]. c-Myc é capaz de ativar

nucleolin

transcrição através de dois E-caixas altamente conservadas no intron 1 [51]. Para testar a capacidade de Omomyc para inibir a activação transcricional mediada por Myc, realizamos ensaios de repórter em células 293T transfectadas com o plasmídeo pNucL14 [51] repórter de luciferase – contendo o rato

nucleolina

promotor, exão 1, intrão 1 e a primeira 8 nt do exão 2 – juntamente com diferentes combinações de plasmídeos de expressão Omomyc (Figura 5A) FLAG-c-myc e. Descobrimos que Omomyc inibiu a activação mediada Myc do repórter de luciferase de um modo dependente da dose, ao mesmo tempo que não afecta a sua actividade basal. Para testar se a inibição da

nucleolin

transativação por Omomyc foi devido a uma redução da ligação promotor, medimos a quantidade de Myc ligado ao

nucleolin

promotor em células 293T transfectadas com

nucleolin

repórter, FLAG-c-myc e Omomyc expressando plasmídeos. Recuperação de

nucleolin

DNA co-precipitados com Myc foi quantificado por PCR em tempo real, utilizando iniciadores localizados em torno dos dois E-caixas em

nucleolin

intron 1. Descobrimos que Omomyc causou uma redução de 40% de a quantidade de promotor ligado Myc (Figura 5B, à esquerda). Além de competir para a associação Myc /Max, Omomyc é capaz de formar homodímeros, bem como dímeros Omomyc /Max: apenas o último de ligação E-caixas

in vitro

com alta eficiência [9]. Portanto, Omomyc pode afetar Myc ligação ao DNA através de dois mecanismos concordantes: inibição da Myc /Max dimerização, bem como concorrência directa E-box para a ligação. Para avaliar o último, nós medimos a quantidade de Omomyc ligado ao

promotor nucleolin

em células transfectadas com c-Myc e FLAG-Omomyc expressando plasmídeos (Figura 5B, à direita). Descobrimos que foi especificamente Omomyc recrutados a E-box contendo a região de intrão 1 e que competiu com c-Myc para a ligação a esta região. No seu conjunto, estes dados indicam que Omomyc pode afectar a transactivação por sequestro de Myc em complexos incapaz de se ligar a e-caixas, bem como actuando – presumivelmente em associação com Max -. Como inibidor competitivo de complexos Myc /Max para a ligação de E-Box

atividade a) da luciferase do mouse

nucleolin

plasmídeo repórter promotor – pNucL14 – transfectado em células 293T em conjunto com FLAG-c-Myc e Omomyc vectores que expressam. Os dados foram normalizados por co-transfecção de pRL-TK luciferase de Renilla. A actividade basal do repórter foi ajustado para um valor de 100. B) Ensaio Quantitativo ChIP de Myc e Omomyc ligação ao

nucleolina e região promotora (NCL; barras cinzentas). Esquerda: ligação FLAG-c-Myc em células 293T transfectadas com o

nucleolin

repórter pNucL14 juntamente com FLAG-c-Myc e Omomyc plasmídeos que expressam. Direita: a ligação FLAG-Omomyc em células 293T transfectadas com o

nucleolin

repórter juntamente com FLAG-Omomyc e c-Myc plasmídeos que expressam. Uma região da luciferase

sequência de codificação (Luc; barras pretas) foi utilizado como controlo. As barras representam a percentagem de ADN de entrada imunoprecipitadas, após a subtracção do fundo. Valores de chip são expressos como% de DNA de entrada

Para investigar como Omomyc pode agir para apoiar Myc repressão mediada, realizamos ensaios sobre o humano

p21

promotor -. especificamente a sequência composta entre -194 e +16 a partir do local de início da transcrição – em que Myc é recrutado pela proteína de zinco dedo Miz-1 [27], [52]. Foram realizadas ensaios de repórter e descobriram que a expressão da luciferase conduzido pelo humana de comprimento completo

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promotor – p21Cip1-Luc [53] – foi inibida por c-Myc e que Omomyc foi sinérgica com c-Myc (Figura 6A ). Curiosamente – mesmo na ausência de um co-transfectadas c-Myc – Omomyc provocou

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promotor repressão a níveis semelhantes aos causados ​​por c-Myc. Portanto Omomyc é capaz de suportar

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promotor repressão ambos na presença e ausência de uma sobre-expresso de c-Myc. Para investigar se isso foi associado a um aumento da ligação do promotor, foram realizados ensaios de chip em células 293T transfectadas com o repórter p21 juntamente com FLAG-Myc e aumentando a quantidade de plasmídeo Omomyc. Observou-se que Omomyc marcadamente aumentada de c-Myc se ligar a -194 a +16 da região (Figura 6B, em cima). Curiosamente, o ensaio recíproco em células transfectadas com FLAG-Omomyc e aumentando a quantidade de plasmídeo c-Myc indicou que Omomyc foi capaz de interagir com o mesmo

região p21

promotor (Figura 6B, parte inferior). Neste caso, Myc superexpressão não competir com a ligação Omomyc.

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