Abstract

Fundo

Head and câncer de pescoço (CCP) classifica a quarta principal malignidade e câncer de morte em população masculina, em Taiwan. Apesar dos recentes avanços terapêuticos, o prognóstico para pacientes HNC ainda é sombrio. Novas estratégias são urgentemente necessárias para melhorar a quimiossensibilização aos medicamentos quimioterápicos convencionais e respostas clínicas dos pacientes HNC. Estudos têm demonstrado que a terapia fotodinâmica tópica mediada por ácido 5-aminolevulínico (ALA-PDT) está a ser utilizado no tratamento de uma variedade de lesões pré-malignas e malignas humano com alguns resultados clínicos encorajadores. No entanto, os mecanismos moleculares da ALA-PDT no efeito terapêutico em HNC a tumorigénese e se ALA-PDT como chemosensitizer para o tratamento HNC permanecem obscuros. Acumulando suporte de dados células-tronco cancerosas (CSCs) contribui quimio-resistência na HNC. Com base nos estudos anteriores, o objetivo do estudo é investigar o efeito da ALA-PDT em CSCs e propriedade quimiossensibilização em HNC.

Metodologia /principal achado

atividade ALDH1 CSCs marcador de HNC células com tratamento ALA-PDT, como avaliadas pelo fluxo ensaio Aldefluor citometria análise. Secundária auto-renovação formando-Sphere, expressão marcadores stemness, e invasão de HNC-CSCs com o tratamento ALA-PDT foram apresentados. Observou-se que o tratamento da ALA-PDT significativamente regulada para baixo a atividade ALDH1 e positividade CD44 de HNC-CSCs. Além disso, ALA-PDT reduzida propriedade auto-renovação e expressão assinaturas stemness (Oct4 e Nanog) em formadoras de esfera HNC-CSCs. ALA-PDT sensibilizados altamente tumorigénicas HNC-CSCs às quimioterapias convencionais. Por último, o efeito sinérgico de ALA-PDT e tratamento Cisplatina atenuada invasão /property colongenicity em HNC-CSCs.

Conclusão /Significado

Nossos resultados fornecem insights sobre a perspectiva clínica da ALA-PDT como um potencial de quimioterapia adjuvante contra o câncer de cabeça e pescoço através da eliminação de CSCs anúncio Desejo

Citation:. Yu CH, Yu CC (2014) terapia fotodinâmica com ácido 5-aminolevulínico (ALA) prejudica Tumor Iniciar e chemo-Resistência de propriedade em cabeça e cancro de células estaminais do cancro do pescoço derivados. PLoS ONE 9 (1): e87129. doi: 10.1371 /journal.pone.0087129

editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de dezembro de 2013; Aceito: 22 de dezembro de 2013; Publicação: 24 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yu, Yu. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é suportado por bolsa de investigação do Conselho Nacional de Ciência (100-2632-B-040-001-MY3, 101-2314-B-040-016, 102-2628-B-040 -001 -MY3) .Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de cabeça e pescoço (CCP) é um dos cancros mais comuns no mundo e uma das causas de morte relacionada ao câncer devido à recorrência frequente após a resistência à quimioterapia [1]. Apesar das melhorias no diagnóstico e tratamento de HNC, as taxas de sobrevivência a longo prazo melhoraram apenas marginalmente ao longo da última década [1]. Novas drogas ou estratégias são urgentemente necessárias para melhorar a quimiossensibilização aos medicamentos quimioterápicos convencionais e respostas clínicas dos pacientes HNC [2].

Estudos recentes têm apontado resistência ao tratamento radioterapias convencionais /quimioterapias é um dos principais critérios clínicos para caracterizar cancro de células estaminais (CSCs) com auto-renovação e capacidade altamente tumorigenenic em tumores malignos incluindo HNC [2] – [4] Ambos intracelular CD44 + células ALDH1 + e têm sido propostos para exibem propriedades CSCs e têm sido utilizados como CSCs marcadores funcionais para a cabeça e pescoço cancro de células estaminais derivadas de câncer (HNC-CSCs) [5] – [7]. No entanto, procurando uma abordagem eficaz segmentação HNC-CSCs para melhorar HNC neoplasias malignas relacionados com é urgentemente necessária [7].

A terapia fotodinâmica (PDT) envolve dois componentes individualmente não-tóxicos, luz e fotossensibilizador [8]. PDT é um novo tratamento e é uma promessa considerável para muitos tumores sólidos [9]. Estudos têm demonstrado que tópica de ácido 5-aminolevulínico mediada por PDT (ALA-PDT) está a ser utilizado no tratamento de várias lesões pré-malignas e malignas humano com alguns resultados encorajadores clínicos [10] – [13]. PDT pode ter o potencial para inibir a metástase de HNC incompletamente tratado [14]. Num modelo de ratos de Lewis de carcinoma de pulmão, ALA-PDT diminuiu as metástases de células cancerosas in vivo [15]. Além disso, o ALA-PDT aumenta a capacidade de apoptose das células cancerosas por via oral através de NF-kB /JNK sinalização [16]. ALA-PDT também revogada capacidade de migração de células de câncer bucal por down-regulação da FAK e ERK [17].

Com base nos estudos anteriores, o objetivo do estudo é investigar o efeito da ALA-PDT on quimiossensibilização e CSCs propriedade em HNC. No geral, demonstrou pela primeira vez ALA-PDT efetivamente reduzir propriedade CSC-like incluindo a atividade ALDH1, CD44 positivo, auto-renovação, invasão, e aumentou a quimio-sensibilidade em HNC. ALA-PDT seria uma potencial terapia quimio-adjuvante e pode ser benéfica para o tratamento anti-CSCs em HNC.

Materiais e Métodos

células primárias cultivadas a partir de tecidos HNC

amostras de tecidos cirúrgicos de pacientes HNC foram coletadas após a obtenção do consentimento informado por escrito e este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board na Chung Medical University Hospital Shan (CSMUH no: CS10249). HNC células primárias foram estabelecidas como previamente descrito [6], [18]. Em resumo, após a remoção cirúrgica dos tecidos HNC, os tecidos foram lavados 3 vezes em glicose, contendo HBSS, em seguida, as amostras foram cortadas com uma espessura de 300 um e os tecidos cortados foram imersos em 0,1% (w /w) de colagenase contendo glucose contendo HBSS durante 15 minutos a 37 ° C e submetido a rotação agitador com agitação a 125 rpm. HNC cultura primária foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) com 10% de soro fetal bovino, suplementado com piruvato a 1 mM de sódio, aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, sob condições de cultura padrão (37 ° C, 95% de ar humidif içado, 5% de CO

2).

Chemicals

5-ALA foi obtido adquiridos de Sigma (St. . Louis, MO, EUA). Imediatamente antes da utilização, 5-ALA foi ainda diluída em meio de cultura para se apropriar concentrações finais.

HNC linhas de células de cultivo e de terapia fotodinâmica baseia-5-ALA

Para estudos ALA-PDT, as células foram incubados com 5-ALA, durante 3 horas, e então irradiado com luz vermelha de 635 ± 5 nm a várias doses.

O enriquecimento de células estaminais cancro HNC formando-esfera (HNC-CSCs)

Esferas de células HNC foram isolados em meio consistindo em meio livre de soro de DMEM /F12 (GIBCO), suplemento N2 (GIBCO), 10 ng /fator mL humana recombinante de crescimento básico de fibroblastos (FGF básico), e 10 ng de crescimento epidérmico /mL fator (EGF) (R D Systems, Minneapolis, MN). As células foram colocadas em placas a uma densidade de 10

4 células vivas /10 mm pratos de fixação de baixo, e o meio foi mudado a cada dois dias até que a formação de esfera do tumor foi observada em cerca de 1 semana [2].

Aldefluor ensaio

Aldefluor kit de ensaio é adquirido de StemCell Technologies, Inc. (Vancouver, BC, Canadá) 1 × 10

5 células serão suspensos em 50 ul de tampão de ensaio e adicionado até uma concentração final Aldefluor de 1 uM. Para o controlo inibidor ALDH1, DEAB será adicionado à concentração final de 150 uM. As células serão, em seguida, incubadas a 37 ° C durante 45 minutos e coradas com 7-AAD em gelo durante mais 5 min. Depois de lavadas com PBS, as células positivas de fluorescência verde em células vivas (7AAD-) serão analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur ™, BD Bioscience), por comparação da intensidade de fluorescência da amostra tratada DEAB e estas células serão representados como células com elevada actividade de ALDH (células ALDH +) [2].

SYBR reversa em tempo real de reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR)

O ARN total de células foi purificado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, o ARN total (1 ug) de cada amostra foi reversamente transcrito por Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Em seguida, a amplificação foi realizada num volume total de 20 uL contendo 0,5 uM de cada iniciador, MgCl 4 mM de

2, 2 ul de DNA do LightCycler ™ -FastStart mestre SYBR Green I (Roche Molecular Systems, Alameda, CA, EUA ) e 2 ul de 01:10 diluída cDNA. O

GAPDH

gene housekeeping foi amplificado como padrão de referência.

GAPDH

iniciadores foram desenhados:

GAPDH

(para a frente): GGGCCAAAAGGGTCATCATC (. Nt 414-434, GenBank não BC059110.1),

GAPDH

(reverso): ATGACCTTGCCCACAGCCTT (nt 713-733). As reacções de PCR foram preparadas em duplicado, e aqueceu-se a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 10 segundos, emparelhamento a 55 ° C durante 5 segundos, e extensão a 72 ° C durante 20 segundos. Todas as reacções de PCR foram realizadas em triplicado. As curvas padrão (valores de limiar de ciclo dependendo da concentração de molde) foram preparadas para cada gene alvo e da referência endógena (

GAPDH) em cada amostra. Para confirmar a especificidade da reacção de PCR, os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese num gel de 1,2% de agrose [3]. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 1, [3].

Western blot

a extracção de proteínas a partir de células e análise de Western blot foram realizados tal como descrito. Amostras (15 ul) foram fervidas a 95 ° C durante 5 min e separados por 10% SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para molhado-Hybond-ECL papel de nitrocelulose (Amersham, Arlington Heights, IL, EUA). Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo de coelho anti-humano Oct4, de coelho anti-humano Nanog (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA); coelho anti-GAPDH (MDBio, Inc., Taipei, Taiwan); e de ratinho anti-β-actina (Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA). bandas de proteínas imunorreactivas foram detectadas pelo sistema de detecção ECL (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, EUA).

In vitro

invasão celular Assay

Para transpo� ensaios de migração , 2 × 10

5 as células foram plaqueadas na câmara superior de um Transwell (Corning, Acton, MA, EUA) com uma membrana porosa (tamanho de poro 8,0 | iM). As células foram plaqueadas em meio com baixo soro (FBS a 0,5%), e meio suplementado com soro mais elevada (10% de FBS) foi utilizado como um quimioatractivo na cara inferior. As células foram incubadas durante 24 horas a 37 ° C e as células que não migraram através dos poros foram removidos por um cotonete. As células na superfície inferior da membrana foram coradas com Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), para mostrar os núcleos; fluorescência foi detectado com uma ampliação de 100x utilizando um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). O número de células fluorescentes em um total de cinco campos selecionados aleatoriamente foi contado. Na análise in vitro de invasão de células foi como descrito anteriormente [19].

colónia de agar macio ensaio de formação

Cada poço (35 mm) de uma placa de cultura de seis poços foi revestido com 2 ml de agar de fundo (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA) mistura (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Depois de a camada inferior foi solidificada, 2 ml topo mistura de ágar-meio (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) contendo 2 × 10

foi adicionado 4 células, e os pratos foram incubadas a 37 ° C durante 4 semanas. As placas foram coradas com violeta de cristal de 0,005%, em seguida, as colónias foram contadas. O número de colónias totais com um de diâmetro ≥100 foi contado mais de cinco campos por bem para um total de 15 campos de experiências em triplicado [3].

A análise estatística

Statistical Package de Ciências Sociais software (versão 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) foi utilizado para a análise estatística. Estudante de

t

teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças entre grupos experimentais;

p

valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. O nível de significância estatística foi fixado em 0,05 para todos os testes.

Resultados

A inibição da actividade ALDH1 em células HNC em tratamento ALA-PDT

ALDH1, uma isoenzima citosólica que é responsável pela oxidação de retinol para o ácido retinóico durante o início de diferenciação de células estaminais têm mostrado ser marcadores CSC no cancro da cabeça e pescoço [20], [21]. Em primeiro lugar, utilizou-se o sistema de ensaio da actividade de ALDH à base de células in vitro, o qual tem sido demonstrada como um marcador HNC-CSCs, para examinar os efeitos de ALA-PDT sobre a actividade ALDH1 em linhas celulares de HNC e células HNC cultivadas primárias por citometria de fluxo descrito em materiais e métodos. Nossos dados sugerem tratamento ALA-PDT diminui significativamente a atividade ALDH1 de células HNC (Fig. 1).

linhas celulares HNC (a) (SAS e Ca9-22) e células HNC primárias (HNC-1 e HNC- 2) foram semeadas como 1 × 10

6 células /poço em 6 poços de placa e, em seguida, pré-tratados ALA 1 mM durante 3 h seguida por TFD com luz vermelha a uma dose de 4 único grupo de controlo de tratamento /cm2 ou ALA J . células ALDH + foram determinadas por ensaio de Alderfluor e as células viáveis ​​(7-AAD negativo) foram utilizadas para análise. células tratadas com deab foram usadas como controlo negativo. (B) Os resultados de quantificação foram mostrados em gráfico de barras. Os experimentos foram repetidos três vezes e resultados representativos foram mostrados. Os resultados são apresentados como médias ± SD *, p . 0,05

ALA-PDT efetivamente elimina a capacidade de auto-renovação, positividade CD44 e assinaturas stemness em HNC-CSCs

Anteriormente, examinamos o sucesso esfera formação ao longo de passagens em série da cultura, um dos índices para avaliar a propriedade auto-renovação persistente de células-tronco cancerosas, e mostrou que a capacidade de auto-renovação de toda a HNC-CSCs [22]. Para investigar o efeito da ALA-PDT na manutenção da auto-renovação HNC-CSCs, foi avaliada a capacidade de formação de esfera secundária com tratamento ALA-PDT em células HNC. O tratamento de células HNC com ALA-PDT interferiu com esferas de tamanho de corpo e números de HNC-CSCs (Fig. 2A). A análise de citometria de fluxo de expressão de CD44 indicaram que o tratamento ALA-PDT reduziu a percentagem de células tanto de CD44 + em HNC-CSCs (Fig. 2B). Para continuar a determinar se a redução do tumor esfera eficiência formação com o tratamento ALA-PDT foi devido à diminuição da expressão de marcadores stemness, genes stemness (Oct-4 e Nanog), do HNC-CSCs com controle e tratamento ALA-PDT formando esfera-foram determinados por A análise de western blot. Os resultados confirmaram que ALA-PDT tenha sido tratada com HNC-CSCs reduziu acentuadamente a transcrição de expressão (Fig. 2C) e nível de proteína (Fig. 2D) de genes stemness.

(A) Para a análise de auto-renovação, único suspensão de células foi obtido a partir de esferas primárias HNC-CSCs por Accutase capacidade de digestão e formação esfera secundário foi determinada com o procedimento de cultura primária esfera excepto a densidade de célula de galvanização de 10000 células /ml. (B) A expressão de CD44 positividade de controlo e tratados com PDT-ALA-HNC CSCs foi determinada por análise de citometria de fluxo. Os dados aqui apresentados são a média ± DP de três experiências independentes. *, P 0,05 vs controlo. SAS ou derivado Ca9-22-HNC-CSCs tratou-se com o controlo ou ALA-PDT e analisados ​​transcritos e o nível de proteína de Oct-4 e Nanog por em tempo real de RT-PCR (C) e análise de imunotransferência (D), respectivamente. *, P . 0,05 vs. Controle

entrega tratamento ALA-PDT aumenta a eficácia da quimioterapia em HNC-CSCs

CSCs são relativamente resistentes à quimioterapia [6]. Os resultados que o tratamento ALA-PDT regulados propriedades CSCs sugerido um papel para ALA-PDT como um potencial terapia quimio-adjuvante. ensaios de viabilidade celular mostrou que o efeito citotóxico sobre as HNC-CSCs à cisplatina e fluorouracil (5-FU) foi significativamente aumentada com o tratamento combinado ALA-PDT (Fig. 3A). Citometria de fluxo Análise da resistência a múltiplos fármacos (MDR) genes indicou que a quimiorresistência diminuiu por tratamento ALA-PDT pode ser atribuído à redução da expressão de ABCG2 (Fig. 3B). Estes dados sugerem que o tratamento com ALA-PDT melhorou a resistência aos medicamentos de HNC-CSCs a cisplatina e fluorouracil (5-FU) tratamento através ABCG2 infra-regulação.

(A) HNC-CSCs com ALA-PDT ou controlo tratamento foram sujeitos a tratamento com diferentes concentrações de cisplatina ou de 5-FU. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. (B) A análise de citometria de fluxo do nível de expressão do marcador ABCG2 resistente a drogas no HNC-CSCs expressão, tal como indicado.

A co-administração de tratamento ALA-PDT e cisplatina revogada invasividade e clonogenicidade de HNC -CSCs

Desde CSCs parecem desempenhar um papel significativo na promoção tumor iniciar a atividade [3], buscou-se medir os efeitos sinérgicos da ALA-PDT combinados com o tratamento com cisplatina na invasão /clonogenicidade de HNC-CSCs. suspensão de células isoladas de TFD-ALA-tratada HNC-CSCs foram tratados com ou sem tratamento com cisplatina foi usada para a análise da sua invasão /clonogenicidade

In vitro

como descrito na secção Materiais e Métodos. O tratamento com cisplatina isoladamente não afectou a capacidade de invasão em HNC-CSCs (Fig. 4A), a combinação de ALA-PDT e tratamento com cisplatina aumentou a eficácia destes tratamentos (Fig. 4a). Enquanto isso, também foi observado efeito sinérgico similar de tratamento ALA-PDT e quimio-tratamento no ensaio de formação de colónia (Fig. 4B). O tratamento combinado mostrou um efeito sinérgico na revoga clonogenicidade em HNC-CSCs. Estes dados indicam que a eficácia do tratamento de quimioterapia cisplatina em HNC-CSCs pode ser melhorada com o tratamento ALA-PDT.

(A) a capacidade de invasão e (B) a capacidade de HNC-CSCs formação de colónias foi examinado após o tratamento ou com ALA-PDT ou quimioterapia com cisplatina ou ambos. *, P 0,05 ALA-PDT versus controle; #, P 0,05 ALA-PDT + cisplatina

Discussão

CSCs são consideradas responsáveis ​​pela iniciação, propagação e metástase de tumores [23 vs. sozinho ALA-PDT. ]. É importante ressaltar que a existência de CSCs podem explicar recorrência de câncer, mesmo após o tratamento clínico ou com radioterapia ou quimioterapia em pacientes com câncer [24]. Portanto, buscando a nova modalidade terapêutica segmentação CSCs espero que nos fornecer novas abordagens terapêuticas. No presente relatório, em primeiro lugar, mostrou ALA-PDT proporcionou um efeito terapêutico em HNC-CSCs inibindo as propriedades CSCs-like de câncer de cabeça e pescoço, tais como a assinatura stemness, a capacidade de migração e chemoresistance. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar o papel fundamental de uma terapia à base de ALA-PDT na segmentação células CSC-como HNC-derivados e no bloqueio tumor HNC-CSCs mediada atividade inicial.

transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um processo crítico para o desenvolvimento embrionário adequado, e é também re-envolvida em adultos durante a tumorigénese [25]. EMT é largamente aceite como uma das propriedades CSCs, [26] e de sinalização Oct4 /Nanog foi demonstrado estar envolvida na regulação da EMT e metástase [27]. As células epiteliais de cancro oral podem adquirir características mesenquimais que facilitam a migração e invasão por meio de processo de TEM. [28] Sabe-se que EMT podem dar origem a células com células estaminais, e cancro iniciar células estaminais propriedades que tenham sido submetidos a EMT são, portanto, mais móveis e metástase . [26]. Desde que descobriram que o efeito da ALA-PDT sobre a capacidade de invasão em HNC-CSCs, explorando se o ALA-PDT mediada CSCs e capacidades de invasão dependendo EMT percurso serão investigadas no futuro.

A quimioterapia é a plataforma de corrente para o tratamento de pacientes com metástases HNC [29]; No entanto, o efeito quimioterapêutico é limitado, e os seus efeitos secundários, em grande parte interferir com a qualidade de vida dos pacientes. CSCs são clinicamente caracterizado pela resistência à quimioterapia [29]. A presença de CSCs resulta na baixa eficácia de terapias anti-cancerígenas e o fracasso da erradicação do tumor e, eventualmente, leva a recorrência de tumores e metástases [30]. A HNC-CSCs foram altamente resistentes à quimioterapia [18], e a quimiorresistência destas células foi significativamente inibida quando foram tratadas com ALA-PDT. Vale ressaltar que o tratamento ALA-PDT resultou em níveis reduzidos de proteína MDR em CSCs HNC derivadas após chemotreatment. As modalidades específicas da rede de regulação entre o tratamento ALA-PDT em genes resistentes aos medicamentos requer uma investigação mais aprofundada.

Em conclusão, o presente estudo demonstrou os efeitos inibitórios da ALA-PDT nas propriedades tronco-like e chemoresistance em HNC . Notavelmente, aqui é grande necessidade de desvendar os mecanismos subjacentes da via ALA-PDT-mediada em HNC-CSCs e avaliar ainda mais as possibilidades terapêuticas de tratamento ALA-PDT clinicamente.