Abstract

O transmembrana e proteína secretada delta-like 1 homólogo (

DLK1

) pertence à EGF-como família. É amplamente aceito que

DLK1

desempenha um papel importante na diferenciação celular regulação, tais como adipogênese e osteogênese. expressão aberrante de

DLK1

foi encontrado em vários tipos de cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão. Um estudo anterior neste laboratório revelou que

DLK1

está associado com a invasão do tumor, embora o mecanismo ainda é desconhecido. Para explorar os efeitos potenciais que

DLK1

pode ter sobre a invasão,

DLK1

foi overexpressed ou derrubado nas linhas celulares de cancro de pulmão humano. influências da proteína sobre a invasão da célula foram avaliados posteriormente. Um ensaio transpoço mostrou que

DLK1

superexpressão promoveu significativamente a invasão da célula cancerosa. análise de transferência e zimografia Ocidental indicou que

DLK1

poderia afetar tanto a matriz de metaloproteinase-9 (

MMP9

) expressão e sua atividade extracelular. Uma análise do

NOTCH1

e

HES1

expressão gênica e Notch domínio intracelular (NICD) translocação nuclear durante

DLK1

estimulação ou o esgotamento demonstrado que

DLK1

poderia ativar a sinalização Notch em células de câncer de pulmão. Além disso, a expressão elevada de

MMP9

induzida pela

DLK1

estimulação pode ser significativamente diminuída inibindo a sinalização Notch utilizando inibidor γ-secretase (GSI). Os dados apresentados neste estudo sugerem que

DLK1

pode promover a invasão de células de câncer de pulmão por upregulating

expressão MMP9

, que depende da sinalização Notch

Citation:. Li L , Tan J., Zhang Y, Han N, Di X, Xiao T, et al. (2014)

DLK1

promove o câncer de pulmão invasão celular através de regulação positiva de

MMP9

Expressão Dependendo sinalização Notch. PLoS ONE 9 (3): e91509. doi: 10.1371 /journal.pone.0091509

editor: Yunli Zhou, Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de novembro de 2013; Aceito: 11 de fevereiro de 2014; Publicação: 12 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciência Natural da China (30930042 e 81301852) e do Fundo de Investigação especializada para o Programa de Doutorado da Educação Superior (20111106110017). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo, e metástase do tumor é fortemente associada com o prognóstico de pacientes com câncer [1], [2]. Os nossos estudos anteriores sobre os genes diferencialmente expressos em carcinoma de células escamosas do pulmão humano (SCC), com ou sem metástases da linfa usando análise de DNA microarray encontrado um conjunto de genes associados a metástase (FDR 0,05, dados não apresentados). Entre esses genes,

DLK1

mostrou que mais de duas vezes maior expressão nos tumores primários com metástase linfonodal, sugerindo que

DLK1

podem desempenhar papéis na metástase do câncer. No entanto, tanto a relação entre o

DLK1

e metástase do tumor e seu mecanismo são mal caracterizadas.

O delta-like 1 homólogo (

DLK1

) gene, com os aliases

FA1

,

ZOG

e

PREF-1

, codifica uma proteína transmembranar e secretada (DLK1) contendo seis fator de crescimento epidérmico (EGF) domínios que é um membro da FEG família -como. Esta proteína é altamente homólogo ao ligando DLL1 Notch, mas não tem o motivo Delta /Serrate /Lag (DSL) que é crítica para interagir com os receptores de Notch [3], [4]. Estudos sobre

DLK1

revelaram o seu papel na diferenciação celular. Por exemplo,

DLK1

pode funcionar na modulação da adipogénese [5], [6], [7], que regula a diferenciação dos osteoblastos [8], [9] e inibição da proliferação e diferenciação de células hematopoiéticas [10]. O ligando nonclassical

DLK1

foi encontrado para ser expressas de forma aberrante em vários cancros humanos, incluindo neuroblastoma [11], carcinoma hepatocelular [12], [13], gliomas [14] e cancro da próstata humana [15]. Nosso trabalho anterior também constatou que

DLK1

é altamente expresso no cancro do pulmão de células humanas não-pequenas e funciona como um oncogene [16]. expressão regulada de

DLK1

no cancro do pulmão de não pequenas células está associada com metástase ganglionar, mas o mecanismo ainda é desconhecido.

A via Notch é uma via de transdução de sinal bem conhecido durante a processo de desenvolvimento e determinação do destino da célula. Embora sem o motivo DSL,

DLK1

tem sido mostrado que actua como um inibidor de sinalização de Notch in vitro [17], [18]. Ambos e segregada DLK1 pode interagir com NOTCH1 [17], que conduz a distribuição celular alterado de NOTCH1 e inibição da expressão de genes regulados por Notch [4], ligada à membrana [5], [19]. Tem sido relatado que

NOTCH1

pode regular a expressão de metaloproteinase de matriz-9 (

MMP9) em células de cancro da próstata, o qual desempenha um papel chave na invasão de cancro [20]. Tomando estes resultados juntos, nós supor que a sinalização Notch pode ser envolvido em

DLK1

induzida por invasão da célula cancerosa.

O estudo que apresentamos aqui fornece evidências sugerindo que

DLK1

reforçada a capacidade das células de cancro do pulmão para invadir a matriz extracelular (ECM), que valida a expressão do gene anterior profiling resultados derivados a partir de análise de microarray. Além disso, nossos dados demonstram que

DLK1

promoveu a invasão de células cancerosas através de regulação positiva de

MMP9

expressão e de reforço da sua actividade extracelular, que são dependentes da via de sinalização Notch.

materiais e Métodos

as culturas de células e tratamento

a linha de células de cancro do pulmão humano H520, H1299 e A549 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 ug /ml de penicilina-estreptomicina, numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C . O inibidor de Notch L-685.458 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionada ao meio de cultura 12 horas após a transfecção transiente com o

DLK1

plasmídeo de expressão ou o vector nulo (pcDNA3.1), com uma concentração final eficaz de 5 mM em meio RPMI 1640 contendo 1% de FBS.

DLK1

plasmídeo de expressão e pequena interferência RNA (siRNA)

O

DLK1

plasmídeo de expressão eucariótica foi construído e, em seguida, transfectadas de forma estável em células H520, tal como previamente descrito [16]. O

DLK1

plasmídeo de expressão foi também transientemente transfectados em células H520 e H1299, utilizando o reagente de transfecção Lipofectamine-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA); e um duplex Invitrogen discrição siRNA (Carlsbad, CA) contra o

DLK1

foi utilizado para silenciamento de genes utilizando Lipofectamine RNAiMAX reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguindo as instruções dos fabricantes.

In vitro ECM invasão ensaio

As células quer estavelmente (H520) ou transitoriamente (H1299) transfectadas com

DLK1

ou vector nulo foram cultivadas confluência separadamente até 80%. As células foram então lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e cultivadas em meio isento de soro durante a noite antes de ser submetido a um ensaio de invasão in vitro de ECM. O ensaio foi realizado usando quimioinvasão Biocoat Matrigel Invasão secções com 8 um poros (BD Biosciences, Bedford, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 2,5 × 10

4 células foram ressuspensas em meio livre de soro fresco e semeadas para dentro da câmara superior de um Transwell de 24 poços da placa, enquanto a câmara inferior contém meios de cultura fresco com 20% de FBS como um quimioatractor. As células foram deixadas a invadir durante 22 horas (37 ° C, 5% de CO

2 atmosfera), e as câmaras foram depois lavadas com PBS. As células que não invadem através da membrana foram removidos. As células invasoras sobre a superfície inferior da membrana foram fixadas com metanol frio, coradas com 0,2% de violeta de cristal e examinada. As células em cada membrana foram contados em pelo menos cinco campos sob um microscópio de luz.

extracção de ARN e a transcrição reversa quantitativa PCR-

O ARN total foi isolado a partir das células com o reagente TRIzol (Invitrogen , Carlsbad, CA), e 1? g de ARN total foram utilizadas para a transcrição reversa com um kit de transcrição reversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em tempo real A análise de PCR de

MMP9

e

HES1

expressão foi realizado com os seguintes iniciadores: MMP9-F 5′-TTTGACAGCGACAAGAAGTG-3 ‘, MMP9-R 5′-CAGGGCGAGGACCATAGAGG-3′ , HES1-F 5’-TAGCTCGCGGCATTCCAAG-3 ‘e HES1-R 5′-AAGCGGGTCACCTCGTTCA-3’. O gene de manutenção

18S

RNA ribossomal foi escolhido como um controlo interno, neste estudo, com os iniciadores como 18S-F 5′-GAAACGGCTACCACATCC-3 ‘e 18S-R 5′-ACCAGACT2TGCCCTCCA-3’. Um kit SYBR Premix Ex Taq (Takara, Shiga, Japão) foi usada para a análise por PCR em tempo real com um protocolo de amplificação padrão: 95 ° C durante 10 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 s e uma extensão final a 72 ° C durante 3 min. Após a amplificação, uma curva de fusão procedimento padrão foi realizada para cada gene para examinar a especificidade da amplificação.

análise de transferência de Western

A proteína total foi extraído a partir de cerca de 2 × 10

6 cultivadas células com tampão RIPA, e a proteína nuclear foi extraído utilizando NE-PER reagentes de extracção nuclear e citoplasmática (Pierce, Rockford, IL) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. No total, 40-80 ug de proteínas foram separadas por electroforese e depois transferido para uma membrana de PVDF, como previamente descrito [21]. A membrana foi bloqueada com leite sem gordura 5% e incubadas com um anticorpo primário contra DLK1 (Grupo Proteintech, Chicago, IL), NOTCH1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), NOTCH1 clivado (Val1744, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ou MMP9 (Sistemas Aviva Biologia, San Diego, CA). O intracelular domínio de anticorpo anti-Notch (NICD) utilizada neste estudo só pode reconhecer clivada e ativado NOTCH1 mas não de corpo inteiro NOTCH1. Após lavagem com PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST), a membrana foi incubada com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Dako, Glostrup, Dinamarca), e a abundância de proteínas foi detectada com reagentes de quimioluminescência. A membrana foi sondado com um anticorpo contra GAPDH (Kangchen Bio-Tech, Xangai, China) ou TBP (Abcam, Cambridge, MA), como controles internos para carga de proteína equivalente.

Gelatina zimografia

estavelmente

células dLK1

-expressing H520-dlk1, juntamente com células H520-pcdb e H520 parental-controle null, foram cultivadas separadamente em placas de 10 cm até 80% de confluência. Os meios condicionados foram recolhidos e concentrados usando um filtro Amicon (Millipore, Bedford, MA) de acordo com o protocolo do fabricante. No total, 20 ug de proteínas concentradas-se a electroforese sob condições não redutoras, e a actividade gelatinolítica da MMP9 foi então analisado utilizando reagentes zimografia (Bio-Rad, Hercules, CA) seguindo as instruções do fabricante.

A análise estatística

as diferenças entre contagens de células invasoras em cada grupo no ensaio de invasão e diferenças na expressão relativa na análise por PCR em tempo real foram avaliadas usando um teste t de Student. Todos os testes foram em frente e verso, e um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os testes estatísticos foram realizados com o pacote de software SPSS, versão 13.0 (SPSS, Chicago, IL).

Resultados

superexpressão do

DLK1

invasão ECM reforçada por células de câncer de pulmão

Para abordar se

DLK1

tem um potencial papel na metástase do câncer de pulmão, as linhas cancercell pulmão H520 e H1299 foram empregados como modelo in vitro em que a expressão endógena de

DLK1

foi em falta. As células H520 com expressão estável do exógeno

DLK1

(H520-dlk1) foram geradas anteriormente, em conjunto com as células H520-pcdb, transfectadas de forma estável com o vector (pcDNA3.1) como controlo nulo [16]. As células H520-dlk1 foram submetidos ao ensaio de invasão, com células H520 parentais como controlos H520-pcdb e. Como mostrado na Figura 1 o painel A e B, após um período de 22 horas de invasão, havia um número significativamente maior de células H520-dlk1 invadiram através da membrana câmara revestida com Matrigel, em comparação com H520 e células H520-pcdb (p-valor 0,05). Um fenômeno similar foi observado em células H1299. Mais

DLK1

transientemente transfectadas células H1299 (H1299-dlk1) foram encontrados invadida através da membrana em comparação com as células H1299 transf ectadas com o vector nulo (H1299-pcdb), como mostrado na Figura 1C e D. Estes resultados sugerem que a sobre-expressão de

DLK1

poderia extremamente melhorar a capacidade das células para invadir o ECM.

a, fotomicrografias representativas das células invasoras que migraram através da membrana Matrigel-revestidas do Transwell, tomadas a partir de três grupos: H520, as células progenitoras, H520-pcdb, as células de controle de vetores nulos e H520-dlk1, as células que expressam de forma estável dLK1. B, um histograma para as contagens de células migratórias do grupos H520-dlk1 H520, H520-pcdb e. C, fotomicrografias representativas mostrando H1299 células, as quais foram transitoriamente transfectadas com

DLK1

(H1299-dlk1) ou vector nula (H1299-pcdb), que invadiu através da membrana de Matrigel-revestidas do Transwell. D, um histograma para as contagens de células migratórias dos grupos H1299-dlk1 e H1299-pcdb. Os experimentos foram realizados em triplicado (* t-teste, valor de p 0,05).

superexpressão do

DLK1

expressão MMP9 regulada ea atividade

Based na hipótese de que

DLK1

induzida por invasão da célula cancerosa foi mediada por regulação positiva de

MMP9

, a expressão de

MMP9

sobre

DLK1

estimulação foi analisada tanto por PCR em tempo real e Western blotting. Os resultados mostraram que

MMP9

expressão foi melhorada em células H520-H520 dlk1 em comparação com as células e H520-pcdb, tanto sobre o ARNm e os níveis de proteína (Figura 2A e B). A mesma tendência também foi observada quando

DLK1

foi sobre-expresso em outra linha de células de câncer de pulmão H1299. Após transitoriamente transfectadas com

DLK1

, altamente expresso

MMP9

foi detectado em ambos os mRNA e os níveis de proteína (Figura 2D e E). Como a proteína MMP9 cumpre a sua função em uma forma activada no espaço extracelular, os meios condicionados foram recolhidos, e a zimografia de gelatina foi utilizada para testar a actividade de MMP9. Na Figura 2C, mostra-se que

DLK1

também pode aumentar a actividade de MMP9 no espaço extracelular, enquanto que a actividade de MMP2 foi inalterada. Para confirmar ainda mais a relação entre a

DLK1

e

MMP9

, a interferência RNA foi empregado para esgotar

expressão DLK1

em células A549, e

MMP9

expressão era examinadas sequencialmente. Os resultados mostraram que a expressão DLK1 foi suprimida de forma eficaz por RNAi ao nível da proteína (Figura 2G), e expressão de MMP9 foi significativamente inibida, tanto o ARNm e os níveis de proteína (Figura 2F e G). Estes resultados sugerem que

DLK1

pode promover a invasão celular através de regulação da expressão MMP9 e atividade.

A, um histograma para a expressão de mRNA relativa de

MMP9

em células H520 transfectadas com

dLK1

(H520-dlk1) ou vector nula (H520-pcdb) detectado por análise de PCR em tempo real. O nível de

expressão MMP9

nas células H520 em branco foi usado como um controlo e ajustado para 1. B, a expressão da proteína de MMP9 em H520-dlk1, H520-H520 pcdb e células avaliadas por análise de transferência de Western. C, zimografia de gelatina que mostra a actividade de MMP9 e MMP2 secretada em H520-dlk1, H520-H520 pcdb e células. D, em tempo real A análise de PCR da expressão de ARNm relativa de

MMP9

em células H1299 transf ectadas com o

DLK1

(H1299-dlk1) ou vector nula (H1299-pcdb) mostrado num histograma. E, Western blot mostrando a expressão da proteína de MMP9 em células H1299-H1299-dlk1 e pcdb. F, um histograma mostrando a expressão de mRNA relativa de

MMP9

em

DLK1

siRNA (A549-si-dlk1) ou controlo nulo siRNA (A549-NC) células A549 transfectadas avaliados pelo tempo real A análise de PCR. L, a expressão da proteína de MMP9 em A549-Si-dlk1, A549-A549 NF e células em branco detectado por Western blotting. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

18S

RNA ribossomal foi usada como um controlo interno na análise por PCR em tempo real, enquanto que de GAPDH foi usada como um controlo interno na análise de transferência de Western (* t-teste, p-valor 0,05).

superexpressão do

DLK1

via de sinalização Notch activado

Para confirmar a associação entre o

DLK1

e

NOTCH1

, nós primeiro testado expressão NOTCH1 em lisados ​​de células inteiras por Western blotting. Verificou-se que a sobre-expressão de

DLK1

poderia regular a expressão NOTCH1 em ambos H520 e H1299 células (Figura 3A e D). Como a ativação NOTCH1 é seguido por sua clivagem para o NICD e translocação do NICD para o núcleo para mais regulação transcricional, a quantidade de NICD em núcleos poderia refletir a atividade da via Notch. Foram extraídos proteínas nucleares de H520 células transitoriamente transfectadas com

DLK1

ou null-vector e examinou a quantidade de NICD, utilizando transferência de Western. Os resultados mostraram que NICD translocado para núcleos mais intensamente após a sobre-expressão de

DLK1

em comparação com o controlo nula (Figura 3B). Além disso, a expressão de

HES1

, um gene alvo via Notch explícita, também foi examinado por PCR em tempo real em H520 e H1299 células. Houve uma regulação positiva significativa de

HES1

após a estimulação de

DLK1

expressão em comparação com o controlo null em ambas as células (p-valor 0,05, Figura 3C e E). Em contraste, a diminuição da expressão de NOTCH1 HES1 e foi detectado por Western blot e PCR em tempo real, respectivamente, quando a expressão DLK1 foi esgotada por RNAi em células A549 (Figura 3F e G).

A, que mostra a transferência de Western expressão NOTCH1 em células H520 após a transfecção com o

dLK1

(H520-dlk1) ou vector nula (H520-pcdb) examinada em lisados ​​de células inteiras. GAPDH foi usada como um controlo interno. B, Western blotting avaliação da expressão nuclear em células NICD H520-dlk1 andH520-pcdb. TBP foi utilizado como um controlo interno. C, um histograma para a expressão de ARNm de gene alvo em relação Notch

HES1

nas células H520-H520 e dlk1-pcdb detectados por análise de PCR em tempo real. células H520-pcdb foram utilizados como controle, e seu nível de

HES1

foi definido como 1.

18S

RNA ribossomal foi usado como um controle interno expressão. D, Western blot mostrando a expressão de NOTCH1 em H1299 células transfectadas com

DLK1

(H1299-dlk1) ou vector nula (H1299-pcdb). GAPDH foi usada como um controlo interno. E, um histograma que apresenta a expressão de ARNm relativa de

HES1

em células H1299-H1299-dlk1 e pcdb detectados por análise de PCR em tempo real. F, a expressão de NOTCH1 no citoplasma foram avaliadas por transferência de Western em células A549 transf ectadas transitoriamente com

DLK1

siRNA (A549-Si-dlk1) ou controlo nulo siRNA (A549-NC). GAPDH foi usada como um controlo interno. L, em tempo real A análise de PCR da expressão de ARNm relativa de

HES1

em células A549-A549 NF-Si-dlk1 e, e apresentada num histograma. Os experimentos foram realizados em triplicado (* t-teste, valor de p 0,05).

DLK1

regulada

expressão MMP9

parcialmente através de via de sinalização Notch

Para determinar se

DLK1

upregulated

expressão MMP9

em uma maneira dependente da sinalização de Notch, aplicou-se a L-685.458, que é um inibidor γ-secretase (GSI) que suprime NOTCH1 clivagem domínio intercelular por γ-secretase, inibindo assim a actividade de sinalização Notch. A expressão relativa de

MMP9

durante a estimulação da

DLK

1 expressão com ou sem o tratamento GSI foi analisada por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que, quando a sinalização Notch foi bloqueada por tratamento com L-685.458,

DLK1

estimulada

MMP9

regulação positiva foi reduzida significativamente (Figura 4A), indicando o envolvimento da sinalização Notch no presente regulamento processo. Além disso, também foi notado que embora a atividade de sinalização Notch foi suprimida a um nível comparável com a falta de

DLK1

superexpressão (representado por um

expressão HES1

na Figura 4B, dlk1 + /GSI + comparação com dlk1 – /GSI +, teste t valor p = 0,078), a expressão de

MMP9

não seguiu a mesma tendência, sugerindo que

DLK1

pode também regular

MMP9

expressão através da sinalização dos caminhos da transdução diferente de Notch. A expressão de

HES1

, que é um gene alvo da via de sinalização de Notch, foi avaliada em paralelo como um indicador da actividade de sinalização do entalhe (Figura 4B).

A, um gráfico de barras de a expressão de ARNm de

MMP9

detectado por PCR em tempo real em células H520 com ou sem

DLK1

superexpressão e com ou sem tratamento GSI. O grupo com nenhum

DLK1

estimulação nem tratamento GSI (dlk- /GSI-) foi usado como um controle, eo nível de

expressão MMP9

foi definido como 1.

18S

ARN ribossomal foi usada como um controlo interno. B, a expressão de

HES1

avaliadas por PCR em tempo real em paralelo ao

MMP9

expressão é mostrada em um gráfico de barras, indicando atividades de sinalização Notch em cima

DLK1

superexpressão ou tratamento GSI. Os experimentos foram realizados em triplicado (* t-teste, valor de p 0,05).

Discussão

Estudos sobre

DLK1

revelaram suas funções em a diferenciação e proliferação das células [5], [6], [10]. Também tem sido relatado que

DLK1

é expresso de forma aberrante em vários tipos de cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão de não pequenas células [14], [16], [22], [23]. Estes estudos em cancros humanos centrou-se principalmente sobre a expressão anormal de

DLK1

mas não explorar sua associação com a metástase do câncer. O nosso trabalho anterior em genes associados a metástase do pulmão humano SCC sugeriu que

DLK1

pode funcionar na metástase do tumor (dados não apresentados). No presente estudo, nós validado que a superexpressão de

DLK1

poderia aumentar a capacidade invasiva de células de câncer de pulmão (conforme Figura 1 mostrado), o que é consistente com nossos resultados anteriores derivados do perfil de expressão gênica e se estende nosso conhecimento de função do dlk1 no cancro humano.

Embora a proteína DLK1 falta o motivo DSL, que se crê desempenhar um papel chave nas interacções com os receptores de ligandos ‘Notch, uma interacção entre o receptor e DLK1 NOTCH1 tem sido demonstrado numa levedura sistema de dois híbridos [19]. No entanto, o efeito da DLK1 na via de sinalização do entalhe é ainda controversa [4], [5], [19]. Baladrón et ai. sugeriu que o efeito de

DLK1

sobre a sinalização Notch é diferente entre

DLK1

variantes. Considerando que secretada DLK1 pode funcionar como um antagonista de Notch, podem activar a membrana DLK1 Notch. Os nossos resultados mostraram que uma mistura de membrana e segregadas DLK1 pode activar a sinalização de Notch em células de cancro do pulmão humano. A utilização de uma mistura de

DLK1

variantes aqui foi realizado na tentativa de simular situações in vivo. Além de Notch ativação de sinalização, observamos também uma regulação positiva da expressão NOTCH1 durante a estimulação da

DLK1

superexpressão. Notavelmente, a activação da sinalização de Notch por

DLK1

pode ser um efeito combinado da sobre-regulação da expressão e clivagem NOTCH1 NOTCH1 estimulada por ligação DLK1. Além disso, a expressão aberrante de NOTCH1 é encontrado em vários tipos de cancros humanos [24], [25], incluindo câncer de pulmão de não pequenas células [26], [27]. Porque o nosso estudo sugere uma relação regulatória entre

DLK1

e

NOTCH1

, é natural supor que a expressão anormal de NOTCH1 em cânceres é parcialmente a consequência da expressão aberrante de DLK1.

Descobrimos que o

DLK1

-promoted invasão de células de câncer de pulmão foi associado com a regulação positiva da expressão de MMP9 e sua atividade extracelular (Figura 2), que estão envolvidos na degradação de ECM e altamente associados à invasão tumoral [ ,,,0],20]. Nós ainda determinar se a sinalização Notch estava envolvido em

DLK1

-regulated expressão MMP9 usando um GSI para bloquear a sinalização Notch e, em seguida, avaliar a resposta de MMP9 durante a estimulação de expressão

DLK1

. Observou-se uma diminuição significativa na expressão de MMP9 elevada quando sinalização Notch foi bloqueado (Figura 4). Curiosamente, também observamos que

DLK1

poderia ainda moderadamente regular a expressão MMP9 quando a via de sinalização Notch foi bloqueada, o que implica que

DLK1

pode funcionar na invasão de câncer em ambos sinalização Notch-dependente e independente de maneiras. Apesar da interacção de DLK1 e NOTCH1, também tem sido relatado que DLK1 poderia funcionar em outras vias de sinalização. Por exemplo, podem interagir com DLK1 /IGF-1 IGFBP1 complexos e activar o receptor do IGF [6] sinalização e poderá também aumentar a fosforilação de MEK /ERK e MEK activar /ERK sinalização [28], [29]. O nosso trabalho também sugeriu que poderia DLK1 sinalização de NF-kB activa (dados não apresentados). Considerando-se que as vias de sinalização em uma célula tem cross-talk significativa e que a transcrição de genes é regulada por uma combinação de diferentes vias, o que acreditamos ser lógico e dependente da dose, não é surpreendente que

DLK1

poderia aumentar invasão celular através de múltiplas vias.

em conclusão, os dados apresentados neste estudo provou o papel da

DLK1

no câncer de invasão e explorou o mecanismo molecular por trás desta função, fazendo

DLK1

um novo gene candidato em estudos de metástase do câncer.