Abstract
D, L-sulforafano (SFN), um análogo sintético racêmica de brócolis constituinte L-sulforafano, é um agente quimiopreventivo do câncer altamente promissor com
in vivo
eficácia contra chemically- induzida, bem como do cancro orientada por oncogene em modelos de roedores pré-clínicos. efeito quimiopreventivo do cancro do SFN é caracterizado por G detenção
2 /H célula fase do ciclo, a indução de apoptose e inibição da migração celular e invasão. Além disso, SFN inibe múltiplas vias de sinalização oncogénica frequentemente hiperativas em cancros humanos, incluindo o factor-kB, Akt, transdutor nuclear de sinal e ativador de transcrição 3 e receptor de andrógeno. O presente estudo foi desenhado para determinar o papel da sinalização Notch, que é constitutivamente ativa em muitos cancros humanos, em efeitos anticancerígenos de SFN utilizando células cancerosas da próstata como modelo. A exposição das células cancerosas humanas da próstata (PC-3, LNCaP e /ou LNCaP-C4-2B) SFN, bem como a sua ocorrência natural tio-, sulfinil- e sulfonil-análogos resultou na clivagem (activação) de Notch1, Notch2, e Notch4, que foi acompanhada por uma diminuição nos níveis de formas de Notch de comprimento total, especialmente nos pontos de tempo de 16 e 24 horas. A clivagem mediada por SFN isoformas de Notch foi associada com a sua activação transcricional como evidenciado pela RBP-JK-, HES-1A /B e HEY-1 Os ensaios de repórter de luciferase. A migração de células LNCaP PC-3 e foi significativamente diminuído pela interferência de ARN de Notch1 e Notch2, mas não Notch4. Além disso, a inibição SFN mediada por PC-3 e migração de células LNCaP foi apenas marginalmente afectada por knockdown de Notch1 e Notch2. Surpreendentemente, a administração SFN para Transgénicos Adenocarcinoma de ratinhos transgénicos mouse próstata não conseguiu aumentar os níveis de Notch1 clivada, clivada Notch2 e HES-1 proteínas
in vivo
em neoplasia intraepitelial prostática, carcinoma da próstata ou mal diferenciadas bem diferenciado lesões de câncer. Estes resultados indicam que a ativação Notch é em grande parte dispensável para a inibição SFN mediada da migração celular, que deve ser visto como uma vantagem terapêutica como a ativação Notch é frequente em cancros da próstata humanos
Citation:. Hahm ER, Chandra-Kuntal K, Desai D, Amin S, SV Singh (2012) Notch Activation é dispensável para D, L-Sulforaphane-Mediated inibição da migração celular do cancro da próstata humana. PLoS ONE 7 (9): e44957. doi: 10.1371 /journal.pone.0044957
editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Estados Unidos da América
Recebido: 22 de junho de 2012; Aceito: 10 de agosto de 2012; Publicação: 07 de setembro de 2012
Direitos de autor: © Hahm et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta investigação foi apoiado pelo CA115498-07 concessão do National Cancer Institute. Esta pesquisa utilizou uma instalação de tecido e patologia de pesquisa apoiado por um subsídio do Instituto Nacional do Câncer (P30 CA047904). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
D, L-sulforafano (SFN), um análogo sintético racémica de derivados de brócolos L-isómero (L-SFN), é um agente quimiopreventivo do cancro altamente promissor com notável actividade em modelos animais pré-clínicos [1], [2]. Talalay e colaboradores foram os primeiros a observar a prevenção de cancro da mama 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno-induzida em ratos por este composto [3]. eficácia quimiopreventivo do câncer de SFN ou L-SFN foi posteriormente alargado a outros modelos de carcinogênese química. Por exemplo, a administração do SFN foi mostrado para suprimir do cólon focos de criptas aberrantes induzidas por azoximetano em ratos [4]. Do mesmo modo, o tratamento do SFN resultou na prevenção de benzo [a] pança do cancro e a inibição da progressão maligna de adenomas do pulmão induzida por carcinogéneo tabaco 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona em ratinhos [5-pireno induzida ], [6]. Estudos mais recentes têm utilizado modelos de camundongos transgênicos para estabelecer a eficácia quimiopreventivo do SFN contra o câncer impulsionado-oncogenes. Por exemplo, a administração dietética de 300 e 600 ppm SFN durante 3 semanas a ApcMin /+ ratinhos resultou na supressão de pólipos no intestino delgado de uma maneira dose-dependente [7]. Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram que a sonda oral de 6 mol SFN (três vezes por semana) a partir das 6-7 semanas de idade incidência significativamente inibido e carga de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) e ou câncer de próstata /bem diferenciado (WD ), bem como a multiplicidade de metástase pulmonar em Transgénicos Adenocarcinoma da próstata de rato (TRAMP) murganhos sem causar quaisquer efeitos secundários [8]. Consistente com estes dados [8], de 8 semanas de idade os ratinhos TRAMP alimentados com 240 mg de rebentos de brócolos /rato /dia apresentaram uma redução significativa no crescimento do tumor da próstata num outro estudo [9]. Além disso, o crescimento de células cancerosas humanas da próstata PC-3 em ratinhos atímicos xenoenxertados macho foi significativamente retardada por meio do tratamento oral com SFN [10]
Devido a resultados promissores em modelos pré-clínicos de roedores [3] -. [8], [10] elucidação do mecanismo de resposta quimiopreventivo cancro subjacente ao SFN tem sido o tema de intensa investigação ao longo da última década. Os mecanismos que contribuem para a quimioprevenção do cancro por SFN incluem: supressão inibição de CYP2E1 [11], a paragem do ciclo celular [12], [13], a indução de apoptose [12], [14], da angiogénese [15], a inibição da desacetilase de histona [16 ], ligação às proteínas [17], a indução de enzimas de fase 2 [18], a repressão epigenética de
hTERT
[19], e inibição da auto-renovação das células-tronco de câncer de mama [20]. Estudos mecanísticos usando células cancerígenas cultivadas também revelaram supressão SFN-mediada de várias vias oncogénicos frequentemente hiperactivas em cancros humanos, incluindo o factor nuclear-kB, o receptor de androgénio, Bcl-2, Bcl-xL, e o transdutor de sinal e activador da transcrição 3 [14 ], [21] – [23]. Enquanto a activação de transdutor de sinal e activador da transcrição 3 confere protecção modesto contra a apoptose induzida por SFN, as espécies de oxigénio reactivas derivadas de mitocôndrias (ROS) fornecer o primeiro sinal de compromisso a apoptose em células cancerosas expostas a este agente [14], [24].
A sinalização Notch tem sido implicado no desenvolvimento e metástase [25] cancro da próstata – [28]. Por exemplo, um estudo realizado com amostras de tumores de 154 homens mostraram sobreexpressão de Jagged-1, ligando de um entalhe, no cancro da próstata metastático, quando comparada com o cancro localizado e doença benigna da próstata [26]. Da mesma forma, Bin Hafeez et ai. [27] encontraram aumento da expressão de Notch1 em cancros da próstata. Além disso, knockdown de
Notch1
invasão inibido de células cancerosas humanas da próstata em associação com a inibição da metaloproteinase-9 (MMP-9) e uroquinase do ativador do plasminogênio [27]. A sub-regulação de Notch1 e o seu ligando Jagged-1 tem sido mostrado para inibir a proliferação de células de cancro da próstata [28]. O presente estudo utilizou células de câncer de próstata humanas em cultura (PC-3, LNCaP e LNCaP-C4-2B) e tecidos da próstata dorsolateral de controlo e ratinhos TRAMP tratados com SFN [8] para determinar o papel de Notch1, Notch2 e Notch4 em efeitos anticancerígenos de SFN.
Resultados
SFN tratamento de aumento dos níveis de Clivadas Notch1, clivados Notch2, e cindiu Notch4 em cultura de células cancerosas humanas da próstata
activação Notch envolve a ligação de o receptor a ligandos conjugados, seguido por uma mudança conformacional dentro da clivagem do receptor Notch e mediada pelo complexo γ-secretase num local situado dentro do domínio transmembranar entalhe [29]. O resultado líquido destas reacções é a libertação do domínio intracelular de Notch para o citoplasma, que, em seguida, transloca-se para o núcleo para regular a expressão do gene alvo [25], [29]. Utilizou-se PC-3 (uma linha celular de cancro humano da próstata independente de androgénios falta p53 funcional), LNCaP (uma linha de células-androgénio humano responsivo cancro da próstata com p53 de tipo selvagem), e LNCaP-C4-2B (uma variante independente de androgénios da linha celular LNCaP) para estudar o papel da sinalização de Notch em efeitos anticancerígenos de SFN. Níveis de Notch1 clivado, clivado Notch2, e as proteínas foram clivados Notch4 aumentou acentuadamente após o tratamento com SFN em PC-3 (Fig. 1A), LNCaP (Fig. 1B), e as células LNCaP-C4-2B (Fig. 1C), embora com diferentes cinéticas. Por exemplo, ao contrário das células LNCaP (Fig. 1B), a clivagem do Notch1 após tratamento com SFN era transiente (aumento da clivagem apenas observados com 8 hora- ponto de tempo) em células PC-3 (Fig. 1A). A base molecular para diferenças específicas da linha celular na activação de Notch por SFN não é clara, mas por activação Notch SFN foi acompanhada por uma diminuição nos níveis de Notch1 de comprimento completo, Notch2, e Notch4 em cada linha de células, especialmente no 16 e pontos de tempo de 24 horas (Fig. 1A-C). Notavelmente, Notch2 foi geralmente mais sensíveis à clivagem por SFN comparação com Notch1 ou Notch4 (Fig. 1A-C). Colectivamente, estes resultados indicaram que o tratamento SFN resultou na clivagem de Notch1, Notch2, e Notch4 em ambas as células de cancro da próstata humano e independente de androgénio-responsivo-andrógenos.
imunotransferência para clivada de comprimento completo e de Notch1, Notch2, e Notch4 usando lisados a partir de (A), PC-3, (B) LNCaP e (C) células LNCaP-C4-2B após o tratamento de 8, 16, ou 24 horas, com DMSO ou SFN (10 ou 20 fiM). As manchas foram retirados e re-sondadas com anticorpo anti-actina como um controlo de carga. Imunotransferência para cada proteína foi feita pelo menos duas vezes, utilizando lisados preparados independentemente. Números acima de banda representam mudanças nos níveis de proteína em relação ao correspondente controlo tratado com DMSO.
Efeitos de ocorrência natural Análogos de SFN em Notch Activation no PC-3 e LNCaP
utilizado de ocorrência natural tio-, sulfinil-, e sulfonil-análogos de SFN com comprimento da cadeia alquilo diferente (Fig. 2A) para determinar se a activação de Notch foi única para SFN. exposição de oito horas de PC-3 (Fig. 2B) e células LNCaP (Fig. 2C) de tio- (Iberverin, Erucin, e Berteroin) sulfinilo e análogos de (Iberin e Alyssin) resultou na clivagem de Notch1 e Notch2 (Fig . 2B, C). Além disso, os tio- e sulf inil análogos eram relativamente mais potente em causar a clivagem de Notch1 e Notch2 em comparação com análogos sulfonil-(Cheirolin, Erysolin, e Alyssin sulfona) em ambos os PC-3 (Fig. 2B) e células LNCaP (Fig . 2C). Surpreendentemente, os níveis de Notch4 clivados foram diminuídos em graus variáveis, por tratamento com tio- e sulfinilo-análogos, mas não sulfonil-análogos em ambas as linhas celulares. Colectivamente, estes resultados indicaram que os que ocorrem naturalmente, análogos tio–sulfinilo e do SFN foram eficazes em causar a clivagem de Notch1 e Notch2. Por outro lado, a activação Notch4 parece única para SFN.
(A) Os nomes químicos, nomes comuns e fórmulas químicas dos análogos utilizados no presente estudo. Imunotransferência para clivado Notch1, Notch2, e Notch4 usando lisados a partir de células LNCaP (B) PC-3, e (C), após o tratamento de 8 horas com DMSO ou análogos diferentes (10 ou 20 uM). As manchas foram retirados e re-sondadas com anticorpo anti-actina como um controlo de carga. Imunotransferência para cada proteína foi feita pelo menos duas vezes, utilizando lisados preparados independentemente. Números acima de banda representam mudanças nos níveis de proteína em relação ao controlo tratado com DMSO.
Efeito do SFN Tratamento em transcricional Atividade de Notch
Nós procedemos para testar se a clivagem de Notch1 SFN mediada , Notch2, e Notch4 foi acompanhado por activação da transcrição de Notch utilizando ensaios de repórter de luciferase. O [fator 1 /supressor de proteína C de ligação da calvo /Lag1 (CBF1 /Su (H) /Lag 1)] RBP-Jk é um modulador jusante direta da sinalização Notch [25], [29]. A exposição de células PC-3 e LNCaP de 20 uM SFN para 8 e /ou 24 horas resultou num aumento estatisticamente significativo na actividade repórter da luciferase RBP-Jk (Fig. 3A). Consistente com estes resultados, os níveis de HES-1 nuclear, um alvo a jusante de Notch, foram aumentadas por tratamento de 24 horas das células PC-3 e LNCaP com SFN em comparação com dimetil sulfóxido (DMSO), as células de controlo (Fig tenha sido tratada com. 3B ). A actividade luciferase associada a genes alvo Notch
HES-1A /B Comprar e
HEY-1