Abstract

Em nosso corpo, as células são continuamente expostos a forças físicas que podem regular diferentes funções celulares, como a proliferação celular, diferenciação e morte . Neste trabalho, foram empregados dois diferentes estratégias para mecanicamente as células cancerosas stress. O câncer e populações de células saudáveis ​​foram tratados com tensão mecânica entregue por um micropump (fabricada por nanolithography de raios-X de profundidade) ou por estímulos de ondas de ultra-som. Observou-se uma diminuição da regulação específica de classe Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) I moléculas expressão na membrana de células de cancro em relação a diferentes tipos de células saudáveis ​​(fibroblastos, macrófagos, dendríticas e linfócitos células), estimulando as células com forças na faixa de nano -newton, e pressões entre 1 e 10 bar (1 bar = 100.000 Pascal), dependendo dos dispositivos utilizados. Além disso, a análise de espectroscopia de Raman, depois do tratamento mecânico, no intervalo entre 700-1800 cm

-1, indicou uma variação da concentração relativa de análise de classe I. APC MHC também foi realizado para distinguir células de controlo e em diferentes linhas de células estressadas. Estas alterações fenotípicas induzidas mecânicos aumentar a imunogenicidade do tumor, como revelado pelo aumento da susceptibilidade relacionadas com Natural Killer (NK) reconhecimento citotóxica

Citation:. La Rocca R, Tallerico R, Talib Hassan A, Das G, Tadepally L, Matteucci, M. et al. (2014) estresse mecânico regula negativamente MHC Classe I Expressão do Câncer Humano Membrana Celular. PLoS ONE 9 (12): e111758. doi: 10.1371 /journal.pone.0111758

editor: Laurent Kreplak, da Universidade Dalhousie, Canadá |

Recebido: 17 Abril, 2014; Aceito: 30 de setembro de 2014; Publicação: 26 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 La Rocca et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O trabalho de Ennio Carbone tem sido apoiada por uma tecnologia International Cancer UICC Transferir Fellowship, conceder AIRC-IG 10189 e conceder AIRC 15521. Rossana Tallerico é um Post Doc concedido por bolsas trienais “Luciana Selce” FIRC. Giovanni Cuda foi apoiada por PON01_02834 Prometeo (Ministério da Educação e Investigação) e PONa3_00435 Biomedpark @ UMG (Ministério da Educação e Investigação). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Na natureza, as células são continuamente expostos a estressores biológicos físicas, químicas e. No passado, as mudanças físicas que ocorrem em tecidos patológicos foram tidas em conta pelos médicos como indicadores de diagnóstico valiosos. O stress físico está envolvido na fisiopatologia de várias doenças humanas, tais como a inflamação e cancro. Em ambas as condições, uma alteração no ambiente físico-química da matriz extracelular (ECM) está associado com a patogénese destas doenças. Além disso, as forças físicas desempenhar um papel significativo na progressão metastática. Nos últimos anos, novas ferramentas, tais como microscopia de força atómica, têm sido desenvolvidos para analisar as alterações em células elasticidade relacionadas com as mudanças físicas no compartimento da matriz extracelular [1]. Além disso, para determinar a quantidade de uma célula pode ser deformado, um dispositivo chamado “esticador óptico” foi desenvolvido [2]. Ao contrário de outras ferramentas, a maca óptico baseia-se numa armadilha óptico de feixe duplo [3], [4] em que dois oponente e feixes de laser idênticos armadilha de uma célula no meio. Este método pode ser usado para medir as propriedades elásticas e contrácteis de muitas células, como é conhecido que a capacidade da célula para contrair é muito importante para a migração e proliferação de [5]. Além disso, a elasticidade e a contractilidade de células tumorais diferentes pode mudar com a progressão da doença, com uma maior elasticidade do canceroso em comparação com as células saudáveis ​​[6]. A relação entre a rigidez e tumor ECM transformação foi descrita [7]. Tem sido demonstrado que as forças isométricas mediada por ECM são detectados por integrinas, as quais regulam a fosforilação de quinases mecano-transdutores, como ERK e Rho [8]. foi também demonstrado que o incremento de forças exógenas levar a um aumento da taxa de proliferação celular e induzir alterações fenotípicas de tumor semelhante. Finalmente, o cancro da mama inflamatório é conhecido por exercer uma carga mecânica devido às mudanças de ECM, potencialmente levando a um maior potencial metastático [9].

Nesta base, a hipótese de que o estresse mecânico ou poderia afetar a expressão de antígenos de células ou induzir a expressão de moléculas de stress-inducible como ligantes do receptor NKG2D [10] capazes de citotóxico privilegiada efetoras linfócitos funções celulares.

nos últimos anos, a descoberta de imunorreceptores reconhecendo proteínas induzíveis estresse ampliaram o nosso conhecimento de como o sistema imune é aprontado [11], [12]. Estas observações têm fomentado o nosso interesse em dispositivos de administração de estresse controlados que poderia provocar um tumor fenótipo imunogênica capaz de evocar uma resposta imune, especialmente quando o tumor já foi editada por linfócitos citotóxicos [13].

Células

assassinas naturais são potentes linfócitos citotóxicos capazes de reconhecer as células cancerosas recém-explantados [14] – [16] e para espontaneamente lise certos alvos tumorais [17] – [19]. Eles são regulados por um delicado equilíbrio entre receptores inibitórios, reconhecendo moléculas auto MHC de classe I, e ativação de receptores para moléculas de stress-inducible [20]. células NK têm a capacidade de identificar e matar as células infectadas por vírus e malignas, enquanto poupando células normais. O regulamento células NK foi mal compreendido até o final dos anos 1980, quando o “eu faltando” hipótese foi proposta [21]. De acordo com esta hipótese, a infra-regulação de moléculas MHC classe I durante a infecção viral ou transformação maligna provoca a activação NK.

Aqui nós perguntar se o tratamento de células cancerosas resistentes NK por estresse mecânico poderia fazer pender a balança entre o inibidor e activação de moléculas de tumor que expressam a favor deste último, que conduz à activação da célula NK. Neste trabalho, foram utilizados dois procedimentos diferentes para mecanicamente câncer de stress e as células normais em condições controladas. Foram comparados os efeitos biológicos dos estímulos mecânicos entregues, quer por um dispositivo de engenharia microbomba expressamente para esta finalidade [22], para os entregues por um equipamento de pulsação de ondas de choque. A variação em moléculas MHC de classe I antes e depois do esforço mecânico foi monitorizada tanto por meio de espectroscopia de Raman (em combinação com a análise de componentes principais (PCA)) e por meio de medições citotóxicas. O objetivo final do nosso estudo era entender se as forças mecânicas aplicadas poderia provocar e /ou modular características de células biológicas relevantes, tais como a sua imunogenicidade. Além disso, exploramos a possibilidade de usar adoptively manipulações mecânicas toswitch um fenótipo de resistência das células NK tumor em um um suscetível.

Materiais e Métodos

dispositivo

Micropump

Para entregar estresse mecânico para populações de células tumorais, foi utilizada uma microbomba anteriormente descrito [22] (S1A Fig.) fabricada por meio de litografia ofdeep técnica de raios-X (DXRL) para tratar especificamente as células eucarióticas, sem os destruir. Três milhões de células /ml foram forçadas mecanicamente durante 1 hora a 48 ciclos e a força da pressão máxima aplicada foi de cerca de 10 bares. Isto foi avaliado por medição da prevalência da bomba através da utilização de água como um fluido. Em seguida, as células foram coletadas em tubos de 15 mL e foram analisadas por citometria de fluxo e micro espectroscopia Raman.

ondas de choque dispositivo

As ondas de choque são aplicadas em ortopedia e são ondas acústicas essencialmente com uma mecânica efeito. Quando as ondas de choque passam através de um fluido, criar diferenças de pressão responsáveis ​​pela formação de bolhas de gás (cavitação) que são afectados pelas ondas de choque subsequentes e são deformadas até que a implosão. Fecho assimétrico da bolha provoca a formação de um jato de água “jet stream”. Este fenómeno aumenta ainda mais o efeito mecânico da onda de choque causando micro-lesões cujo tamanho é uma função do número de impulsos e o fluxo de energia. Para o tratamento de linhas de células tumorais foi utilizado o

Swiss Dolorclast dispositivo

(Electro Medical System-EMS, Itália) com um de alta energia peça de mão (S1B Fig.).

As células cancerosas foram cultivadas em placas de Petri e tratada com ondas de choque (500 fotos) aplicando um fluxo de energia de 1 bar. Após o tratamento as células foram recolhidos e analisados, e os dados obtidos foram comparados com os respectivos controlos.

Células isolamento e cultura

Para as experiências de tensão mecânica que utilizaram diferentes tipos de linhas de células. As células primárias Mel 59c, 42a Mel, Mel 42b, 66b Mel, Mel 137.º e Mel 103b foram obtidos a partir de células metastáticas de pele melanoma recém-explantado com poucas passagens in vitro, respectivamente, de pacientes 59, 42, 66, 137 e 103. Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito de acordo com a Declaração de Helsínquia e do Comitê de Ética II, da Universidade de Heidelberg (0.198,3 /2002). dadores saudáveis ​​PBL e células NK purificadas relacionados foram gerados em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade Magna Grécia de Catanzaro (49/2003). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da UMG (49/2003). as células da linha celular de rim humano Carcinoma (293T), linha linfoblastóide B humana de células (IM9), e fibroblastos foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Sangue Periférico Linfócitos (PBL) foram obtidas de doadores saudáveis ​​por Ficoll-Paque (Biochrom AG, Berlim, Alemanha) centrifugação em gradiente de densidade das amostras humanas foram recolhidos em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade Magna Grécia de Catanzaro (49/2003). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 e em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Sigma Aldrich, St. Louis) e penicilina (100 UI /mL) e estreptomicina (100 mg /mL ) (Sigma Aldrich, St. Louis) e foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. Os macrófagos e as células dendríticas (DC) foram obtidos a partir de células mononucleares do sangue. Os macrófagos foram geradas a partir de monócitos aderentes sobre a placa. As células dendríticas (DC) foram estabelecidas a partir de monócitos suplementados durante 7 dias com 50 ng /macrófago /factor de granulócitos ml de estimulação de colónias (GM-CSF) (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA) e 1000 U /ml de IL-4 [23] .

assassinas naturais de purificação de células

células NK foram obtidos como descrito [24]. Resumidamente, os linfócitos NK humanos foram purificados a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), obtidas a partir de dadores saudáveis ​​por Ficoll-Paque centrifugação em gradiente de densidade, utilizando o kit de cela de isolamento NK e Vario MACS para a depleção de células não-NK (Miltenyi Biotec). As células foram ressuspensas em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, 3% de soro humano, penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (100 ug /ml) e foram usadas para o ensaio de citotoxicidade. pureza das células NK foi de pelo menos 95%.

Espectroscopia Raman

microssonda Raman foram animado por perto a laser IR com linha de laser 830 nm à temperatura ambiente (RT) na geometria backscattering através de uma objectiva 100X (

NA

= 0,95) da Leica microscópio (Model – DMLM). Todos os dados foram coletados com uma potência de laser de 70-130 mW. A potência do laser foi sempre escolhidos de tal maneira a evitar quaisquer danos de células. Esta fonte de laser não é esperado para causar qualquer aumento significativo na temperatura da amostra, devido ao coeficiente de absorção extremamente baixa de células a 830 nm. Além disso, as condições de células foram verificadas por meio de imagem óptica antes e depois das medições. Várias células de cada linha celular foram sondadas na gama de 700-1800 cm

-1 medições por mapeamento de pontos, que recolhem vários espectros no local diferente que cobre a superfície da célula inteira. Para cada linha de células 5 células foram escolhidos aleatoriamente para mapeamento ponto. Os espectros de Raman das diferentes células de cada uma das linhas de células foram então recolhidas e utilizadas para análise estatística (Spectra não mostram, significativamente diferentes uns dos outros [25], [26]). A análise estatística (com erro de desvio padrão) foi realizada durante 10 espectros Raman para cada linha celular. É digno de nota que o apontar que as medidas de controlo e de células estressadas de cada linha celular foram realizadas no mesmo dia, para evitar qualquer variação na resposta instrumental. suavização espectral foi realizada para todos os espectros Raman individuais usando o software PS9 WiRE 2.0 fornecido com o espectrômetro Raman Renishaw. O ajuste de curva dos espectros foram realizados utilizando a função de Gauss e Lorentzian combinados.

Análise de Componentes Principais

Na última década técnicas multivariadas têm sido amplamente empregados para análise de grandes conjuntos de dados Raman [27] , [28]. Entre essas técnicas, análise de componentes principais (PCA) tem provado ser uma das mais robustas e confiáveis ​​métodos [29], [30]. Quando PCA é aplicado a espectros Raman, cada freqüência Raman é considerado como uma variável cujo mudanças em todo o espectro gravado valor, de modo que todo o conjunto de dados constitui um

N

espaço dimensional, onde

N

é o número de frequências de medição (

N

é normalmente muito grande). O objetivo principal do PCA é de redução de dimensionalidade sem perda de informação. Isto é conseguido através da diagonalização da matriz de covariância de espectros: os vectores próprios definir unidimensionais (1D) eixos no

N

-espaço e os valores próprios correspondentes expressar a quantidade de variância total explicada por cada vector próprio. Os vectores próprios são os chamados componentes principais (PCs), enquanto que os valores próprios são nomeadas as imagens latentes. O primeiro componente principal é 1D eixo ao longo do qual a maior quantidade de variância é tomado em consideração (isto é, o eixo com o maior valor latente); o segundo componente principal é o eixo (ortogonal para a primeira), o que representa a maior variância residual (isto é, o eixo com o segundo maior latente), e assim por diante para os seguintes componentes. Desta forma, a partir de um

N

-variables conjunto de dados que são reduzidos a um conjunto de dados de algumas variáveis-, sem perder a parte significativa da informação. A análise PCA foi realizada utilizando o software desenvolvido pelo P. Candeloro et al. [31].

imunofluorescência

Após cada tratamento, as células foram recolhidas em tubos e foram incubadas com soro humano durante 15 minutos a RT. Em seguida, as células foram lavadas três vezes em PBS 1X e subsequentemente incubadas durante 30 minutos no escuro a 4 ° C, com os seguintes mAbs: W6 /32 (anti-MHC de classe I, IgG2a; BioLegend, San Diego, CA); clone BAM 195 (anti-MICA, IgG1) e mAb 6D4 (anti-MICA /B, IgG1), foram gentilmente cedidas por Veronika Groh (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA); M295 (anti-ULBP1, IgG1), M310 (anti-ULBP2, IgG1), M550 (anti-ULBP3, IgG3) e M478 (anti-ULBP4, IgG1) foram gentilmente oferecida por D. Cosman, (Amgen Inc. Seattle, WA ); mAb L95 (anti-PVR, IgG1) e mAb L14 (anti-Nectin-2, IgG2a) gentilmente cedido por A. Moretta (Universidade de Génova, Génova, Itália). Após lavagem duas vezes, as células foram coradas com o mAb secundário de cabra FITC anti-rato IgG (Jackson Immuno Research, Baltimore, EUA) durante 30 min a 4 ° C no escuro. Em seguida, as células foram novamente lavadas duas vezes e analisadas por citometria de fluxo FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA, EUA). Para a coloração intracelular, as células foram fixadas e permeabilizadas em Cytofix por Cytoperm (BD Biosciences). As células foram coradas com os mAbs específicos, seguido de anticorpos de IgG conjugado com FITC anti-rato (Jackson Immuno Research, Baltimore, EUA) e foram analisados. Os resultados foram analisados ​​usando celular Quest (BD Biosciences) ou FlowJo software versão 9.3.1.

citotoxicidade ensaio

Para os ensaios de citotoxicidade do tumor ou células saudáveis ​​como alvo e os linfócitos NK como efetoras foram utilizadas células. Após o tratamento de stress mecânico, as células alvo foram incubadas com o CFDA fluorescente (diacetato de carboxifluoresceína, Life Technologies, Nova Iorque, EUA) durante 30 min a 37 ° C, depois lavadas duas vezes e incubadas com as células NK durante três horas em incubadora, a 37 ° C e 5% de CO

2. Os detalhes do protocolo foram descritas a partir McGinnes et al [32]. A citometria de fluxo foi utilizado para analisar as amostras.

Tempo real

Total de RNAs celulares de quatro células de melanoma primário diferentes e duas células saudáveis ​​foram isolados usando Trizol (Life Technologies).

Resumidamente, 1 ug de RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de Transcrição reversa Superscript III (Life Technologies) de acordo com as recomendações do fabricante; os ADNc foram amplificados usando iTaq Universal Syber verde Supermix (BioRad, Segrate (MI), Itália), na presença de iniciadores específicos, tal como descrito anteriormente [33]. Foram utilizados os seguintes iniciadores: MHC-I-FW, 5′-CCTTGTGTGGGACTGAGAGG -3; MHC-I-RV, 5′- CAGAGATGGAGACACCTCAGC -3 ‘. A expressão do gene de manutenção da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi utilizado para normalizar as amostras, e a quantificação relativa de HLA de classe I foi realizada aplicando o 2

-ΔΔCt método de [34]. Foram utilizados os seguintes iniciadores: GAPDH-FW, 5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3 ‘, GAPDH-RV 5′-TCACGCCACAGTTTCCCGGA -3’

Western Blotting

A secreção de moléculas MHC classe I. no meio condicionado foi confirmada por análise de Western blot. Para transferência de Western, as células cultivadas em pratos de 100 cm foram lavados com solução salina 0,1 M tamponada com fosfato (pH 7,4) (Life Technologies) e, depois disso, foi adicionado 2 mL de meio RPMI isento de soro. Após o tratamento de stress, o meio foi colhido. Células concentração de proteínas médio para cada estressadas amostra foi medida em triplicado utilizando a proteína de ligação de corante (Bio-Rad) com albumina de soro humano (Life Technologies) como curva padrão.

Para cada ponto experimental, 50 ug de célula -cultura proteínas do meio foram transferidos para tubos estéreis contendo acetona fria (20%, w /v) e precipitado durante 30 minutos em gelo, seguido por centrifugação a 15000 rpm durante 15 min a 4 ° C.

O sobrenadante foi decantado, e o sedimento foi lavado com acetona arrefecida seguido pela remoção de toda a acetona. O sedimento foi posteriormente solubilizado em LB [31,25 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 1,25% de SDS, 6,25% de glicerol, 0,06% azul de bromofenol, e 5% de H-mercaptoetanol], resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose.

Após a adição da mistura de bloqueamento [5% (w /v) de leite em PBS (pH 7,4) e 0,05% de Tween 20], a membrana foi incubada com uma diluição de ratinho anti 1:100 anticorpo -HLA, clone de W6 /32 (BioLegend,). O sinal foi detectado com anticorpo anti-ratinho-peroxidase de rábano conjugado secundário (1:5000; Santa Cruz Biotechnology). A membrana foi desenvolvida por reagentes de detecção de quimioluminescência-blot ocidental melhoradas de acordo com as instruções do fabricante (Santa Cruz Biotechnology).

A membrana foi incubada com a solução de coloração com vermelho de Ponceau S (Sigma-Aldrich) para garantir um carregamento de gel uniforme. Um controlo interno não foi usada porque é basicamente impossível encontrar uma proteína de “housekeeping”, nas células de meio de soro livre que poderia ser usado como uma referência constante. Ponceau S pode ser usado com vantagem sobre a detecção de actina para a qualidade ou o controlo de carga igual em Western blot; Além disso, ele tem uma vantagem adicional, ou seja, que não depende de uma única proteína de normalização ou controlo de carga. Isto evita a possibilidade de que as proteínas de “limpeza” utilizados para esta finalidade pode na verdade variar em algumas condições ou que estão saturados na níveis de carregamento necessário para a detecção de produtos de baixo de expressão ou que não são detectáveis, como no nosso exemplo [35 ].

ATM /ATR sinalização análise cascata

o etoposido (Sigma, St. Louis, MO, EUA) foi dissolvido em DMSO e adicionado à concentração final de 5 uM durante 1 h. Os lisados ​​celulares totais foram preparados a partir de células recolhidas de fresco, utilizando um tampão de lise (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, EDTA 10 mM, 0,5% de Nonidet P-40, NaCl 400 mM) suplementado com uma mistura de inibidor de protease (Calbiochem, Merck Darmstadt , Alemanha), PMSF 0,5 mM e ortovanadato de sódio 2 mM. Os lisados ​​foram incubados em gelo durante 15 minutos e centrifugou-se a 13000 rpm durante 10 min. A concentração de proteína dos sobrenadantes foi determinada por ensaio Biorad (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA). Para imunomanchas, as amostras foram carregadas em tampão de Laemmli em 6% ou 10% de Tris-glicina géis de SDS /PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e hibridados com anticorpos apropriados em 1:1000 diluição. As manchas foram desenvolvidos por quimioluminescência aumentada (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemanha). Anticorpos: anti-rato phosphoAtm (Ser 1981) de coelho anti-phosphoChk1 (Ser 345), de coelho anti-phosphoChk2 (Thr 387), de coelho anti-fosfo JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling, Nova Iorque, NY, EUA), coelho anti -p53 e rato anti-MCM7 (Santa Cruz).

a análise estatística

Todos os resultados foram relatados como média ± SEM. O nível de significância foi determinada pelo teste de Mann – Whitney. Um valor * p ≤ 0,05, ** p≤0,001 e p≤0,0001 **** foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram expressos como o respeito a mudança vezes ao controle, definido como 1.

Resultados

Para entender os efeitos potenciais de estresse mecânico sobre a imunogenicidade de células, o câncer e as células saudáveis ​​foram stress mecânico com um micropump dispositivo e choque ondas.

as mudanças induzidas pelo estresse entregou-micropump foram analisados ​​por espectroscopia Raman. medidas Raman foram realizados para as respectivas células (Mel 59c, 42a Mel, Mel 103a e 293 linha de células T) em solução PBS na faixa espectral entre 700-1800 cm

-1. Os espectros de Raman com barras de erro o desvio padrão para as células de controlo (sem stress) e células estressadas mecanicamente em solução tampão PBS são mostrados na Fig. 1. Os espectros de Raman de essas células são similares aos espectros de Raman característica da maioria das células vivas. Todos os espectros mostram diferentes picos a cerca de 780, 850, 1003, 1125, 1445 e 1660 cm

-1. bandas típicas nestes espectros (Fig. 1) estão associados à conformação de nucleotídeos (600-800 cm

-1), de geometria molecular esqueleto e vibrações relacionadas com fosfato (800-1200 cm

-1), nucleotídeos ( 1200-1600 cm

-1) e CC e CH

x modos devido a proteínas e lipídios [36]. As vibrações de amida, tais como a amida I-band (devido a C = O alongamento, 1650-1700 cm

-1) e amida III banda (devido a CN alongamento, e NH dobra, cerca de 1250 cm

– 1) em proteínas são facilmente distinguíveis [37]. A amida I bandas na faixa entre 1650-1700 cm

-1 dar também informações muito importantes sobre o status de confirmação da estrutura secundária (α-hélice, β-folha e estrutura espiral aleatória) das proteínas. aminoácidos diferentes pode ser reconhecido explicitamente a cerca de 1003, 1011 e 1032 cm

-1 no espectro de Raman [37].

Raman para o controle e salientou linhas celulares de cancro (Mel 59c (A), Mel 42a (B), Mel 103b (C) e 293T (D)) com barra de erro desvio padrão. Os espectros foram realizados antes e após o estresse mecânico com micropump.

A variação da concentração relativa de proteína em células diferentes foi calculada usando encaixe dessas duas regiões de bandas de proteínas em cerca de 1440 e 1650 cm

-1. FIG. 2 mostra, para vários tipos de células, a variação na intensidade relativa da membrana celular de proteína /lípido (1440 cm

-1) e α-hélice (1650 cm

-1) banda antes e depois da aplicação de tensão mecânica . Observou-se uma clara diminuição da quantidade de proteína e estrutura secundária a sua α-hélice mediante tratamento com células estresse mecânico.

Área Normalizado de banda centrado em torno de 1440 (em cima) e 1670 cm

-1 (para baixo) para todas as linhas celulares, mostrando a variação da concentração de proteína e teor de α-hélice relativa sobre a superfície da célula.

Uma imagem muito clara pode ser revelado a partir da variação da estrutura secundária depois de empregar estresse mecânico. Ela mostra a redução da estrutura secundária α-hélice de banda de Amida I para todas as células, com o esforço mecânico. Esta tendência não é claramente observado na Mel 42a células para as quais o espectro é muito barulhento (Fig. 1B). Além disso, na análise profunda, verificou-se que o 59C Mel e 293 células T se comportam de maneira semelhante. Todas as linhas celulares investigadas mostram uma estrutura secundária em diminuir o esforço mecânico. A têmpera da estrutura α-hélice e um aumento da fluorescência de fundo bem como pode ser claramente observado. Estas alterações nos espectros Raman são consistentes com a nossa relatado anteriormente conclusões sobre a detecção de MHC de classe I por espectroscopia Raman [38].

Além disso, Análise de Componentes Principais (PCA) é realizada para discriminar a estressado para controlar células de cada linhas celulares. APC, uma análise estatística, reduz a dimensionalidade do conjunto de dados multi-dimensional, mantendo a característica de todos os espectros [31]. Os pontos de dimensões reduzidas de cada espectro é descrito por um número limitado de variáveis, chamados componentes principais (PCs). Estes PCs incorporar a maior parte da informação espectral. FIG. 3 representa a análise PCA (PC1 versus PC2, PC2 vs. PC3 e PC1 vs. PC3) de todas as linhas de células na faixa de 700-1800 cm

-1. Os blocos cheios são para células de controlo enquanto que os blocos vazios estão associados ao estresse células. As células de stress pode ser bem distinguidas das células de controlo e ainda mais cada linhas celulares podem ser encontrados em-agrupados de forma clara na Figura. Estes resultados revelam uma maneira interessante e importante distinguir entre as células e também se as células foram perturbadas externamente

A análise PCA em células de controlo e de estresse para várias linhas celulares.; Mel 42a, 59c Mel, Mel 103b e 293T. a) PC1 PC2, b) PC2 vs. PC3 e c) PC1 PC3 vs. vs..

Para confirmar que o estresse mecânico induz uma regulação do MHC classe I nas células da superfície , foi realizado um ensaio imunofenotipagem para todos os diferentes tipos de células.

Depois de um tratamento de alimentação 1 bar, foi observada por ondas mICROPUMP e de choque, uma redução clara de MHC classe I níveis na membrana das células tumorais (Fig. 4A), enquanto nenhuma alteração foi observada quando as células as células saudáveis, de fibroblastos, macrófagos, dendríticas e linfócitos, foram sublinhados (Fig. 4B). As análises estatísticas foram realizadas em células tumorais (melanoma e células IM9 linhas, Fig. 4C) e células saudáveis ​​(fibroblastos, macrófagos, células dendríticas e os linfócitos, Fig. 4D).

O painel A mostra a diminuição do MHC moléculas de classe I de expressão em células de cancro (5 melanoma e uma linhas de células linfoblastóides) após o tratamento com o stress mecânico, por meio da microbomba (parte superior) e as ondas de choque (parte inferior) em comparação com células não tratadas. O painel B indica o efeito da tensão mecânica em algumas células saudáveis ​​(fibroblastos e macrófagos) de MHC de classe I com os dois tratamentos mencionados. O controle isotópica relacionados MFI deu o mesmo sinal de sobreposição para todas as linhas celulares utilizadas, portanto, ter sido omitidos. O painel C representa os valores estatísticos de diminuição dobra do MHC-I realizada em células de melanoma (n = 4 experiência separada com microbomba e n = 4 experiência separada com ondas de choque; 0,05; p p 0,0001). A diminuição dobra do CPH-I foi derivado a partir da intensidade média de fluorescência (IMF) de moléculas de CPH-I antes e após o tratamento de linhas celulares de melanoma e IM9. O painel D mostra os valores estatísticos obtidos experiência diferente (n = 3) para cada tipo de células saudáveis. Os fibroblastos e as PBLs foram destacadas com a microbomba enquanto, os macrófagos e as células dendríticas foram tratados com ondas de choque. O valor informado no painel D não é estatisticamente significativa.

As outras moléculas imunogénicas analisados, tais como MICA, MICB, ULBPs, PVR e Nectin-2, não mostraram alterações significativas entre o controle e as células salientou com ondas de choque (S2 Fig.). Para compreender o efeito da expressão de MHC classe I na diminuição da imunogenicidade salientou mecanicamente células tumorais, ensaios funcionais foram realizados utilizando ambos os dispositivos de ondas, Micropump e choque. Nisto, a células NK susceptibilidade das células tumorais alvo estresse mecânico foi comparada com os seus controlos não esforçados por ensaios de citotoxicidade clássicos. Um aumento clara e reproduzível na susceptibilidade NK foi observada após o tratamento estresse mecânico. A gama de aumento da percentagem de lise NK em células tumorais foi entre 30-70% (Fig. 5A-E), enquanto que as células saudáveis, isto é, de fibroblastos (Fig. 5F), não respondem ao tratamento de stress mecânico. Os resultados mostram que o stress mecânico melhorar o reconhecimento NK para tumor com significância estatística (Fig. 5G-H), mas não para as células saudáveis. O esforço mecânico muda o fenótipo tumoral de ser resistentes a NK NK susceptíveis. Esta mudança no NK susceptibilidade correlaciona-se com a perda de I tumor específico MHC-classe. As moléculas de MHC de classe I são os ligandos inibidores mais potentes para os receptores de NK. O MHC de classe I a regulação negativa sobre células tumorais desencadear a resposta NK em conformidade com a “falta de auto hipótese” [21]. Os dados aqui obtidos indicam que um derramamento de MHC-I ocorre depois de esforço mecânico da superfície celular do tumor, este não é o caso para as células saudáveis. Nossa descoberta indica um efeito imunologicamente relevantes do estresse mecânico sobre a susceptibilidade do tumor para atacar citotóxica

reconhecimento de células NK de alvos celulares de tumores diferentes em diferentes E /T (efector /alvo) ratio:. 59c, 42a, 66b ( de células de melanoma linhas), 293T (carcinoma renal) e IM9 (linhas lymphoblastoidcell) antes de (cinza) e depois (preto) estresse mecânico. O Mel 42a, 66b Mel, as células de fibroblastos (painéis B, E e F) foram tratados com o micropump, o 59c Mel, IM9, 293 T células (painéis A, C e D) foram estressado com as ondas de choque. Como células alvo saudáveis, neste caso, são mostrados os fibroblastos. experiências representativas são relatados para cada tipo de célula. Os painéis G e H mostram as estatísticas derivadas a partir de três ensaios funcionais diferentes, utilizando linfócitos NK como células efectoras (E) e as células IM9 e melanoma como alvos (t). As células alvo IM9 foram tratados com as ondas de choque (painel G: n = 3, p = 0,0325), enquanto que as células-alvo de melanoma foram destacadas com a microbomba (painel H, n = 3, p = 0,0186). Razão E /T de 12/1, p . 0,05

O aumento da citotoxicidade celular observada em ensaios clássicos de citotoxicidade NK não foi devido a morte de células alvo passivo induzida por tratamentos de stress mecânico, mas sim por NK ativa células programa citolítico como testemunhado pela redução das células alvo estresse mecânico matando depois de ativar receptores bloqueio da célula NK.

em seguida, investigamos o mecanismo pelo qual o estresse mecânico, induzida, quer com a micropump que, com ondas de choque, pode levar a MHC classe I para baixo regulamentação.

Fig.