Abstract

Fundo

Paciente derivado xenotransplantes (PDXs) para câncer de cabeça e pescoço (CCP ) e outros cânceres representam plataformas de pesquisa poderosos. A maioria dos grupos implante de tecido do paciente em ratinhos imunodeficientes imediatamente, embora o significado deste intervalo de tempo é anedótica. Nós testamos a hipótese de que o tempo entre a retirada do tumor da implantação é crucial para PDX passaging e de estabelecimento.

Métodos

examinamos se tempo ou meio de armazenamento afetados viabilidade PDX para passaging duas estabelecida HNC PDXs ( UW-SCC34, UW-SCC52). Os tumores foram colhidos, armazenado em meios gelada ou solução salina durante 0-48 horas, e implantado em ratos novos. O crescimento do tumor foi comparado por ANOVA de duas vias com respeito ao tempo e condições de armazenamento. Três novos PDXs HNC (UW-SCC63-65) foram gerados através da implantação de tecido do paciente em ratos imediatamente (tempo 0) e 24 horas depois de receber o tecido da sala de cirurgia.

Resultados

quantidades similares de tumor foram implantadas em cada ratinho. No final do experimento, não foi observada diferença significativa no peso médio do tumor entre a mídia e as condições de armazenamento solução salina para UW-SCC34 ou UW-SCC52 (p = 0,650 e p = 0,177, respectivamente). Não houve diferença na prevalência formação do tumor foi visto em função do tempo desde a colheita até implante (≥13 de 16 tumores cresceram em cada ponto de tempo). A análise histológica mostrou forte semelhança com o tumor inicial em todos os grupos. Desenvolveram tumores em ambos tempo 0 e 24 horas para UW-SCC63 e UW-SCC64.

Conclusões

Nós demonstramos que nenhum meio de armazenamento nem o tempo de retirada do tumor para implantação (até 48 horas) viabilidade afetado ou diferenciação histológica em uma passagem posterior para dois HNC PDXs. Além disso, revelou que o tecido fresco paciente é viável até 24 horas após a ressecção. Esta informação é importante, uma vez que se aplica ao desenvolvimento e partilha de PDXs

Citation:. Stein AP, Saha S, Liu CZ, Hartig GK, Lambert PF, Kimple RJ (2014) Influência das condições de manuseamento sobre o Estabelecimento e paciente Propagação de Cabeça e Pescoço Cancer xenoenxertos Derivado. PLoS ONE 9 (6): e100995. doi: 10.1371 /journal.pone.0100995

editor: Jay F. Dorsey, University of Pennsylvania, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Março, 2014; Aceito: 02 de junho de 2014; Publicação: 26 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Stein et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo R00 CA160639 (RK), UWCCC e UWCCC /MIR /WID verbas institucionais (PL), e um ICTR- UW Shapiro comunhão (AS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Um modelo bem estabelecido, mas agora re-emergente para câncer humano é o sistema paciente xenoenxerto derivado (PDX). PDXs são desenvolvidos através da obtenção de amostras de tumores directamente a partir de pacientes e, subsequentemente, a implantação e passaging estes tumores em ratinhos imunodeficientes [1]. O processo foi documentada pela primeira vez em 1969, quando Rygaard e Povlsen injectada uma suspensão de células tumorais de um paciente com cancro do cólon subcutaneamente em ratinhos nus atímicos e ratinhos de controlo [2]. Eles demonstraram maior o crescimento do tumor em ratinhos atímicos quando comparados com o controle, que conduz à utilização de ratinhos imunodeficientes tornando-se prática comum para o desenvolvimento PDX [3]. Recentemente, PDXs ter sido gerado para um certo número de cancros, incluindo pâncreas [4] – [6], da mama [7], do pulmão [8], [9], renal [10] e da cabeça e pescoço [1], [11] . Estes estudos mostraram que PDXs reter características do tumor primário através de passagens em série tanto no histológica [7], [8] e moleculares [1], [7], [11] níveis. Daniel et al. também demonstraram que a sua principal PDX pequenas do cancro do pulmão de células (apenas passados ​​em ratinhos) retida uma maior semelhança com o tumor do paciente, em comparação com uma linha de células geradas a partir do mesmo PDX [9]. Além disso, o nosso grupo [1] e outros [12] têm PDXs com sucesso criopreservados e reanimados em um momento posterior, aumentando a utilidade deste sistema modelo. Assim, PDXs representam um modelo validado e confiável para o estudo de uma variedade de cancros humanos.

A utilização poderosa para PDXs é o teste de tratamentos padrão e inovadoras em um

in vivo

sistema com maior heterogeneidade de modelos de ratos geneticamente modificados e um microambiente tumoral mais relevante do que linhas de células [1], [4], [11]. Uma vez estabelecida, PDXs são amplificados

in vivo

, injetado em vários ratos e os ratos são subsequentemente estratificados em diferentes grupos de tratamento. A capacidade de um regime de tratamento específico para retardar ou parar o crescimento do tumor pode ser avaliada comparando o crescimento significativo do tumor ao longo do tempo para cada grupo, em comparação com ratinhos de controlo (não tratadas). Desta forma, os investigadores podem avaliar o efeito de muitas terapias alternativas em um tipo específico de tumor derivadas de um único paciente. Além disso, alterações moleculares induzidos pelos diferentes tratamentos pode ser analisada por colheita de amostras de tumor de pós-tratamento, quer por Flash pedaços de tumor de congelação em azoto líquido durante genoma estudos de largura fixa ou tumores em formalina, seguido por inclusão em parafina para análise biomarcador. Também foi argumentado que este sistema modelo poderia ser empregado na terapia do câncer personalizado, gerando PDXs de câncer de um paciente, testando uma variedade de quimioterápicos em ratos portadores de seu tumor e, em seguida, selecionando um novo regime de tratamento para o paciente com base nestes

in vivo

resultados [13].

Há uma série de variações nos procedimentos utilizados para estabelecer PDXs. Por exemplo, alguns grupos descrevem a implantação cirúrgica de pedaços pequenos (2-3 mm) de tumor nos flancos [14], enquanto outros mediu os tumores para criar uma suspensão de células e injectar a suspensão por via subcutânea através de uma agulha de calibre grande [15]. Além disso, certos grupos só usam ratos nus atímicos [3], outros usam não-obesos imunodeficiência combinada grave diabético (NOD-SCID) [7] e alguns empregam ambas as estirpes [1]. Significativamente, estas técnicas diferentes foram todos levou a um crescimento tumoral de sucesso. Outro tema recorrente que surge no desenvolvimento de PDX é que os tumores são tomadas tão rapidamente quanto possível (no máximo dentro de 3 horas) a partir do momento da biopsia e depois injectado nos ratinhos imunodeficientes [1], [2], [8], [10 ], [16]. O nosso grupo e outros proceder desta maneira devido à crença de que o tempo de retirada do tumor de xenoenxerto de implantação é importante. No entanto, não há nenhuma informação na literatura que sugiram que os pedaços de tumor deve ser injectada /implantado o mais rapidamente possível para os ratinhos [17]. Além disso, apesar do mouse-to-rato passagem é normalmente realizada o mais rapidamente possível, há novamente, poucos dados para apoiar a necessidade desta prática.

Devido à incerteza sobre técnicas de colheita e implante ótimo, nós empreendeu este estudo para determinar se houve uma relação do potencial de crescimento da PDX com base no atraso de tempo de excisão do tumor inicial para a sua implantação nos ratinhos final. Além disso, buscou-se determinar se o meio de armazenamento utilizado durante o atraso de processamento afetados viabilidade PDX. Este trabalho é importante, pois há uma série de fatores fora do controle do pesquisador que podem influenciar a capacidade de obter biópsias de tumores de pacientes consentiram em tempo hábil. Além disso, uma vez PDXs são estabelecidos, re-implantação requer a disponibilidade de ratinhos receptores e sua disseminação para outros laboratórios podem exigir o envio. Ambos os problemas podem levar a atrasos na re-implantação. Os nossos resultados demonstram que o tumor é ainda viável e capaz de crescer na próxima geração de ratinhos com até pelo menos 48 horas após a excisão do tumor inicial e que a natureza da solução de armazenamento, seja o meio de cultura de tecidos ou solução salina, não tem nenhum efeito no crescimento de tumor. Além disso, revelou que o tecido fresco paciente da sala de operações (OR) é viável e pode ser utilizado para estabelecer uma nova PDX-se a pelo menos 24 horas após a excisão inicial do paciente. A capacidade de adiar a implantação do tumor tem implicações importantes no que diz respeito à partilha desses recursos, bem como a logística de estabelecimento inicial PDX e posterior manutenção.

Materiais e Métodos

Mice

masculino seis a oito semanas de idade e do sexo feminino gamma NOD-SCID (NSG, NOD.Cg-

Prkdc

scid IL2RG

tm1Wjl

/SZJ) ratos (comprado de Jackson Laboratories) foram utilizados para PDX desenvolvimento e amplificação. Todos os ratos foram mantidos na Associação de Avaliação e Acreditação do Instituto de Wisconsin Animais de Laboratório Cuidados-aprovado para Facilidade de Investigação Médica (WIMR) Animal Care. Os animais foram alojados em quartos livres de patógenos específicos, e eles viviam em autoclavados, assépticas, e gaiolas microisolator com um máximo de quatro animais por gaiola. Comida e água foram fornecidos ad libitum. Todos os estudos com os ratos foram realizadas de acordo com um protocolo aprovado pelo animais da Universidade de Wisconsin (número de protocolo: M02518). Durante os experimentos, peso e clínica de saúde de cada rato foram avaliados em uma base semanal.

previamente estabelecido Paciente Derivado xenoenxertos

Nossos PDXs foram derivadas de pacientes com diagnóstico recente ou câncer de cabeça e pescoço recorrente ( HNC), que completou um consentimento por escrito de acordo com uma aprovação IRB, da Universidade de Wisconsin. Nós previamente descrito o estabelecimento de nosso modelo PDX em maior detalhe [1]. Como amostras de tumores do OR muitas vezes fornecem o tecido apenas o suficiente para a implantação em duas a quatro ratinhos, os principais estudos descritos neste manuscrito utilizada PDXs estabelecida em uma passagem antecipada. Passaging e implantação de PDXs foi realizado pela primeira colheita de tumores de ratinhos portadores de tumor NSG de interesse, a transferência do tumor de uma forma estéril para um tubo de Eppendorf de 2,0 mL com uma mistura de 01:01 de meios de comunicação (Modified Eagle Médium da Dulbecco com 10% de fetal de soro de bovino, 1% de penicilina /estreptomicina e 2,5 ug /mL de anfotericina B) e Matrigel (catálogo # 354230, BD Biosciences, Inc) e picagem do tumor em menos de 1 mm

3 peças. Finalmente, a suspensão do tumor foi arrastado para uma seringa de 1 mL por meio de uma agulha de calibre 18 e injectadas subcutaneamente em dois flancos de ratinhos NSG.

Experimental Design by

Dois PDXs que demonstraram um crescimento sustentado no início foram selecionados passagens (UW-SCC34 e UW-SCC52) para esta experiência. O processo foi realizado separadamente para os grupos UW-SCC34 e UW-SCC52, mas um protocolo idêntico foi seguido ambas as vezes. Em primeiro lugar, quatro ratos do NSG que carregam dois tumores cada um do PDX de interesse foram sacrificados, e um temporizador foi iniciado quando a morte foi confirmada. Todos os tumores foram colhidos de quatro ratos ao mesmo tempo. pedaços de tumor reunidas foram pesados ​​e divididos igualmente entre catorze 2,0 mL tubos de eppendorf pré-condicionado no gelo: sete meios contendo e sete com solução salina. Além disso, um pedaço do tumor (referido como a amostra de pré-implantação) foi fixado em 10% de formalina tamponada neutra por 48 horas e embebido em parafina para análise histológica mais tarde. Em seguida, um tubo de media + de tumor e um tubo de solução salina + tumor foram removidos a partir do gelo. Cada pedaço do tumor foi transferido para o seu próprio, novo tubo com uma mistura 01:01 de meios frescos e matrigel, picadas em 1 mm

3 peças, e injetadas em quatro flancos de dois ratos do NSG (n = 8). O tempo foi gravado depois que todos os quatro camundongos foram injetados (Tempo 0, 40 minutos). Desta forma, acabamos com dois grupos neste momento tempo: “Time 0 mídia” e “Time 0 Saline”. Ambos os grupos foram constituídos por dois ratos NSG cada um com quatro locais de injecção. Assim, cada grupo tinha o potencial para desenvolver oito tumores (Figura 1). Este processo foi repetido com 1, 2, 4, 8, 24, e 48 horas após o temporizador foi iniciado. Nesse ínterim, os tumores nos meios de comunicação ou solução salina foram mantidos a 4 ° C.

Diagrama que descreve a configuração experimental.

Os tumores foram deixados crescer durante 3 semanas para UW- SCC34 e 6 semanas para UW-SCC52. A duração do crescimento do tumor foi ditada pela cinética de crescimento do tumor e da saúde dos ratos. No final de cada experiência, os tumores a partir de cada ratinho foram colhidos, pesados ​​e os tumores colhidos fotografado (1 e 2 dias mais tarde para os grupos de 24 horas e 48 horas, respectivamente). Cada tumor foi fixada em 10% de formalina tamponada neutra por 48 horas e, em seguida, embebidas em parafina. Um tumor foi selecionado aleatoriamente a partir de cada um dos catorze grupos para posterior análise histológica

Histologia

blocos de tumor foram seccionados (5 mm) e hematoxilina e eosina (H E). Manchas foram realizadas em cada quinta secção. Todas as lâminas foram fotografadas num microscópio Olympus BX51 (Olympus America, Inc). Foram feitas comparações entre a histologia da amostra pré-implantação e os tumores cultivados na próxima geração de camundongos NSG. A similaridade na histologia de tumores em toda a catorze grupos diferentes dentro das duas experiências foi também avaliada. Um patologista placa certificada especializado em doenças da cabeça e pescoço (CZL) realizada a análise histológica para definir a diferenciação, queratinização, necrose /mudança cística e padrão infiltrativo para cada tumor.

novo paciente Derivado xenoenxertos

uma vez que determinou que nem o tempo de excisão de re-implantação, nem meio de armazenamento afetou o crescimento PDX em uma passagem posterior, foi realizada uma variação desse experimento utilizando tecido fresco paciente da OR. Três novos pacientes com HNC foram consentido a doar tecidos para o estabelecimento PDX (UW-SCC63, UW-SCC64, UW-SCC65). Devido à pequena quantidade de tumor que recebemos do OR, só poderia haver dois grupos para estas experiências. Portanto, nós nos concentramos no fator tempo para estabelecimento inicial PDX. Quando recebemos o tecido fresco paciente, foi pesado e distribuído uniformemente em dois tubos com a mídia. Para um tubo, de matrigel foi adicionado imediatamente e o tumor foi picado e injectados em quatro flancos de dois ratos (n = NSG 8, tempo 0). O outro tubo (com o tumor e a media) foi armazenado a 4 ° C durante 24 horas. Em seguida, o tumor foi transferida para um novo tubo com meios frescos e Matrigel, e o tumor foi picado e injectados em quatro sítios de dois ratinhos NSG (n = 8, 24 horas). Este mesmo processo foi repetido para todos os três novas amostras de doentes.

Depois de nove semanas, o crescimento do tumor foi avaliada e comparada entre o tempo 0 e 24 grupos hora para cada nova PDX. Apenas UW-SCC64 tinham tumores em um tamanho adequado para passaging. Portanto, todos os ratinhos na experiência UW-SCC64 foram sacrificados e os tumores foram excisados, pesados ​​e fotografado (tumores colhidas um dia mais tarde para o grupo de 24 horas). Para UW-SCC63 e UW-SCC65, os ratos foram apalpados para o crescimento do tumor em cada local da injeção.

Análise Estatística

Nós alimentado este estudo para detectar uma diferença na viabilidade PDX entre o primeiro eo último pontos de tempo (tempo 0 e 48 horas, respectivamente). Não existe qualquer informação na literatura sobre o efeito do tempo sobre a viabilidade PDX e crescimento, por isso, não tem qualquer informação para guiar a nossa estimativa para a diferença que esperava ver entre esses grupos. Portanto, estimou-se conservativamente haveria uma diminuição de 50% na formação de tumores em 48 horas em comparação com o tempo 0. Para detectar uma diminuição de 50% na formação de tumores a um nível de significância de 0,05 e uma potência de 0,80, calculou-se uma amostra de tamanho de 8 por grupo [18]. A fim de avaliar o efeito do meio de armazenamento, bem como, o que é necessário um tamanho de amostra de 8 em cada ponto de tempo, tanto para os meios de comunicação e grupos salinos.

Para os experimentos UW-SCC34 e UW-SCC52, todos os tumores foram pesados ​​individualmente no final. Os pesos tumorais obtidas por estes PDXs dos dois meios de crescimento (de mídia e salinas) foram resumidas por meio de estatística descritiva incluindo média e desvio padrão. Os pesos dos tumores através dos dois meios de crescimento foram comparadas pelo teste F Snedecor a partir de uma análise de duas vias do modelo de variância (ANOVA), que incluiu o tempo como um fator. Assim, este modelo ajustado para o momento em que a amostra foi implantado no rato. A diferença entre os pesos dos tumores médias entre os meios de comunicação e amostras de meio de crescimento salina foi calculado com intervalo de confiança de 95%. Essas análises estatísticas foram realizadas utilizando SAS versão 9.2.

Para os experimentos PDX recém-criadas, todos os tumores foram colhidos e pesados ​​a partir da UW-SCC64 PDX. A média de pesos tumorais para o Tempo grupos 0 e 24 horas foram comparados utilizando um teste t de duas amostras com a igualdade de desvios-padrão. Esta análise foi levada a cabo usando Graphpad Prism v6.0d. Para todos estatística analisa um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Ratos

No início do estudo, os ratos tinham um peso médio de 22,8 gramas (g) (intervalo de 19,0 g 26,8-g). Eles foram livres de quaisquer microrganismos e não tinha sido submetido a qualquer tratamento prévio, ou testes.

pré-implantação Os pesos dos tumores

Para minimizar as diferenças na quantidade do tumor implantado em cada grupo, que primeiro tumores distribuídos de tal forma que os pesos iguais foram injectadas em ratinhos em cada ponto de tempo e para cada condição de armazenamento (Figura 1). Para os catorze grupos UW-SCC34, o tumor médio pré-implantação pesava 0,0906 g (0,0816 g-gama 0,1027 g), e para UW-SCC52 a média foi de 0,1298 g (0,1116 g-gama 0,1487 g). Como representado pelas boxplots nas Figuras 2A e 2B, não houve valores aberrantes entre os pesos dos tumores pré-implantação para os grupos de catorze em qualquer experiência.

(A) Boxplot para o tumor pré-implantação catorze UW-SCC34 pesos demonstra a ausência de quaisquer valores aberrantes. (B) Boxplot dos pesos tumorais pré-implantação para UW-SCC52 também mostra que não existem quaisquer valores atípicos.

efeito do armazenamento de médio e Time on PDX Manutenção

No final de ambas as experiências, todos os tumores foram colhidos, fotografados (figuras 3A e 3C) e pesados ​​a partir dos 28 ratinhos. Em primeiro lugar, examinamos se o meio de armazenamento (a mídia contra solução salina) afectados potencial de crescimento do tumor. Para UW-SCC34 o peso médio do tumor para todos os tumores no grupo de media (n = 56) foi de 0,132 g (desvio padrão (SD) 0,130 g), e para o grupo de soro fisiológico (n = 56) a média foi de 0,142 g (SD 0,120 g). A diferença entre os pesos de tumor médios para os dois grupos foi -0,010 g (95% CI: -0,056 g, 0,035 g), o qual não foi estatisticamente significativa. A fim de explicar qualquer relação com o momento em que o tumor foi implantado, foi realizada uma ANOVA de duas vias com meio de armazenamento e tempo como os fatores. Isso também demonstrou que não houve diferença estatisticamente significativa entre o peso médio do tumor nos meios de comunicação e grupos salinos (p = 0,650, Figura 3B). Realizou-se as mesmas análises para o experimento UW-SCC52. Para todos os tumores no grupo de media (n = 56), o peso médio foi de 0,146 g (0,113 g SD) e para o grupo de soro fisiológico (n = 56) a média foi de 0,119 g (DP 0,111 g). Mais uma vez, com uma diferença entre as médias de 0,027 g (95% CI: -0,012 g, 0,067 g), não houve diferença significativa entre os pesos de tumor médios com base no meio de armazenamento. Finalmente, utilizando um ANOVA de duas vias, não houve diferença significativa entre os pesos de tumor para os meios de armazenamento contra meios salinos quando se toma em consideração o tempo (p = 0,177, Figura 3D). Assim, com base em nossas experiências duplicadas o meio de armazenamento não tem qualquer efeito sobre o potencial de crescimento do tumor, mesmo quando respondendo por tempo de retirada do tumor de re-implantação.

(A) fotografias de todos os tumores colhidos no final de o experimento para UW-SCC34. (B) Boxplots para o fim de pesos tumorais experiência para a experiência de UW-SCC34 distingue-se pelo meio de armazenamento e tempo. (C) de fotografias de todos os tumores colhidos no final da experiência para UW-SCC52. (D) Fim de pesos tumorais experimentais para UW-SCC52 também separados por meio de armazenamento e tempo.

Também avaliamos se o tempo de retirada do tumor à implantação teve qualquer efeito sobre a viabilidade do tumor. Em cada ponto de tempo, havia 16 tumores potenciais que poderiam ter desenvolvidos (8 a partir de mídia e 8 do grupo solução salina). Com base na Tabela 1, para a experiência UW-SCC34 é evidente que o tempo não ter impacto na capacidade para a PDX para crescer, devido, pelo menos, 13 dos 16 tumores desenvolvidos em cada um dos sete pontos de tempo. Curiosamente, nos pontos de tempo posteriores, 24 e 48 horas, 16 de 16 PDXs cresceu. Da mesma forma, para o experimento UW-SCC52, pelo menos 15 dos 16 tumores desenvolvidos em cada tempo (Tabela 1). Assim, o comprimento de atraso antes de re-implantação não teve impacto na viabilidade de tumor tanto para as experiências de UW-SCC34 ou UW-SCC52, dentro do período de tempo estudado (isto é, até 48 horas de armazenagem a 4 ° C). Além disso, não houve relação entre o peso do tumor pré-implantação e desenvolvimento do tumor final (ou seja: os ratos poucos que não conseguiu desenvolver um ou dois tumores não têm as menores pesos tumorais pré-implantação). Isto indicou também que a quantidade de tumor injectadas no inicio das experiências era apropriado para promover o crescimento tumoral subsequente.

Histologia

Como apresentado na Tabela 2, o pré-implantação UW tumor -SCC34 foi moderadamente diferenciado com 10% de queratinização, 5% de necrose /mudança cística e padrão infiltrativo em H e coloração. Mais importante, todos os tumores na passagem subsequente a partir de sete pontos de tempo diferentes e dois meios de armazenamento demonstraram as mesmas características de diferenciação moderado com um padrão infiltrante, juntamente com alguns queratinização (gama de 5% -15%) e necrose /mudança cística (intervalo 5% -15%). Imagens representativas das lâminas coradas são mostrados na Figura 4. Em seguida, o tumor pré-implantação UW-SCC52 foi avaliada e tinha diferenciação moderado, sem queratinização, 20% de necrose /mudança cística e um padrão de infiltração (Tabela 3). Mais uma vez, a histologia dos tumores a partir de passagem seguinte (todos os pontos de tempo e ambos os meios de armazenamento) foi muito semelhante com cada diferenciação visualizadas moderada, sem queratinização, alguma necrose /mudança cística (intervalo de 5% -25%) e um fenótipo infiltrante . Assim, histologicamente, demonstramos que o mesmo tumor desenvolvido independentemente do meio de tempo de armazenamento ou para ambos UW-SCC34 e UW-SCC52

Imagens representativas de H . E lâminas coradas para cada grupo dentro da UW- experimentos SCC34 e UW-SCC52.

efeito do tempo sobre nova PDX Estabelecimento

Nós investigamos se um atraso de 24 horas no tempo de implantação (tumor armazenados em media a 4 ° C durante o atraso) tiveram qualquer efeito sobre criação PDX para três novas PDXs HNC (UW-SCC63, UW-SCC64, UW-SCC65). Aproximadamente iguais volumes tumorais foram injectadas em ratinhos em dois tempo 0 e 24 horas para cada um dos três PDXs. Para UW-SCC63 os pesos tumorais pré-implantação foram 0,0694 g e 0,0723 g, enquanto os pesos pré-implantação foram muito menor para UW-SCC64 (0,0115 g e 0,0117 g) e UW-SCC65 (0,0085 g e 0,0093 g).

nove semanas após a implantação inicial, os ratinhos portadores de cada nova PDX foram avaliadas para o crescimento do tumor. Apenas ratos com o UW-SCC64 PDX teve volume do tumor suficiente para passaging. Por isso, estes ratinhos foram sacrificados, e todos os tumores foram individualmente fotografado e pesados ​​(Figuras 5A e 5B). O peso médio para o tempo de 0 tumores foi de 0,104 g (DP 0,156 g) e às 24 horas, a média foi de 0.060 g (DP 0,137 g). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os pesos de tumor médio entre estes dois grupos (p = 0,564). Além disso, houve um número semelhante de tumores que surgiram em cada um dos dois grupos. Quatro dos oito tumores cresceram no tempo 0 e três de oito desenvolvida no grupo de 24 horas. Para UW-SCC63, havia três tumores palpáveis ​​no grupo tempo 0 e dois na coorte de 24 horas. Por outro lado, UW-SCC65 não demonstraram quaisquer tumores palpáveis ​​em nenhum dos grupos. No geral, ele aparece nos PDXs que foram capazes de estabelecer-se, o tempo de atraso de 24 horas não afetou a viabilidade PDX. Curiosamente, o peso do tumor pré-implantação não pareceu ter um efeito importante sobre o crescimento tumoral subsequente uma vez que os tumores UW-SCC64 (que demonstraram o maior crescimento) tinha aproximadamente seis vezes menor do tumor implantado inicialmente, em comparação com UW-SCC63.

as fotografias (a) de todos os tumores colhidos no final da experiência para UW-SCC64. (B) Os gráficos de barras representando os pesos médios do tumor para o tempo 0 e 24 grupos horas no experimento UW-SCC64.

Discussão

PDXs representam um importante modelo e validado para a investigação de numerosos subtipos diferentes de câncer, especialmente no julgamento de quimioterápicos novos e padrão. Como o tecido do paciente é precioso e muitas vezes difícil de obter, os investigadores devem tomar muito cuidado para otimizar esse sistema modelo. Por esta razão, nós quisemos explorar mais os potenciais limites do PDX passaging testando a hipótese de que 1) Tempo de retirada do tumor para a implantação final na nova ratos NSG é importante e 2) meio de armazenamento tem um efeito sobre a viabilidade PDX e crescimento. Surpreendentemente, descobrimos que nem o meio de armazenamento (mídia ou soro fisiológico), nem tempo de armazenamento (até 48 horas a 4 ° C) afetou o crescimento PDX e criação em uma passagem posterior. Além disso, revelou que atrasar a implantação de tecido fresco paciente até 24 horas (tumor armazenado em mídia gelada durante o atraso) não afetou estabelecimento inicial PDX.

Para apreciar plenamente a importância ea necessidade de PDXs em o campo da pesquisa do câncer, é valiosa para avaliar outros modelos disponíveis, juntamente com os seus pontos fortes e armadilhas. Em primeiro lugar, as linhas celulares têm desempenhado um papel importante na história da pesquisa oncológica e descoberta de drogas. As células HeLa representam as primeiras células cancerosas humanas cultivadas em laboratório e análises destas células e outras linhas celulares que se seguiu ter fornecido muito da nossa compreensão molecular atual de câncer [19]. Além disso, o processo de pré-clínica padrão para a investigação de novos agentes quimioterápicos de câncer pelo Instituto Nacional do Câncer (NCI) começa com a avaliação de

in vitro

atividade em 60 linhas celulares de cancro estabelecidos (NIC-60), seguido de

a avaliação in vivo

destas linhas de células em ratinhos através de ambos o ensaio de fibra oca e xenoenxertos de [20], [21]. Recentemente, a validade da utilização de linhas celulares como substitutos para o tumor primário ter sido posto em questão [22]. Gillet et ai. demonstrada através de genética analisa que existiu nenhuma correlação entre tumores de pacientes e linhas celulares de cancro estabelecidas, e na verdade as linhas de células deu maior semelhança entre si do que para amostras clínicas [23]. Grupos adicionais também revelaram diferenças chave entre tumores primários e linhas celulares derivadas [24]. No entanto, os investigadores também observam que importantes mudanças da via ainda existem nestas células tumorais [25]. Assim, apesar das diferenças com relação ao tumor primário, perfis de expressão genética pode ser utilizada para selecionar linhas de células para análises específicas [26] – [28]

Devido à crescente preocupação com a representatividade de linhas celulares para. o cancro primário, existe a necessidade de modelos adicionais para completar o presente trabalho. modelos de camundongos transgênicos representam outro sistema distinto que têm sido utilizados na pesquisa do câncer. Estes modelos são mais frequentemente utilizado para avaliar o impacto das mutações oncogénicas relevantes para a tumorigénese e resposta terapêutica para uma variedade de cancros humanos, incluindo o adenocarcinoma ductal pancreático [29], [30], do sarcoma dos tecidos moles [31], adenocarcinoma pulmonar [32] , HNC [33] e muitos outros. O escopo de perguntas que podem ser examinados por camundongos transgênicos é bastante amplo, como exemplificado por estudos prévios em camundongos transgênicos expressando papilomavírus humano oncogenes (HPV) em que as interações entre estes oncogenes específicos com genes Fanconi anemia por deficiência [34], o estrogênio ea progressão do cancro do colo do útero [35], e oncoproteínas expressão em relação ao tráfico de linfócitos [36] foram elucidados. Ao todo, a pesquisa rato transgénico pode fornecer uma visão única sobre os mecanismos de mutações cancerígenas e intervenções terapêuticas potenciais. No entanto, esses modelos tendem a ter poderosa condução mutações de oncogenes e outras mudanças genéticas muito específicas que podem limitar o âmbito da sua aplicabilidade a oncologia clínica.

Para o modelo PDX, o câncer de cada paciente é único e representa inúmeras alterações genéticas que acumulados ao longo do tempo o câncer desenvolvido. Estas células não transformadas são intencionalmente ou forçado para sobre-expressar proteínas específicas como linhas celulares e modelos de ratinho transgénicos, respectivamente. Idealmente, isso significa PDXs deve assemelhar-se mais de perto do tumor primário. Como descrito na introdução, muitos grupos validaram a utilidade deste sistema, incluindo a capacidade para PDXs recapitular o potencial metastático do tumor primário [7], [37]. Importante, Tentler et ai. recentemente revisto o registro translacional pista para PDXs no desenvolvimento de medicamentos de oncologia para uma ampla gama de tipos de câncer, e o futuro para PDXs no desenvolvimento de biomarcadores preditivos para ensaios clínicos parece promissor [17].

PDXs pode ser injectado ratinhos em qualquer forma ou ortotópica heterotópica [17]. Os PDXs que geraram, utilizados e descritos ao longo deste trabalho foram implantadas de forma heterotópico desde HNCS foram cultivadas por via subcutânea em ratos. Outros grupos que estudam pancreático [4], [6], o pulmão [9], [10] e [10] cancros também têm utilizado a implantação do tumor subcutâneo renal para o seu trabalho. tumores subcutâneos permitir um acesso mais fácil para medição das dimensões por pinças durante os estudos terapêuticos. Além disso, os tumores podem ser cultivadas até uma subcutaneamente volume muito maior em comparação com locais ortotópicos antes de causar danos aos ratinhos. Desta forma, os tumores subcutâneos permitir uma maior amplificação deste tecido valiosos, que podem então ser colhidos para análise histológica, bem como análises moleculares e para passaging a novos ratinhos. implante ortotópico, pelo qual as células de tumor são injectadas no local da origem, representam uma outra forma viável para propagar e estudar PDXs. Esta técnica tem sido descrito para o peito de [7], do cérebro [38], e HNCS [37], [39]. Pensa-se que este modelo permite que os tumores se desenvolvam num microambiente mais representativo [39]. Na verdade, este sistema é especialmente útil para estudar metástase [7], [37]. No entanto, em especial para a região da cabeça e pescoço, apenas pequenos volumes de tumor pode ser gerado antes de causar danos aos ratinhos. Qiu et al. documentado que as dietas depois de duas semanas os ratos com PDXs orais necessária modificados devido à dificuldade para comer [37]. Devido a estes tamanhos pequenos tumores, é difícil de propagar PDXs HNC cultivadas ortotopicamente.