PLOS ONE: Interleucina-10 haplótipos pode predizer Sobrevivência e Relapse em recessionada não-pequenas células do pulmão Cancer

Abstract

IL-10 está associada à malignidade do tumor via de escape imunológico. Nossa hipótese é que a IL-10 haplótipos categorizados por IL-10 polimorfismos do promotor na -1082A G, -819C T, e -592C Um possam influenciar IL-10 expressão e dão origem a pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) com resultados pobres e recaída. Foram coletados os tecidos normais adjacentes de 385 pacientes com NSCLC para determinar IL-10 haplótipos por sequenciação directa e em cadeia da polimerase do polimorfismo de restrição reacção do comprimento do fragmento (PCR-RFLP). Dos 385 tumores, 241 estavam disponíveis para avaliar os níveis de expressão de mRNA de IL-10 por em tempo real de RT-PCR. A influência de IL-10 haplótipos sobre a sobrevivência global (OS) e sobrevivência livre de doença (RSF) foram determinados por análise de regressão de Cox multivariada de Kaplan-Meier e. Os resultados mostraram que os níveis de mRNA de IL-10 foram significativamente mais elevadas em tumores com o haplótipo não-ATA do que com o haplótipo ATA (P = 0,004). Os pacientes com o haplótipo não-ATA teve mais curto OS e períodos RFS do que os pacientes com o haplótipo ATA. Isto pode ser relacionado com a observação de que o número de linfócitos que se infiltram no tumor foi reduzida nos tumores com níveis mais elevados de IL-10. Consistentemente, células T do sangue periférico dos pacientes com haplótipo não-ATA foram mais susceptíveis à apoptose e menos citotóxica para as células tumorais, em comparação com as dos pacientes com haplótipo ATA. Os resultados sugerem que a IL-10 pode promover malignidade do tumor por meio de promoção de apoptose de células T e a sobrevivência das células de tumor, e IL-10 haplótipo avaliado por PCR-RFLP ou sequenciação directa pode ser utilizada para prever a sobrevivência e recaída em NSCLC ressecado, ajudar os clínicos a fazer decisões adequadas sobre o tratamento dos pacientes

Citation:. Wang YC, Sung WW, Wu TC, Wang L, Chien WP, Cheng YW, et al. (2012) Interleukin-10 haplótipos pode predizer Sobrevivência e Relapse em recessionada Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (7): e39525. doi: 10.1371 /journal.pone.0039525

Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Recebido: 06 de janeiro de 2012; Aceito: 22 de maio de 2012; Publicação: 27 de julho de 2012

Direitos de autor: © Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada conjuntamente por bolsas do Conselho Nacional de Ciência (NSC-96-2628-B-040-002-MY3), e do Departamento de Saúde (DOH101-TD-C-111-005) de Taiwan, ROC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a interleucina-10 (IL-10), uma importante citocina immunoinhibitory, é parte de uma rede equilibrada de citocinas [1] – [5]. A citocina IL-10 é produzida por várias células incluindo as células B normais e neoplásicas, estimulou os monócitos, macrófagos, e um subconjunto de células T [1] – [4]. Muitos estudos de caso-controle têm indicado uma associação de IL-10 polimorfismos do promotor (SNPs) com riscos de câncer humano, incluindo o risco de câncer de pulmão [6] – [9]. Da IL-10 promotora de SNPs, os no -1082A G, -819C T, e -592G A tem sido o foco de estudos recentes, e os fenótipos destas SNPs de nucleótidos individuais foram ainda confirmados por ensaios funcionais em células modelos [10], [11].

tumorais estudos vigilância imunológica revelaram uma associação entre a IL-10 e o desenvolvimento de cancros humanos, tais como linfoma de células B grandes, linfoma não-Hodgkin de células T, e cancros do cólon, da próstata, da mama, gástrico, de mieloma, e pulmão [4], [6] – [9], [12] – [22]. Em casos de câncer de pulmão, alguns relatórios indicam que a perda de IL-10 em tumores de pulmão podem promover a progressão do tumor e resultar em resultados clínicos pobres em pacientes; no entanto, um efeito oposto tem sido relatado em outros estudos [23] – [29]. Curiosamente, a ausência de IL-10 de expressão foi associada com mau resultado na fase I do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [24], [25], enquanto que na fase final de NSCLC, a presença de IL-10-positivas macrófagos nas margens do tumor pode ser um indicador de resultado de mau prognóstico [23]. Além disso, o tempo de sobrevivência mais curtos têm sido relatados em pacientes com câncer avançado de pulmão que tinham elevados níveis séricos de IL-10 níveis, quando comparados com pacientes semelhantes que tinham baixo soro IL-10 níveis [26]. continua a ser um papel claro para IL-10 na tumorigênese pulmonar, portanto, a ser identificado.

No presente estudo, foram examinados tecidos pulmonares normais adjacentes aos tumores NSCLC cirurgicamente ressecados em 385 pacientes, a fim de identificar IL-10 promotor SNPs em -1082A G, -819C T, e -592C Um por sequenciação directa e em cadeia da polimerase restrição reacção polimorfismo de fragmento (PCR-RFLP). Estes três SNPs de IL-10 de promotor foram relatados para produzir principalmente três haplótipos: CCG, ACC, ATA [30] – [33]. No presente estudo, os pacientes foram classificados em dois haplótipos, ATA e não-ATA (Fig. 1), que haviam sido utilizadas em dois relatórios anteriores [34], [35]. Questionamos: 1) se os tumores de transportadores não-ATA tem mais elevados de IL-10 níveis de expressão de mRNA do que tumores de portadores ATA, 2) se os pacientes com um haplótipo não-ATA ou níveis mais altos de IL-10 mRNA em tumores de pulmão têm maior tumor imunitário vigilância, e 3) se a IL-10 ou haplótipo expressão de ARNm pode ser utilizada para prever a sobrevivência global (OS) e sobrevivência livre de doença (RSF) em doentes com NSCLC ressecados.

SNPs nas posições -819 e -592 no o promotor da IL-10 estavam em desequilíbrio de ligação completo. Três IL-10 haplótipos foram observados ea ocorrência de cada combinação de haplótipos ou haplótipo está listado nas caixas sombreadas.

(A) Representante do CD3 imunocoramento TIL em tumores de pulmão com baixa densidade de TIL ( 25 CD3

+ /HPF) (à esquerda: 100x; direita: 400x); (B) TIL apresentado em tumores de pulmão mostram alta densidade TIL (≥25 CD3

+ /HPF) (à esquerda: 100x; direita: 400x).

apoptose das células T foi definida como anexina V

+ /CD3

+ e de células tumorais apoptose foi definida como anexina V

+ /PKH26

+. (A) citometria de fluxo Representante da escala SSC-FSC para gating população de linfócitos, e PKH26 afirmando para a marcação de células tumorais. (B) citometria de fluxo Representante do resultado apoptose de CD3

células + T e células tumorais PKH26 fechado. (C) Maior nível de apoptose das células T após a co-cultura com células tumorais de 22 voluntários saudáveis ​​do sexo masculino que abrigavam a IL-10 não-ATA haplótipo contra as IL-10 ATA haplótipos (taxas de apoptose de células T durante a co-cultura com A549: 10,49 ± 3,04 vs 8,34 ± 2,37, P = 0,011; durante a co-cultura com TL-1: 18,30 ± 3,82 vs 12,97 ± 2,94, P 0,01). Adicionamos a proteína recombinante IL-10 para o meio de co-cultura de PBMC que albergam a IL-10 ATA haplótipo, e a taxa de T a apoptose foi aumentada (aumentada 7,63% durante a co-cultura com A549, P 0,001; aumento de 2,73% durante a co -cultura com TL-1, P = 0,008). Também adicionado IL-10 neutralizou anticorpo para o meio de co-cultura de PBMC que albergam o não-ATA IL-10 haplótipo, e a taxa de T a apoptose foi diminuída (por 1,78% durante a co-cultura com A549, P = 0,017; por 7,75 % durante a co-cultura com TL-1, P 0,001). (D) Maior nível de apoptose de células tumorais após co-cultura com PBMCs de 22 voluntários saudáveis ​​do sexo masculino que abrigavam a IL-10 ATA haplótipo versus o haplótipo não-ATA (apoptose de A549: 16,80 ± 3,38 vs. 14,45 ± 3,78, P = 0,035; apoptose de TL-1: 12,95 ± 3,05 vs 8,68 ± 2,57, P 0,01). Adicionamos a proteína recombinante IL-10 para o meio de co-cultura de PBMC que albergam a IL-10 ATA haplótipo, e a taxa de apoptose do tumor foi diminuído (diminuição 4,29% de A549, P 0,001; diminuiu 1,94% de TL-1, P = 0,043). Também adicionado IL-10 neutralizou anticorpo para o meio de co-cultura de PBMC que albergam a IL-10 não-ATA haplótipo, e a taxa de apoptose tumoral foi aumentada (um aumento de 2,46% do A549, P = 0,037; aumento de 6,67% da TL- 1, P . 0.001)

(20 ug por 3 dias). Os ratos foram sacrificados no 14

th dias. Metástase pulmonar foi encontrado em camundongos injetados com o anticorpo de IgG (A) e não foi encontrada em pacientes com a IL-10 de ratinho neutralizam (B).

De acordo com a IL-10 haplótipo (A), IL 10 mRNA (B), ea combinação de IL-10 haplótipo e mRNA (C).

Materiais e Métodos

os pacientes

Este estudo incluiu 385 pacientes com NSCLC. Todos os pacientes eram independentes de etnia chinesa e moradores da região central de Taiwan. Os pacientes tinham sido diagnosticados com adenocarcinoma (194; 50,4%) ou carcinoma de células escamosas (191; 49,6%) e foi submetido à ressecção cirúrgica na Divisão de Cirurgia Torácica, Taichung Veterans General Hospital, entre 1993 e 2004. As amostras foram imediatamente congeladas a cirurgia e manteve-se a -80 ° C até serem processadas. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board (Conselho de Revisão Institucional, Hospital Chung Shan Medical University CSMUH. No: CS11177). dados de recidiva do câncer foram obtidos por revisão de prontuários e confirmado por cirurgiões torácicos. Os parâmetros clínicos e dados do sistema operacional e RFS foram coletadas a partir do gráfico comentários (32 pacientes não tinham dados de recaída) e do Registro de Câncer de Taiwan, Departamento de Saúde, Executive Yuan, ROC.

extração de DNA genômico, extração de RNA, e cDNA síntese |

O ADN genómico foi extraído por métodos convencionais. Ressecada cirurgicamente tecidos normais adjacentes ao tumor de pulmão foram preparados usando digestão com proteinase K e o DNA foi extraído utilizando fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol.

O ARN total foi extraído a partir de tecidos de tumor do pulmão 241 disponíveis utilizando o reagente TRIzol ( Invitrogen). síntese da primeira cadeia de ADNc na presença de iniciadores aleatórios foi realizada utilizando uma alta capacidade de cDNA kit de transcrição reversa (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante.

análise de PCR-RFLP para a IL-10 -592C /A genética SNP

genótipos de IL-10 -592C /A foram determinadas por PCR-RFLP, tal como descrito por Rad et ai. [36]. produtos de PCR de 50 amostras foram selecionados aleatoriamente para sequenciação directa para confirmar o genótipo indicado por PCR-RFLP.

sequenciação directa de IL-10 -1082A /G e -819C /T SNPs genéticos

SNPs de IL-10 -1082G /a e -819C /T foram determinadas por sequenciação directa de produtos de PCR amplificados a partir do ADN de tecidos normais adjacentes aos tumores. As amostras de ADN foram preparados utilizando digestão com proteinase K e extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol. Os iniciadores utilizados para a amplificação de DNA e sequenciamento directo era: 5′-CTCGCCGCAACCCAACTGGC-3 ‘(F) e 5′-TGGGGGAAGTGGGTAAGAGT-3’ (R). As condições dos ciclos de PCR consistiu de um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de 30 s a 94 ° C; 45s a 56 ° C; 45s a 72 ° C; e um alongamento final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram sequenciados utilizando um Applied Biosystems 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

em tempo real de RT-PCR

em tempo real a amplificação de RT-PCR de amostras de cDNA foi realizada com um ABI 7500 em tempo real de PCR System (Applied Biosystems) e corante SYBR Green para quantificar transcritos de ARNm de IL-10. Em tempo real os iniciadores de RT-PCR foram como se segue: para IL-10, 5′-transcrições GGCGCTGTCATCGATTTCTT-3 ‘(directo) e 5′-TGGAGCTTATTAAAGGCATTCTTCAC-3′ (inverso); para transcritos de genes 18S, 5’-TCGGAACTGAGGCCATGA-3 ‘(directo) e 5′-CCGGTCGGCATCGTTTA-3’ (inverso). Os produtos amplificados por IL-10 primers foram verificados por sequenciação directa. As quantidades de IL-10 transcritos de mRNA foram quantificados em relação aos 18S controlo interno de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems).

Periférico isolamento de monócitos de sangue e de co-cultura experiências

monócitos do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis ​​foram isoladas através de Ficoll-Paque (GE Healthcare) centrifugação em gradiente de densidade, tal como descrito anteriormente [37]. As PBMCs foram usadas para a determinação da apoptose induzida por células T de células do cancro por co-cultura com células de cancro do pulmão em uma proporção de 40:1 durante 36 horas com IL-10 de ratinho neutralizam (MAB2171, R D Systems) ou IL 10 proteína recombinante (CYT-500, Prospec). As PBMCs foram então colhidas para análise de apoptose das células T por citometria de fluxo

análise de citometria de fluxo

um citómetro de fluxo. (FACSCalibur; BD Biosciences) foi usada para determinar o tamanho da população de células e percentagem de apoptose . PBMC foram corados com PE-Cy

TM7 rato CD3 anti-humano (BD Pharmingen) e as células positivas para CD3 na barreira linfocitária foram identificadas como células T. Anexina V-FITC (BD Pharmingen) foi utilizado para marcar a apoptose celular. Após a coloração as células de acordo com o protocolo recomendado, as amostras foram analisadas dentro de 1 hora. Para a apoptose das células T, que fechado o portão de linfócitos em FSC-SSC, ea população com CD3

+ e anexina V

+ foi calculada [37].

imuno coloração

coloração imuno-histoquímica para avaliar a expressão de CD3 em linfócitos foi realizada em todo o montar secções de parafina de amostras de cancro do pulmão. Anti-CD3 (1/100) policlonais de anticorpo primário (Santa Cruz Biotechnology) foi usado. Um kit de detecção de imuno-histoquímica para

in vitro

uso diagnóstico (Invitrogen) foi utilizada de acordo com o protocolo padrão. TIL foi contado por seleção aleatória sistemática de campos. Pelo menos cinco diferentes HPF foram contados em cada amostra, o que depende do tamanho da área de tumor.

modelo animal

ratinhos C57BL /6 foram mantidas em instalações padrão de ratinho (patógeno específico livre) em Chung University Medical Shan. A linha de células CT-1 foi gentilmente cedido pelo Dr. TC Wu (John Hopkins, Baltimore, MD) [38]. as células CT-1 foram suspensas em PBS a uma concentração de 10

5 células por 100 ul. Cada rato foi injectado com 10

5 TC-1 células por cauda injecção vão. Os ratinhos receberam doses intraperitoneais de 200 ug de anti-IL-10 de ratinho (mAb417 R D Systems), no primeiro dia de injecção; alternado com doses intraperitoneais de 20 ug de anti-IL-10 de ratinho (mAb417 R D Systems) espaçadas by3 dias. Os ratos foram sacrificados aos 14

th dias após a injecção de tumor. HE mancha foi realizada para verificar a formação do tumor entre os órgãos de ratos.

A análise estatística

O teste t de Student eo teste do qui-quadrado foi aplicado para análise de dados contínua ou discreta. As associações entre IL-10 polimorfismos promotores e sobrevida do paciente foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e avaliados pelo teste de log-rank. Possíveis fatores de confusão foram ajustados pelos modelos de regressão de Cox, com polimorfismos do promotor IL-10 equipados como variáveis ​​indicadoras. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS estatística software (versão 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL). Todos os testes estatística foi feita por meio de testes e valores de P 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Resultados

Não-ATA haplótipo é mais comum em pacientes com metástase nodal

IL-10 haplótipos-ATA /ATA ATA (haplótipo) e não-ATA /ATA (ATA não-haplótipo) -foram categorizados pela IL-10 SNPs no promotor -1082A /G, -819C /T e -592C /A (Fig. 1). As relações entre IL-10 haplótipos e os parâmetros clínico em 365 pacientes com NSCLC foram analisados ​​estatisticamente pelo teste do qui-quadrado. Como mostrado na Tabela 1, o haplótipo não-ATA ocorreram mais frequentemente em pacientes com metástase nodal (N1 e N2) do que com metástase não-nodal (N0) (62,5% vs. 50,3%, P = 0,016). Além disso, uma relativamente maior prevalência de fumantes foi observada em pacientes com o haplótipo não-ATA do que com o haplótipo ATA (61,7% versus 51,8%, P = 0,049). Portanto, pacientes com ATA não haplótipo podem ter tumores mais agressivos com uma maior tendência para a recaída.

níveis mais altos de IL-10 mRNA em tumores pulmonares de pacientes haplótipos não-ATA, em comparação com os pacientes haplótipos ATA resultou em tumor mais pobres vigilância imunológica parcialmente através de uma diminuição do número de tumor infiltrando linfócitos

dos tumores de 385 pacientes com câncer de pulmão, 241 estavam disponíveis para avaliação de IL-10 níveis de expressão de mRNA. Como mostrado na Fig. 2, níveis significativamente mais elevados de ARNm de IL-10 foram encontrados em tumores de pacientes ATA não de haplótipos do que a partir de pacientes de haplótipos ATA (média ± EP, 68,51 ± 16,31 vs 12,85 ± 4,54, P = 0,004). A distribuição dos linfócitos infiltram no tumor (TIL) em tumores de pulmão foi avaliada por IHC em 87 secções de parafina de tumores de pulmão disponíveis. Em toda a população estudada, não houve diferença no número de TIL em tumores de pulmão de ATA e os pacientes não-ATA (Tabela 2, Figura 3;. 50,0 vs 37,5, P = 0,236). No entanto, foi observada uma diferença em números TIL entre ATA e os transportadores não-ATA em pacientes em estágio final (P = 0,032, Tabela 2), mas não em pacientes em estágio inicial (P = 0,988, Tabela 2). Estes resultados sugerem que os pacientes não-ATA que têm mais baixos números de TIL em comparação com pacientes ATA pode ter mais pobre tumor vigilância imunológica.

IL-10 reduz a apoptose de células tumorais através do aumento da apoptose das células T

Para verificar a possibilidade de mudanças no tumor vigilância imunológica, PBMC foram coletados de 22 doadores saudáveis ​​com o haplótipo ATA e 22 doadores saudáveis ​​com o haplótipo não-ATA. os níveis de mRNA de IL-10 em PBMC de ATA não de haplótipos dadores saudáveis ​​foram maiores do que a partir de dadores saudáveis ​​ATA haplótipos (média ± EP, 78,54 ± 13,18 vs 46,37 ± 3,91, P = 0,028). Estas células foram co-cultivadas com A549 e, em seguida, TL-1, células de cancro do pulmão. A citotoxicidade de células do cancro do pulmão foi determinado por citometria de fluxo com Anexina V

+ /PKH26

+ e apoptose das células T foi determinada com Anexina

+ /CD3

+. A apoptose de células T após co-cultura com células A549 e TL-1 foi inferior em PBMC de dadores saudáveis ​​ATA haplótipos que em PBMC de dadores ATA não de haplótipos saudáveis ​​(8,34 ± 2,37 vs 10,49 ± 3,04, p = 0,012 para A549; 12,97 ± 2,94 vs 18,30 ± 3,82, P 0,001; Fig. 4A). Por conseguinte, o número de células apoptóticas tumorais (A549 e TL-1) foi significativamente mais elevada após a co-cultura com as PBMC de dadores saudáveis ​​ATA haplótipos do que a partir de dadores saudáveis ​​não-ATA (16,80 ± 3,38 vs 14,45 ± 3,78, P = 0,035 para A549; 12,95 ± 3,05 vs 8,68 ± 2,57, P 0,001; Fig. 4B). Para verificar se a IL-10 foi responsável por esta apoptose de células T e células do cancro do pulmão, os números de células apoptóticas T de PBMC de dadores saudáveis ​​ATA haplótipos foi aumentada por tratamento com 100 ng /ml de IL-10 (8,34 ± 2,37 vs . 15,97 ± 3,03, P 0,001 para A549; 12,97 ± 2,94 vs 15,70 ± 3,54, P = 0,008 para TL-1; a Fig. 4A). Por outro lado, a apoptose de células T em PBMC a partir de dadores saudáveis ​​não-ATA foi marcadamente diminuída de um modo dependente da dose pela IL-10 anticorpo neutralizado (Fig. 4A). Por conseguinte, a apoptose de ambos os tipos celulares de cancro de pulmão era diminuído por tratamento com IL-10 e aumento de IL-10 anticorpo neutralizado (Fig. 4B). Colectivamente, PBMC de transportadores não-ATA teve efeitos inferior apoptóticos em células de câncer de pulmão do que os PBMC a partir de transportadores ATA, e IL-10 foi responsável por apoptose de células tumorais após co-cultura com PBMC. Estes resultados indicam claramente que a IL-10 reduziu a apoptose de células de tumor por meio de aumento da apoptose de células T.

Na nossa experiência com animais, as células CT-1 que não expressam IL-10 (gentilmente fornecida pelo Dr. TC Wu, John Hopkins, Baltimore, MD, EUA) foram injectadas em ratinhos C57BL6 através da veia da cauda. Após 14 dias, os tumores foram formados em todo o pulmão (Fig. 5). No entanto, não há tumores foram observados após as células CT-1 foram tratados ratinhos tratados com anticorpo neutralizado IL-10. Estes resultados parecem apoiar estudos anteriores que indicam que a IL-10 secretada a partir de células imunes pode promover a progressão do tumor de pulmão [39].

Pacientes com haplótipo não-ATA ou níveis elevados de ARNm de IL-10 teve resultados mais pobres em comparação com os pacientes com haplótipo ATA ou baixos níveis de IL-10 mRNA

Kaplan-Meier e multivariada de regressão de Cox foram realizados para verificar se pior sobrevida e maior de recaída seria visto em pacientes com o haplótipo não-ATA ou alto IL-10 níveis de mRNA em tumores de pulmão em comparação com pacientes com o haplótipo ATA ou IL-10 baixos níveis de mRNA. As curvas de sobrevivência previstos pela análise de Kaplan-Meier mostrou que os pacientes com o haplótipo não-ATA teve mais curto OS e períodos RFS que os pacientes com o haplótipo ATA (P = 0,001 para OS, painel esquerdo da Figura 6A;. P 0,001 para RFS, painel direito da Fig. 6A). Consistente com o valor prognóstico do haplotipo de IL-10, os níveis elevados de IL-10 ARNm foram também observados num subconjunto dessa população em estudo (n = 241), mostrando que os tumores com altos níveis de IL 10 ARNm foram correlacionados com pior OS e RFS do que em pacientes cujos tumores tinham níveis baixos de IL-10 mRNA (p = 0,001 para OS, painel esquerdo da figura 6B;. P 0,001 para RFS, painel direito da figura 6B.). Como esperado, o pior OS e RFS foram observadas em doentes com um haplótipo não-ATA e os níveis elevados de IL-10 ARNm (Fig. 6c). Estes resultados sugerem que a IL-10 ou haplotipo de IL-10 de expressão de mRNA em tecidos tumorais de pulmão pode ser usado para prever os resultados dos doentes.

regressão multivariada de Cox foi usado para explorar se a IL-10 de haplótipos ou níveis de mRNA podem ser independentemente prever o resultado do paciente, após o ajuste para vários parâmetros, incluindo idade, sexo, tabagismo, histologia do tumor, e estágio do câncer. Como mostrado na Tabela 3, os doentes com o haplotipo não teve ATA horas de 1,431 e 1,556 para a mais curta OS e RFS, respectivamente, em comparação com pacientes com haplótipo ATA (IC de 95%, 1,104-1,856, P = 0,007 para OS; 1.200- 2.018, P 0,001 para RFS). A duração média para OS e RFS em pacientes com o haplótipo não-ATA foram de 24,1 e 16,8 meses, respectivamente, em comparação com 40,9 e 30,9 meses, respectivamente, para o haplótipo ATA. As taxas de sobrevida em 5 anos para pacientes com haplótipos não-ATA e ATA foram 28,2% vs. 43,3% para OS e 22,2% vs. 36,2% para RFS. O valor prognóstico independente dos níveis de ARNm de IL-10 também foi demonstrado em um subconjunto de população estudada. Pacientes com níveis elevados de ARNm de IL-10 teve menor sobrevida mediana e 5 anos taxa de sobrevivência para OS e RFS do que os pacientes com níveis de IL-10 mRNA baixas (Tabela 3; 30,2 meses versus 52,1 meses, 30,7% vs. 48,7%, P = 0,017 para OS; 17,2 meses versus 35,9 meses, 19,2% vs 45,1%, P = 0,001 para RFS). As horas de IL-10 mRNA para OS e RFS aumentou em relação a horas de IL-10 haplótipo (1.553 vs. 1.431 para OS; 1.755 vs. 1.556 para RFS). Mais interessante, horas de pacientes com ATA não haplótipo mais alto nível de mRNA de IL-10 foi aumentada 1,431-1,892 para OS e 1,556-2,344 para RFS quando comparados com pacientes com haplótipo ATA mais baixo nível de mRNA de IL-10. O aumento em HRs não foi observada em doentes com o haplotipo ATA mais elevados de IL-10 ARNm ou em pacientes com ATA não haplótipo e baixo nível de ARNm de IL-10. Estes resultados parecem sugerir que a IL-10 haplótipo ou IL-10 nível de mRNA pode prever de forma independente sobrevivência e recidiva em pacientes com NSCLC ressecados.

Discussão

O SNPs de IL-10 em -1082 G A, -819 C T, e -592 C A são CCG, ACC, e haplótipos ATA, respectivamente [36], [40]. A expressão de IL-10 ARNm em células do sangue periférico é mais elevada em indivíduos com um ou dois haplótipos CCG, seguido por ACC transportadoras /ACC, e, em seguida ATA /ACC e transportadores ATA /ATA [36], [40], [41] . No presente estudo, haplótipos não-ATA e ATA foram categorizados pelos três GCC, ATA, e haplótipos ACC de IL-10 promotor (Fig. 1). Um valor prognóstico pobre para OS e RFS foi encontrado para o GCC, ACC, e portadores-ATA não (Tabela S1). No entanto, o significado prognóstico das três operadoras só foi revelado em pacientes em estágio final, não em pacientes em estágio inicial desta população de estudo (Tabela S1). Por outro lado, a IL-10 os níveis de expressão de mRNA foram significativamente maiores nos transportadores com ≥1 número de cópias de GCC em que transportadoras sem GCC (IL-10 ARNm de CCG versus não-CCG: 147,90 ± 56,80 vs 31,72 ± 7,91, P 0,001). Nenhuma diferença na IL-10 expressão de mRNA foi observada para portadores ACC (IL-10 mRNA para ACC versus não-ACC: 57,69 ± 15,43 vs. 31,15 ± 11,36, P = 0,166). Isto foi consistente com um relatório anterior, indicando que os portadores de haplótipos do CCG tinham um risco de câncer de pulmão mais elevado do que outras operadoras [6]. Além disso, a IL-10 de nível de ARNm foi maior em haplótipo não-ATA ATA que no haplótipo (Fig. 2). Portanto, no presente estudo, a IL-10 haplótipos foram avaliadas quanto ao seu significado prognóstico em doentes com NSCLC.

A associação entre a IL-10 e a progressão do tumor tenha sido frequentemente explicada pelas alterações na supressão imunitária e tumor vigilância imunológica [ ,,,0],1] – [4], [42]. No presente estudo, os resultados consistentes foram observadas em

in vitro

experimentos com PBMC co-cultivadas com células de câncer de pulmão e no

in vivo

observações de TIL em tecidos tumorais (Fig. 4). Estudos anteriores utilizando ratinhos transgénicos que expressam a IL-10 mostraram que estes ratinhos desenvolveram tumores maiores do que os ratinhos de controlo. Este resultado sugere que a IL-10 impede que as respostas imunitárias eficazes contra a progressão do tumor [43]

relatórios anteriores mostraram que a IL-10 tem significado prognóstico diferente em pacientes com câncer de pulmão precoce e em estágio final [23]. – [25]. Na presente população de estudo, mais pobres OS e RFS foram observadas em fase final de (III) pacientes com a ATA não haplótipo que em pacientes com o haplótipo ATA (HR, 1.785, P 0,001 para OS; HR, 2.071, P 0,001 para RFS; Tabela S1); no entanto, nenhum valor prognóstico foi observado para início de carreira (I + II) pacientes (Tabela S1). Quando comparado com toda a população do estudo, os pacientes em estágio final teve RHs mais elevados para OS e RFS (1.785 vs. 1.431 para OS; 2.071 vs. 1.556 para RFS; Tabela S1). Isto poderia ser explicado por níveis significativamente mais elevados de ARNm de IL-10 em pacientes de fase final com o haplótipo não-ATA do que com o haplótipo ATA (87,26 ± 28,83 vs 10,87 ± 4,53, P = 0,011); no entanto, a diferença entre haplótipos não-ATA e ATA foi marginalmente observada em pacientes em estágio inicial (54,13 ± 18,49 vs. 14,52 ± 7,47, P = 0,050). Além disso, o significado prognóstico da TIL no OS e RFS também foi mostrado em pacientes em estágio final, não em pacientes em estágio inicial (p = 0,012 para OS, P = 0,003 para a RFS; Tabela S2). Portanto, sugerimos que a ATA não haplótipo, com um maior nível de expressão de IL-10 mRNA, pode ser mais importante na promoção da agressividade do tumor em pacientes em estágio avançado do que em pacientes em estágio inicial.

Em resumo, IL-10 haplótipos podem ser prontamente determinadas a partir de amostras de sangue do doente e pode ser útil na previsão de sobrevivência e de recaídas em pacientes com NSCLC operados. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que mostra que a IL-10 haplótipos podem ser usados ​​para prever OS e RFS em pacientes com NSCLC. Por isso, propomos que os haplótipos de IL-10 promotor SNPs podem ser potenciais biomarcadores para predição de sobrevivência e recidiva em pacientes com NSCLC ressecáveis.

Informações de Apoio

Tabela S1. A análise multivariada

da influência da IL-10 haplótipos na sobrevida global ea sobrevida livre de recidiva em pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas de acordo com a fase.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039525.s001

(DOC)

Tabela S2. A análise multivariada

da influência do tumor infiltrando linfócitos sobre a sobrevida global ea sobrevida livre de recidiva em pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039525.s002

(DOC)

Reconhecimentos

FASCS Calibur foi realizada no Centro de Instrumento de Chung Shan Medical University, que é apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência, Ministério da Educação e Chung Shan Medical University.

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