Abstract

EMT (transição epitelial-mesenquimal) é crucial para as células cancerosas para adquirir fenótipos invasivos. Em células de adenocarcinoma do pulmão A549, TGF-β induzida EMT em Smad-dependente forma e TNF-α acelerado este processo, tal como foi confirmado por morfologia celular, expressão de marcadores EMT, capacidade de lise de gelatina e invasão celular. TNF-α estimulou a fosforilação da região ligante Smad2, e este efeito foi atenuada pela inibição da MEK ou da JNK via. A análise da expressão completas genes desvendados diferencialmente regulados por TGF-β e TNF-α, tais como citocinas, quimiocinas, factores de crescimento e de ECM (matrizes extracelulares), o que sugere a alteração drástica na sinais autócrino /parácrino assim como as interacções célula-ECM. análise integrada da assinatura microRNA nos permitiu identificar um subconjunto de genes potencialmente regulados por microRNAs. Entre eles, que confirmou a indução de TGF-β-mediada de miR-23a em linhas de células epiteliais do pulmão, os genes-alvo dos quais foram adicionalmente identificados pelo perfil de expressão de genes. Combinado com as abordagens in silico, determinamos HMGN2 como um alvo a jusante de miR-23a. Estes resultados fornecem uma linha de evidências de que os efeitos do TGF-β e TNF-α foram parcialmente mediada por microARNs, e lançar luz sobre a complexidade dos acontecimentos moleculares desencadeados pelo TGF-β e TNF-α.

Citation : Saito A, Suzuki HI, Horie M, Ohshima M, Morishita Y, Abiko Y, et al. (2013) Um perfil de expressão integrado revela genes alvo de TGF-β e TNF-α possivelmente mediado por microRNAs em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 8 (2): e56587. doi: 10.1371 /journal.pone.0056587

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de agosto de 2012; Aceito: 11 de janeiro de 2013; Publicação: 20 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Saito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por KAKENHI (Grants-in-Aid para a Investigação científica) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia e subsídios do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é o tipo de câncer mais freqüente, que causa a morte de mais de um milhão de pessoas a cada ano. Compreensão dos eventos moleculares que governam invasiva propagação metastática /das células cancerígenas é crucial para o desenvolvimento de novas terapias de câncer de pulmão. Epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é a chave de diferenciação dirigir células epiteliais para adquirir fenótipos mesenquimais, que desempenha papéis importantes durante o desenvolvimento embrionário, bem como a invasão do cancro /metástase. A marca de EMT é a regulação negativa da E-caderina e a subsequente perda de aderência célula-célula, que é acoplado com um aumento da expressão de marcadores mesenquimais, incluindo o N-caderina e vimentina. Além disso EMT é acompanhado com célula de alterações morfológicas de “cuboidal” para aparências ‘fusiformes’, que correspondem a reorganização da actina e alterações cytoskeltal, levando a aquisição do fenótipo migratória de fibroblastos-like [1], [2].

factor de crescimento transformante (TGF) -β desempenha um papel central na regulação da EMT e apresenta os seus efeitos pleiotrópicos através da ligação a receptores de tipo I (TβR-I) e tipo II (TβR-II). Após a formação do complexo heteromérico induzida pelo ligando entre TβR-I e TβR-II, TβR-I é fosforilada por TβR-II e medeia a sinalização intracelular específica através da fosforilação de Smads regulados pelo receptor (R-Smads: Smad2 e Smad3 para o TGF-β) . Fosforilada R-Smads interagir com e Smad4 se translocar para o núcleo, onde regulam a transcrição de genes alvo [3], [4]. TGF-β é frequentemente sobre-expressa em tecidos de tumor, e facilita a progressão do cancro através de um repertório diverso de interacções de células de tumor autónomos e de acolhimento-tumorais, incluindo o aumento da motilidade celular e a invasão, que envolve o processo de EMT [5].

evidências acumuladas desvenda os mecanismos moleculares pelos quais as respostas inflamatórias promovem a progressão tumoral [6]. Factor de necrose tumoral (TNF) -α é uma das mais potentes citoquinas pró-inflamatórias produzidas no microambiente tumoral. Após estimulação, IKK activado (IkB cinase) fosforila inibidor de NFkB (IkB) e provoca a sua rápida degradação através de proteólise de proteassoma, resultando na libertação de NFkB, que, em seguida, transloca-se para o núcleo e induz uma miríade de expressão de genes envolvidos na resposta imune [7 ]. A contribuição de NFkB sinalização para a iniciação e progressão do cancro é claramente documentada, e várias linhas de evidência demonstram que o TNF-α e /ou a sinalização de NFkB desempenha um papel fundamental na regulação da EMT [8], [9], [10 ].

não-codificante microRNAs (miRNAs) atraem cada vez mais atenção como componentes-chave de sinalização celular, que regulam níveis de múltiplas proteínas de expressão, principalmente por se ligar à região 3 ‘não traduzida (UTR) de alvos. papéis importantes para miARNs foram mostrados na progressão tumoral por modulação da diferenciação celular, proliferação, invasão e metástase. MicroRNA-200 (miR-200) e miR-205 estão criticamente envolvidas na manutenção do fenótipo de células epiteliais e são suprimidos por TGF-β [11]. Também está relatado que o miR-21 e miR-31 são sinergicamente induzida por TGF-β e TNF-α, o que facilita a invasão de células do cancro [12].

Estudos recentes têm mostrado que o TNF-α aumenta TGF- EMT β-mediada em câncer /pulmão células epiteliais [13], [14], [15], sugerindo que os potenciais crosstalks entre esses sinais. No entanto, pouco se sabe sobre os eventos moleculares como esses sinais são orquestradas para modular EMT. Demonstrámos previamente que o TGF-β induz EMT em células do adenocarcinoma A549 do pulmão [16], que abrigam uma mutação K-ras activação e formam um tumor com histologia adenocarcinoma bem diferenciado quando injectada subcutaneamente em ratinhos imunocomprometidos [17], [18] . No presente estudo, exploramos os mecanismos subjacentes de EMT mediados por TGF-β e TNF-α em células A549. Em busca dos genes-alvo e miRNAs, realizamos análises de expressão abrangente em combinação com no rastreio silico. Estes dados delineado subconjuntos de genes diferencialmente ou cooperativamente regulados por TGF-β e TNF-α, e identificado miR-23a como um miARN alvo de TGF-β. Estas análises implícita ainda mais a possibilidade de que um subconjunto de genes alvo de TGF-p pode ser regulada por miARNs, fazendo luz sobre a complexidade dos acontecimentos moleculares desencadeados pelo TGF-β e TNF-α em células de cancro de pulmão.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

TGF-β1 e TNF-α foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e R D Systems (Minneapolis, MN), e eram utilizado na concentração de 5 ng /ml e 10 ng /ml, respectivamente. Anti-Smad2, fosforilada (fosfo) Smad2 em Sor 245/250/255, fosfo-Smad2 em Ser 465/467, Smad3, fosfo-Smad3 em Ser 423/425, Smad4, Erk, fosfo-Erk, p38, fosfo- p38, fosfo-c-Jun e e-caderina eram anticorpos de Cell Signaling (Beverly, MA). O anticorpo anti-N-caderina foi da BD Pharmingen (Transduction Laboratories, Lexington, KY). anticorpo anti-α-tubulina foi da Sigma-Aldrich. O anticorpo anti-HMGN2 foi de Millipore (Darmstadt, Alemanha). LY-364947 (TβR-I inibidor) foi usada na concentração de 3 uM. U0126 (MEK 1/2 inibidor), SP600125 (inibidor de JNK) e SB203580 (inibidor de p38) foram utilizados na concentração de 25 uM.

Cultura celular

células de adenocarcinoma do pulmão A549 [19] foram dotados de celular Resource Center for Biomedical Research, Instituto de Desenvolvimento, Envelhecimento e Câncer, Universidade de Tohoku (Sendai, Japão). NCI-H441 (H441) células de adenocarcinoma de pulmão e células HEK293T foram da American Type Culture Collection. As células transformadas humanas epiteliais brônquicas (células BEAS2B) foram adquiridos da Cúpula Pharmaceuticals International (Tóquio, Japão). As células foram fotografadas usando um microscópio de contraste de fase (Olympus, Tóquio, Japão). circularidade celular foi medida por software de imagem NIH J.

A transfecção

reagente Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) foi utilizado para transfecção de siRNA em células A549, e concentração final de ARNip foi de 20 nM. Humano Smad4 siRNA (discrição ARNi VHS41118) e ARNsi de controlo negativo foram adquiridos a partir de Invitrogen. As células transfectadas foram cultivadas durante 48 horas e semeadas à mesma densidade de células, seguida de incubação com TGF-β1 e /ou TNF-α. Para avaliar o efeito de miR-23a, 10 nM de precursor sintético de miR-23a (pré-miR-23a) ou um controlo negativo marcado com Cy3 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) foi transfectado em células A549, utilizando o reagente Lipofectamina RNAiMAX. A eficiência de transfecção julgado por Cy3 fluorescência foi mais do que 95% tal como foi confirmado por citometria de fluxo. Para a análise de micro-arranjo, amostra de ARN foi recolhido 48 h após a transfecção.

A análise de imunotransferência

As células foram colocadas em gelo e lavadas com PBS, depois lisadas em tampão de lise (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de Nonidet P-40) suplementado com inibidores de protease e fosfatase para imunoblotting. Após a centrifugação a 15000 rpm durante 15 minutos, os lisados ​​celulares foram quantificadas para teor de proteína por BCA Kit de ensaio de proteína (Pierce, Rockford, IL) e quantidades iguais de proteínas totais foram processadas para SDS-PAGE, seguido de transferência semi-seco das proteínas para membrana de nitrocelulose. A ligação não específica de proteínas para a membrana foi bloqueada por incubação com Amersham ECL Primeiro Agente de bloqueio (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) em tampão de TBS-T (Tris-HCl a 50, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween- 20). As proteínas imunotransferidas foram detectadas com o sistema ECL blotting e sistema de imagem /Ez-Captura LightCapture (ATTO, Tóquio, Japão).

Isolamento de ARN e RT-PCR

O ARN total foi isolado utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A síntese de cDNA foi realizada utilizando SuperScript First-Strand III Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante. A análise por RT-PCR quantitativa foi realizada usando Mx-3000P (Stratagene, La Jolla, CA) e QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). O nível de expressão foi normalizada para a da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (

GAPDH). As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S1. MicroRNA foi isolado utilizando o Kit de miRNeasy Mini (Qiagen). Maduro miR-23a foi transcritos de modo inverso, e PCR quantitativa foi realizada utilizando ensaios de TaqMan microRNA (Applied Biosystems). O nível de expressão foi normalizada para a da U6.

Gelatina zimografia

O meio condicionado sem FBS foram recolhidas e quantidades iguais de proteína foram misturadas com 4 x tampão de amostra não redutor de SDS-PAGE. As amostras foram aplicadas a um 10% (w /v) de gel de poliacrilamida impregnado com 1 mg /mL de gelatina (Sigma-Aldrich). Após a electroforese, o SDS foi removido a partir do gel, por lavagem 3 vezes durante 20 min em 2,5% de Triton X-100 a solução. Em seguida, os géis foram incubados durante a noite com agitação suave a 37 ° C em tampão (Tris-HCl a 50, pH 7,6, 5 mM de CaCl

2, 200 mM de NaCl, 0,02% de Brij35). O gel foi corado com 0,5% azul de Coomassie R250 em 50% de metanol e 5% de ácido acético durante 2 horas à temperatura ambiente, e subsequentemente descorado com solução de ácido acético a 40% de metanol-10% até as bandas tornou-se clara.

invasão ensaio

ensaio de invasão celular foi realizada utilizando cultura de células inserções com tamanho de poro de 8 um (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). A superfície superior da câmara foi revestida com factor de crescimento reduzida Matrigel (BD Biosciences). As células A549 (4 × 10

5 células /poço) ressuspendeu-se em meio livre de soro foram semeadas no lado superior da câmara. No lado inferior da câmara, o meio de crescimento suplementado com 10% de FBS foi adicionado. TGF-β1 e /ou TNF-α foram adicionados em ambos os lados da câmara. Após 24 h, as células na superfície inferior da câmara foram tripsinizadas, ressuspensas em PBS e contadas com um hemocitómetro. As experiências foram realizadas com três vias, e repetido 3 vezes. Os dados são apresentados como a média da razão de comparação com o controlo, de 3 experiências independentes.

perfil de expressão

A expressão de genes de perfis foi realizada utilizando um Gene Humano GeneChip® 1,0 ST Array (Affymetrix , Santa Clara, CA). O processamento de micro-arranjo foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A expressão de 19,734 genes foi monitorado, e os dados foram importados para o software GeneSpring GX (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) para a seleção de genes induzidos ou reprimidos.

A expressão de microRNAs 1223 maduras foi perfilado usando matriz miRCURY LNA do Exiqon, 6ª geração (Filgen, Nagoya, Japão). Resumidamente, as amostras de ARN foram verificadas para a integridade de ARN em Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Wilmington, DE), marcado com Hy3, e hibridado. As lâminas foram digitalizados usando GenePix®4000B (Molecular Devices, Union City, CA), e as imagens foram digitalizadas com matriz-Pro Analyzer Ver. 4.5 (Media Cibernética, Silver Spring, MD). Finalmente, os dados foram normalizados e expressa como aumento vezes com o MicroArray dados Analysis Tool Ver. 3.2 (Filgen).

Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, CA) foi utilizado para o mapeamento de dados de expressão de genes em vias relevantes com base em anotação funcional do gene e interações moleculares conhecidas. Para a análise integrada de miRNA e mRNA assinaturas, o Filtro de miRNA alvo no IPA foi empregado, que extraiu possíveis interações miRNA-RNAm com base nos bancos de dados como TarBase, miRecords e TargetScan.

luciferase Reporter Assay

Pri-miR23a vector de expressão foi gerado por clonagem do fragmento curto de pri-miARN contendo pré-miARN e sequência flanqueadora em pcDNA6.2-GW /EmGFP miR-(Invitrogen). Para a construção do repórter, o segmento da 3’UTR do gene HMGN2 humano foi clonado no vector repórter de luciferase. As sequências iniciadoras usadas são dadas na Tabela S2. células HEK293T foram transfectadas com cada construção repórter com ou sem vector de expressão pri-miR23a utilizando FuGENE6 (Roche, Basileia, Suíça). A proporção de Renilla para a luciferase do pirilampo foi medida utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI).

Resultados

TNF-α Melhora TGF-β mediada por EMT em A549 as células do cancro do pulmão

primeiro, caracterizado o efeito de TGF-β e /ou TNF-α na EMT em células de câncer de pulmão A549. Na confluência, as células A549 exibido aparências paralelepípedos-like e tratamento TGF-β levou para a célula alteração morfológica de forma alongada. TNF-α também foi potente na indução de alterações morfológicas em células fusiformes aparências. Como relatado anteriormente, a co-estimulação de TGF-β e TNF-α resultou em alteração dramática da forma da célula de fibroblasto aparências [14], que foi claramente distinguível das observadas nas células tratadas com TGF-β ou TNF-α sozinho ( Figura 1A, os painéis superiores).

(A549), as células foram pré-tratadas com um LY-364947 (TβR-I inibidor) ou controlo de DMSO, durante 60 minutos, a cultura prosseguiu com 5 ng /ml de TGF-β1 e /ou 10 ng de TNF-α /ml durante 48 h, e analisadas por microscopia de contraste de fase. Bar: 50 mm. circularidade (B) celular foi medida utilizando software de imagem para quantificar J mudança morfológica de células após o tratamento descrito. (C) análise de imunotransferência de E-caderina e N-caderina nas células A549 estimuladas com TGF-β1 e /ou TNF-α durante 48 h na presença ou ausência de LY-364947. a-tubulina foi utilizada como controlo de carga. (D) zimografia. As células A549 tratadas como descrito foram cultivadas com meio livre de soro para adicional de 48 h. Os meios condicionados foram recolhidos e a mesma quantidade de proteína foi sujeito a electroforese. digestão de gelatina por MMP-2 e MMP-9 foi visualizado por coloração com azul de Coomassie. (E) Ensaio celular invasão. As células que migraram através das inserções de cultura revestidas com Matrigel foram tripsinizadas e contadas. Cada experiência foi efectuada em triplicado e as razões relativas em média de 3 experiências independentes foram apresentados. As barras de erro: SD. *

P

. 0,05 (t de Student)

Em seguida, examinaram o efeito da TβR-I Kinase Inhibitor, LY-364947. O bloqueio da sinalização de TGF-β endógena por LY-364947 resultaram na morfologia celular uniformemente cubóide, e o efeito de TGF-β exógeno foi claramente abolida na presença de LY-364947. Por outro lado, a mudança morfológica celular de TNF-α mediada ainda foi observada, embora em menor extensão, nas células pré-tratadas com LY-364947, indicativo do efeito do TNF-α sozinho exercida na ausência de endógena TGF-β sinalização (Figura 1A, os painéis inferiores).

Estas alterações morfológicas foram quantificadas através da medição da circularidade celular (Figura 1B). Nas células costimulated com TGF-β e TNF-α, circularidade celular foi marcadamente reduzida, o que sugere o efeito sinérgico sobre a morfologia celular. Na presença de LY-364947, os seus efeitos foram principalmente inibido, o que implica a contribuição crítica do TGF-β para o efeito sinérgico observado.

O processo de EMT é acompanhada por regulação negativa da E-caderina e a regulação positiva de N -cadherin, que é designada como chave caderina [1], [2]. Nas seguintes experiências, foi examinada a expressão de E-caderina e N-caderina, como marcadores epiteliais e mesenquimais, respectivamente. A expressão da E-caderina foi revogada principalmente por meio de tratamento de TGF-β enquanto que o TNF-α isolado demonstrou um efeito marginal sobre a regulação negativa da E-caderina ao nível da proteína (Figura 1C). Consistente com a mudança na expressão de E-caderina, N-caderina foi regulada positivamente por tratamento com TGF-β ou TNF-α. Além disso, de acordo com a alteração dramática da morfologia celular, o TNF-α aumentou o efeito de TGF-β em marcadores epiteliais /mesenquimais. O efeito de TGF-β na expressão de E-caderina /N-caderina foi inibida por LY-364947 enquanto que sobre-regulação de TNF-α mediada por N-caderina, também foi observada independentemente do tratamento LY-364947.

EMT é acompanhada de aumento das actividades de protease que facilitam a degradação da membrana basal e matriz extracelular (ECM) de células tumorais vizinhas, o que é essencial para a invasão de tumor /metástase. Para analisar as actividades proteolíticas das metaloproteinases de matriz (MMPs) em células tratadas com TGF-β e /ou TNF-α, foi realizada zimografia de gelatina (Figura 1D). TGF-β aumentou a actividade da MMP-2, enquanto o TNF-α melhorada, que de MMP-9. Notavelmente, a co-estimulação com TGF-β e TNF-α promovida drasticamente as actividades tanto de MMP-2 e MMP-9, sugerindo que o efeito sinérgico para aumentar as actividades de MMP. Na presença de LY-364947, o efeito de TGF-β foi claramente inibida, ao passo que o efeito do TNF-α para melhorar a MMP-9, a actividade foi ainda observada embora em menor extensão, na ausência de sinalização de TGF-β endógena.

Para examinar o aspecto funcional de EMT, foi realizado ensaio de invasão, que utiliza câmaras revestidas com Matrigel, mimetizando a membrana basal. TGF-β ou tratamento TNF-α resultou no modesto aumento do número de células invasoras sobre a face inferior das câmaras, enquanto que a co-estimulação com TGF-β e TNF-α levou a capacidade invasiva aumentada, de acordo com as alterações acima observadas (Figura 1E). tratamento TGF-β não conseguiu melhorar a capacidade invasiva tão robustas como as alterações nos marcadores de EMT, sugerindo que alterações nos marcadores não estão directamente ligadas à célula de invasão. O processo de invasão inclui motilidade celular melhorada e atividades proteolíticas. Juntamente com os resultados da zimografia de gelatina, o aumento da capacidade invasiva de células costimulated com TGF-β e TNF-α parece estar relacionado com as actividades de MMP melhorados.

Tomados em conjunto, EMT TGF-β mediada foi claramente aumentada por TNF-α como julgado por morfologia celular, marcadores EMT, lise gelatina e invasão celular. TNF-α sozinho também poderia induzir parte destas alterações, mesmo na presença de LY-364947, tal como supra-regulação de N-caderina e de activação de MMP-9. Estas observações levaram-nos a explorar as possíveis crosstalks entre TGF-β e TNF-α, e os eventos moleculares que regulam EMT em células A549.

EMT TGF-β-mediada é Smad-dependente

Smads são a principal transdutor de sinalização de TGF-β; Smad2 e Smad3 são fosforilados por formam complexos com Smad4 TβR-I, e. Estes complexos acumular no núcleo e regulam a transcrição de genes alvo [20]. Além Smad transcrição mediada, TGF-β ativa outras cascatas de sinalização, incluindo as vias de MAPK (quinase de proteína activada por mitogénio) [21].

Para examinar se a sinalização mediada Smad está envolvido na regulação da EMT em A549 células, nós derrubado endógena Smad4, que é comumente exigido para a regulação da transcrição Smad-mediada. Transfecção de siRNA eficazmente silenciadas expressão Smad4 (Figura 2A, esquerda), e suprimiu ainda mais a expressão de genes alvo Smad-regulados de TGF-β, tais como Smad7 e PAI-1 (activador do plasminogénio inibidor-1, também conhecido como o

SERPINE1

) (Figura 2B). Nesta configuração, o TGF-β falhou para regular negativamente a E-caderina, tal como avaliado por RT-PCR quantitativo (figura 2A, à direita), sugerindo que o TGF-EMT mediada por β é regulado, principalmente, por via de Smad. Estes efeitos foram ainda confirmada por imunotransferência. TGF-β falhou para regular negativamente a E-caderina ou regular positivamente N-caderina eficientemente quanto as células transfectadas de ARNsi de controlo quando endógena Smad4 foi silenciada (Figura 2C).

(A-B) As células A549 foram transfectadas com ARNsi de Smad4 ( Si Smad4), ou ARNsi de controlo negativo (Si NTC) e cultivadas durante 48 h. As células foram ainda cultivadas com 5 ng /ml de TGF-β1 e /ou 10 ng /ml de TNF-α durante 2 h (B) ou 24 h (A), e o ARN foi recolhido. PCR quantitativa foi realizada por Smad4, E-caderina, Smad7 e PAI-1 no tempo indicado. A expressão foi normalizada para a da GAPDH. As barras de erro: SD. (C) Os lisados ​​celulares foram recolhidos após 48 h de TGF-β1 e /ou tratamento TNF-α. A imunotransferência foi realizada para E-caderina, N-caderina e Smad4. α-tubulina foi utilizada como controle de carga.

TNF-α fosforila Smad2 Linker Região de

domínios MH2 MH1 e C-terminal N-terminal R-Smad e Smad4 contêm conservados, flanqueando o segmento de ligação. interacção induzida pelo ligando de R-Smads com resultados activados TβR-I na fosforilação directa de SSXS motivo C-terminal [20], que é o caso da tecla de activação de Smad. Além disso, outras vias de cinase mais regular Smad sinalização através da fosforilação da região do ligador de R-Smads [21], [22]. Além de sinalização de NFkB, o TNF-α é conhecido para induzir as vias de MAPK, que são constituídas de três subfamílias, ou seja extracelular quinase regulada por sinal (Erk) 1 e 2, p38 MAPK e a quinase c-Jun N-terminal (JNK).

Para explorar o potencial da modulação de sinalização de Smad por TNF-α, investigou-se a fosforilação das regiões C-terminais ou ligantes de R-Smads. TGF-β induzida fortemente a fosforilação de Smad2 e Smad3 regiões C-terminais ao passo que o TNF-α não mostrou qualquer efeito. Por outro lado, a estimulação de TNF-α conduziu à fosforilação da região do ligador de Smad2, independentemente da estimulação de TGF-β (Figura 3A).

células A549 (A) foram estimuladas com TGF-β1 e /ou TNF-α durante 60 min e imunotransf erência foi realizada para o total de Smad2, Smad2 (região ligante: Ser 245/250/255) fosforilada, Smad2 (região C-terminal: Ser 465/467) fosforilado, o total de Smad3, Smad3 fosforilada (C- região terminal: Ser 423/425). (B) As células A549 foram pré-tratadas com DMSO ou inibidores químicos (LY-364947, U0126, SP600125 e SB203580) durante 60 min, seguido de estimulação de TNF-α. Os lisados ​​celulares foram recolhidos a pontos de tempo indicados, e imunotransf erência foi realizada para de Smad2, Smad2 (região ligante: Ser 245/250/255) fosforilada, Erk, Erk fosforiladas, p38, p38 fosforilada e fosforilada C-junho α-tubulina foi utilizada como controlo de carga.

Em seguida, ainda mais procurados para elucidar quais quinase está envolvida na fosforilação de TNF-α-mediada de região ligante Smad2, utilizando inibidores químicos, tais como LY-364947, U0126 , SP600125 e SB203580 (Figura 3B). a estimulação de TNF-α conduziu à fosforilação de Erk, p38 e c-Jun, um substrato de JNK. a estimulação de TNF-α também induziu a fosforilação do ligante de Smad2 em 30-120 minutos, atingindo um pico aos 60 min. LY-364947 não conseguiu suprimir este efeito, que mostra o efeito do TNF-α independente de TβR I-quinase actividade. Dos inibidores testados, o TNF-α mediada por fosforilação ligante Smad2 foi anulada pelo U0126, um inibidor da MEK, que também pode abolir a fosforilação de Erk, um substrato a jusante de MEK. O inibidor de JNK, SP600125 aboliu a fosforilação de c-Jun, um substrato a jusante de JNK, e parcialmente inibiu a fosforilação ligante Smad2. O inibidor de p38 MAPK, SB203580 não conseguiu afectar a fosforilação de Smad2 ligante na concentração demonstrou ser eficaz em relatórios anteriores.

Estes resultados sugerem que o TNF-α induz fosforilação da região ligante Smad2, que possa modular de genes Smad-regulada transcrição [22]. Este efeito parece ser em grande parte mediada pela MEK-Erk via JNK e, provavelmente, também pode desempenhar um papel, ainda que em menor grau (Figura 3B).

Microarray Analysis Exibe Diferencial Regulamento Gene por TGF-β e TNF- α

Para obter conhecimentos abrangentes sobre as mudanças de transcrição que ocorrem em cima do TGF-β e /ou tratamento TNF-α, perfil de expressão do gene foi realizado. Amostras de RNA total foram preparados a partir de células A549 tratadas com TGF-β e /ou TNF-α durante 2 h ou 24 h, e foram ainda analisados ​​por análise de microarray (Figura 4A). Os transcritos induzida 1,5 vezes ou reprimido. 0,67 vezes, incluindo os que não anotada, foram listados no ficheiro S1 e S2 do arquivo (os dados entre 2 h e 24 h, respectivamente)

(A ) representação gráfico de dispersão dos transcritos nas amostras tratadas com TGF-β1 e /ou TNF-α durante 2 h ou 24 h (eixo dos Y), em comparação com as de controlo não estimulado (eixo X). As transcrições são traçados usando dados normalizados log2. O limiar dos níveis de transcrição foi definido como induzida 2,0 vezes ou reprimido 0,5 vezes, e é indicada no diagrama de dispersão cada. (B) de Venn diagrama que ilustra a sobreposição entre os genes regulados positivamente (para cima) ou regulados negativamente (para baixo) por TGF-β1 e /ou tratamento TNF-α durante 2 h ou 24 h. O limiar dos níveis de transcrição foi definido como induzida 2,0 vezes ou reprimido 0,5 vezes. Os números indicam o número de genes anotados. representação trama (C) de dispersão de miARNs maduros nas amostras tratadas com TGF-β1 e /ou TNF-α durante 24 h (eixo X), em comparação com as de controlo não estimulado (eixo Y). O limiar dos níveis de miARN foi definido como induzida 2,0 vezes ou reprimido 0,5 vezes, e é indicada no diagrama de dispersão cada. (D) RT-PCR quantitativo para madura miR-23a. A549, células H441 e BEAS2B foram tratados com TGF-β1 durante 24 h. Expressão foi normalizada para a da U6. . As barras de erro: SD

Para uma análise mais aprofundada, vamos definir o limite de níveis de transcrição induzido 2,0 vezes ou reprimido 0,5 vezes, e excluiu as transcrições não anotadas. Assim, foram identificados genes com expressão alterada em comparação com o controlo não estimulado, em 3 conjuntos comparativos, isto é, o TGF-β-estimulado, o TNF-α-estimulado e grupos de TGF-β /TNF-ct-estimulada (Figura 4B).

Como uma tendência geral,-TGF-β regulado e genes TNF-alfa-regulado foram em grande parte exclusivos, exibindo regulação diferencial da transcrição de genes. Além disso, os genes regulados positivamente foram identificados muito mais do que aqueles regulados negativamente. Os genes induzidos pelo TNF-α foram mais proeminentes do que o TGF-β em 2 horas, ao passo que o número de genes regulados positivamente por TGF-β foi muito maior às 24 h em comparação com as que estão em 2 h, ou os de TNF-α. Ao fim de 24 h, havia uma fracção de genes que foram regulados negativamente cima ou por TGF-β e co-estimulação de TNF-α, mas não qualquer um deles.

Em seguida, empregou os conjuntos de dados publicados de micromatriz, que eram realizada em células A549 estimuladas com TGF-β [23], [24]. Considerando indução . 2,0-vezes mais significativa, foram extraídas potenciais genes alvo TGF-β comumente induzidas em três estudos independentes, ou seja, genes em 17 de 2h, e 129 genes às 24 h, os quais são mostrados no S3 Ficheiro

os subconjuntos de genes diferencialmente ou cooperativamente reguladas por TGF-β e TNF-α

Vários factores de transcrição têm sido implicado na repressão transcricional de e-caderina, incluindo

SNAI1

(caracol),

SNAI2

(Slug),

ZEB1

,

ZEB2

e

TWIST1

[25], [26]. Destes,

SNAI1

foi rapidamente induzida por TGF-β a 2 h enquanto que o TNF-α em vez suprimidos-lo, o que implica os mecanismos diferenciais para regular EMT. Ao fim de 24 h, a E-caderina (

CDH1

) foi claramente regulados negativamente por TGF-β (0,27 vezes), enquanto que o efeito supressor de TNF-α foi modesto (0,78 vezes). Em conformidade, o TGF-β e TNF-α regulada positivamente a expressão de N-caderina (

CDH2

) até 2,32 vezes e 1,47 vezes, respectivamente. Também foi observado o efeito sinérgico de TGF-β e TNF-α no que respeita à regulação da transcrição da

CDH1

e

CDH2

, consistente com os resultados na Figura 1.

Além disso, os genes regulados positivamente mais do que 3,0 vezes a 2 h ou 24 h, foram subclassificados e listados na Tabela 1 e 2, de acordo com as funções conhecidas. Como uma resposta aguda em 2 h, o TNF-α potentemente induzida uma série de citocinas /quimiocinas, tais como

CCL2 (MCP-1),

CCL5 (RANTES),

CCL20

,

CXCL1

,

CXCL8

(IL8),

IL1A

,

IL1B

e

IL6

. Sinalizando componentes da via de TNF-α-NFkB também foram upregulated incluindo

TNF

,

TRAF1,

NFKB1

,

NFKBIA

e

NFKBIE

. Além disso, as moléculas de adesão celular, tais como

VCAM1

e

ICAM1

foram induzidos. Às 2 h após a estimulação, TGF-β induzida número limitado de genes, incluindo os alvos diretos conhecidos, tais como

SMAD7

e

HEY1

. Em 24 h, a estimulação de TGF-β levou a uma maior expressão de vários genes categorizados como (i) regulador de pequena GTPase, (ii) a molécula de adesão celular, e (iii) ECM, enquanto que a estimulação de TNF-α só mostrou efeitos mínimos sobre eles.

Reguladores de pequena GTPase incluídos fatores de câmbio nucleótido guanina (GEFs) tais como

RASGRP1

,

RASGRP3

,

RASGRF2

,

DOCK2

e

DOCK4

, que ativam Ras, Rac e Rap1, bem como os membros de GTPases da família Rho tais como

RND1

e

RHOU

. a motilidade celular e alterações morfológicas são regulados por pequenas GTPases tais como famílias Ras, Rac, Cdc42 e Rho, o que pode ser modulada a jusante de sinalização de TGF-β [27].