Sumário

Nós já mostrou que a L-arginina (Arg) se acumula nos tecidos de cancro colorrectal. O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo pelo qual Arg acumula e determinar o seu significado biológico. A concentração de Arg e citrulina (Cit) no soro e tecidos tumorais de cancro colorectal pacientes (CRC) foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A expressão de transportadores Arg foi analisada quantitativa por RT-PCR (qRT-PCR), e análise imuno-histoquímica de tissue microarray. Nós também transfectada a linha celular de cancro do cólon HCT-116 com ARNsi específico para o transportador Arg CAT-1 e mediu a indução da apoptose por citometria de fluxo e a proliferação de células pelo ensaio MTT. Consistente com nossos resultados anteriores, as concentrações séricas Arg e Cit em pacientes com câncer colorretal foram significativamente menores do que aqueles em voluntários normais, enquanto que as concentrações Arg e Cit em tecidos de câncer colorretal foram significativamente maiores do que em tecidos normais adjacentes do cólon combinados. RT-PCR quantitativa mostrou que o

CAT-1

gene foi altamente sobre-expresso em 70,5% de amostras de tecido de cancro colorectal em relação a tecidos de cólon normais adjacentes em todos os 122 doentes com cancro colo-rectal. A análise imuno-histoquímica de microsséries de tecido confirmou que a expressão de CAT-1 foi mais elevada em todos os 25 tecidos de cancro colo-rectal testadas. CAT-1 siRNA induzida significativamente a apoptose de células HCT-116 e, subsequentemente, o crescimento celular inibido em 20-50%. Os nossos resultados indicam que a acumulação do crescimento das células L-Arg e Cit e em tecidos de cancro colorectal está associada com sobre-expressão do CAT-1 gene do transportador de Arg. Nossos resultados podem ser úteis para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico molecular e terapia-alvo para o cancro colorectal

Citation:. Lu Y, Wang W, Wang J, Yang C, Mao H, Fu X, et al. (2013) sobre-expressão de Arginina Transporter CAT-1 está associado ao acúmulo de L-Arginina e Crescimento celular no tecido câncer colorretal humano. PLoS ONE 8 (9): e73866. doi: 10.1371 /journal.pone.0073866

editor: Joao P. B. Viola, Instituto Nacional do Câncer (INCA), o Brasil

Recebido: 20 Janeiro, 2013; Aceito: 31 de julho de 2013; Publicação: 06 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (81172157) para Bingguan Chen. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos e na China, apesar de melhorias no tratamento ao longo dos últimos anos [1], [2]. As opções de tratamento para CRC incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapias específicas, entre as quais a cirurgia continua a ser o mais eficaz. No entanto, mesmo com o tratamento abrangente o prognóstico ainda é pobre para pacientes com doença D estágio Dukes, com uma taxa de sobrevida em 5 anos global de 6,6% -11,9%. Com uma melhor compreensão da patologia molecular do câncer, recentemente desenvolvido terapia alvo combinada com 5-FU e quimioterapia baseada em oxaliplatina demonstrou melhor evolução em pacientes metastáticos CRC (CCRm). No entanto, apenas cerca de 20% dos casos com CCRm responder às opções de terapia-alvo atuais [3].

reagentes terapêuticos alvo atualmente aprovado para uso em mCRC incluem Bevacizumab (Avastin ™, Genentech /Roche, CA, EUA), um anticorpo monoclonal alvo para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e cetuximab (Erbitux ™, ImClone Systems, New Jersey, EUA) ou panitumumab (Vectibix ™, Amgen, CA, EUA), os anticorpos monoclonais direcionados para o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Os inibidores de tirosina cinase (TKI), tais como gefitinib, erlotinib e são outra classe de reagentes direccionados para EGFR. Bevacizumab é vulgarmente utilizado em combinação com agentes quimioterapêuticos padrão (por exemplo, 5-FU) como um tratamento de primeira linha para os pacientes com mCRC e melhora a sobrevivência global destes pacientes por aproximadamente 5 meses. No entanto, os efeitos secundários tais como hipertensão, anorexia, proteinúria, e perfuração gastrointestinal têm limitado a sua aplicação em alguns casos. EGFR está directamente envolvida na proliferação celular e na progressão metastática, tanto através de RAS /RAF /MAPK e fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) vias de sinalização. O efeito da terapia anti-EGFR depende se o tumor tem uma mutação KRAS; A terapia anti-EGFR não é eficaz para pacientes com uma mutação no códon 12 ou 13 de KRAS. Portanto, um grande esforço está em andamento para estudar biomarcadores para CRC e desenvolver novos tratamentos, a fim de aumentar a taxa de sobrevida em 5 anos e melhorar a qualidade geral de vida dos pacientes com esta doença [1].

Vários estudos mostraram que os níveis elevados de poliaminas e níveis alterados de enzimas limitantes da velocidade envolvidas na biossíntese e catabolismo tanto no cancro do cólon e outros cancros vários. Há evidência de que o crescimento do tumor requer absolutamente poliaminas para a proliferação de células de cancro [4], portanto, a via de poliamina é reconhecido como um alvo racional para quimioprevenção e agentes quimioterapêuticos [4], [5], [6]. Poliaminas são produzidas pela acção da ornitina descarboxilase (ODC) na ornitina que é produzido pelo catabolismo de L-arginina (Arg) por arginases que são sobre-expressos em células de cancro [4], [7], [8]. Consistente com esta via de biossíntese, várias linhas de evidência demonstraram que Arg é necessária para o desenvolvimento e progressão de cancro [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Ambos

in vitro

e

in vivo

estudos têm demonstrado que Arg é necessário para a proliferação de células de câncer, especialmente quando a síntese Arg endógena está bloqueado devido a deficiente argininosuccinato sintetase expressão (ASS) [10], [11], [12], [13]. Para a manutenção do tumor células cancerosas sobre-expressar a enzima óxido nítrico sintetase endotelial (eNOS), que consome grandes quantidades de Arg [15], [16]. Devido à muito acelerado metabolismo Arg em células cancerosas, Arg tratamento privação tem sido desenvolvido para o tratamento de cancros que são ASS negativo, tal como carcinoma hepático, carcinoma de células renais, e cancro da próstata [10], [11], [12], [13 ].

Quando Arg é catabolized pela NOS, o co-produto do nO caminho, Cit, podem ser reciclados por ASS e liase argininosuccinato (ASL) para sintetizar Arg endogenamente através da citrulina-nO ou arginina-citrulina via [17], [18], [19]. Embora a síntese de Arg de Cit ocorre a um nível baixo, em muitas células, Arg síntese intracelular pode aumentar marcadamente sob certas circunstâncias fisiológicas ou patológicas que afectam a homeostase de circular ou intracelular Arg e Cit. Portanto, o efeito do tratamento sobre o cancro privação Arg depende do facto de a via de síntese endógena é deficiente. Estudos anteriores mostraram que os carcinomas do pulmão e cólon humanos eram quase sempre positivo para ASS [20]. Além disso, perturbação de L-Arg biodisponibilidade está associada a diversas doenças, incluindo insuficiência cardíaca, deficiência imunológica, e progressão do cancro [9], [21], [22], [23].

No estudo de imunologia do cancro, os linfócitos infiltrantes de tumor, macrófagos, e células dendríticas foram encontrados para ser funcionalmente deficiente em tecidos de cancro devido à baixa disponibilidade Arg no microambiente tumoral [18], [21], [24]. Com base nestes resultados experimentais de alguns grupos iniciaram o tratamento Arg suplementação para pacientes de cancro [25]. No entanto, há controvérsia sobre o papel da suplementação com Arg ou Arg privação no tratamento do cancro, em grande parte porque não existem dados diretos sobre a biodisponibilidade precisa da Arg no microambiente tumoral, especialmente no CRC. Para esclarecer esta questão, foi desenvolvido um método para determinar o nível Arg no sangue e tecido CRC [26], [27]. Nos nossos estudos preliminares observou-se concentrações baixas de Arg e o seu metabolito Cit no soro de pacientes de CRC e concentrações mais elevadas de Arg e Cit nos tecidos de cancro. Aqui, determinou-se ainda mais a disponibilidade de Arg no microambiente tumoral e investigou o mecanismo subjacente ao aumento do nível intracelular Arg através da análise da expressão de transportadores Arg e Arg síntese endógena enzimas de SEA e ASL em tecidos de CRC. Nossos resultados indicam que o metabolismo é acelerado Arg na CRC e identificar o transportador de SLC7A1 Arg como um alvo molecular potencial para a terapia CRC.

Métodos

Amostras e HPLC

Soro, tumor tecido, e o tecido do cólon normal adjacente foram simultaneamente obtidos a partir de amostras cirúrgicas de pacientes de CRC. Um total de 122 tecidos tumorais pareadas e amostras de tecido do cólon normal adjacente foram coletados de 122 pacientes de CRC (79 homens e 43 mulheres), com idade média de 60 ± 11 anos (variando de 37 a 79 anos) do Departamento de Cirurgia da Shanghai Hospital Changzheng. Os pacientes incluídos 27 com câncer de flexão sigmóide, 5 com câncer de cólon descendente, 46 com câncer retal, 16 com câncer de cólon ascendente, e 28 com câncer de cólon transversal cólon. Todos os pacientes foram diagnosticados como patologicamente adenocarcinoma (Tabela 1). O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Tongji University School of Medicine, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos. As amostras de tecido para determinar a expressão de transportadores Arg foram armazenadas a -80 ° C até à análise. Entre 122 amostras pareadas foram coletadas 30 amostras duplas de tecidos e amostras de soro separadamente para HPLC para determinar ainda mais a concentração de Arg e Cit. Não fomos capazes de testar todos os indivíduos, devido à disponibilidade limitada da amostra. O soro de 28 voluntários saudáveis ​​que receberam verificação anual da saúde e não tiveram nenhuma evidência de doenças foram coletadas como controle. As características demográficas de 28 voluntários saudáveis ​​e em 30 pacientes com cancro colo-rectal são mostrados na Tabela 2.

Os níveis de L-Arg e L-Cit no soro e no tecido foram determinados por RP-HPLC usando detecção por ultravioleta como já relatado recentemente [24], [25]. O tecido tumoral e normal foram pesados ​​com precisão, e 0,1 g de tecido foi homogeneizada em 0,5 mL de ácido tricloroacético (0,1 g /ml) num banho de gelo. Os homogenatos foram transferidos para tubos de centrífuga Eppendorf e analisada de forma semelhante às amostras de soro. O conteúdo analítico foi calculada usando a curva padrão ou equação regressiva. Os níveis de L-Arg e L-Cit em soros foram expressas em umol /L e os níveis de L-Arg e L-Cit em tecidos foram expressos como ug /g.

quantitativa Transcrição Reversa Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR

)

O ARN foi isolado a partir de tecidos colorrectais utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). O ADNc foi imediatamente reversamente transcrito a partir de ARN isolado com SuperScript III Síntese da primeira cadeia do sistema (Invitrogen, Carlsbad, CA). Quantitativa de RT-PCR foi realizada utilizando o kit de SYBR Green PCR (Qiagen, Valencia, CA). Os iniciadores utilizados para cada um dos genes de transporte de arginina estão listados na tabela S1. GAPDH foi usada como um controlo interno para a comparação dos dados. Quantitative PCR foi realizada utilizando o Biosystems 7900HT Aplicada (ABI, Foster City, CA), e o método comparativo Ct foi utilizado para avaliar as mudanças relativas nos níveis de ARNm entre duas amostras.

tissue microarray

micromatriz de tecido embebido em parafina (CO951, EUA Biomax, Rockville, MD) foi usado para a análise imuno-histoquímica como previamente descrito [28]. arranjo de tecido foi processado com recuperação de antigénio induzida por calor utilizando 10 mM de tampão de citrato de sódio, pH 6,0. A matriz foi então corado com CAT-1 anticorpo (Abcam, Cambridge, MA) e visualizados usando um kit de coloração DAB.

Cultura de Células

A linha de células de cancro do cólon humano HCT 116 foi comprado de o Cell Bank da Academia chinesa de Ciências e cultivadas em um umidificado, 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C. O meio de cultura utilizado foi 5A meio de McCoy (Sigma, St. Louis, MO) contendo 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor a v /v (FBS).

A transfecção de pequeno RNA interferente (siRNA)

não-targeting siRNA (Sint) e SICAT-1 (Santa Cruz, Dallas, TX) foram usadas a uma concentração de 10 nM e transfectado em células HCT 116 usando Lipo 2,000 reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo o fabricante de instruções. Após 24 h, as células foram semeadas em lâminas de câmaras ou placas de 24 poços, e deixadas a crescer durante mais 24-48 h antes do isolamento do ARN ou do início das experiências. Knockdown da expressão do gene foi confirmada por Q-PCR.

citometria de fluxo e análise Proliferação celular

O número de células apoptóticas foi determinada utilizando o mAb anti-anexina V (BD, Franklin Lakes, NJ) e analisadas por citometria de fluxo, tal como descrito na literatura [29]. A proliferação celular foi determinado pelo kit de ensaio MTT (R D Systems, Minneapolis, MN). conforme as instruções do fabricante

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 14.0 software. As concentrações de Arg e Cit são expressos como a média ± desvio padrão (média ± DP). As diferenças nos valores médios entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. A

P

-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Os níveis séricos de Arg e Cit foram menores em pacientes com câncer colorretal do que em indivíduos normais

Para estender nossas descobertas anteriores, medidos Arg soro e Cit em outros 30 pacientes com CCR e confirmou que as concentrações séricas Arg e Cit foram significativamente menores nos pacientes com CCR do que em indivíduos normais (Tabela 3). A concentração de soro Cit foi 39,22 ± 13,33 nmol /L em pacientes com CCR, em comparação com 86,27 ± 23,54 nmol /L em controlos normais, e o nível de soro correspondente de Arg 84,83 ± 26,18 nmol /L e 117,72 ± 40,19 nmol /L, respectivamente . Estes resultados são consistentes com os de nosso estudo preliminar.

Acumulação de Arg e Cit no tecido do cancro da CRC pacientes

Para expandir nossas descobertas anteriores de maior disponibilidade de Arg e Cit em tecidos CRC investigou-se a razão para a reduzida concentração de Arg e transportadores presentes no soro de pacientes de CRC. Com base no requisito para Arg na proliferação de células cancerígenas que se espera um maior consumo de Arg em tecidos CRC. Portanto, medimos níveis Arg e Cit em tecidos CRC e encontrou uma acumulação dramática de Arg e Cit (Figura 1). Ambas as concentrações de Arg e Cit eram de duas vezes superior no tecido tumoral do que no tecido do cólon normal a partir do mesmo paciente. Estes resultados eram reprodutíveis em 30 pacientes com CCR. O nível Arg em tecidos de câncer colorretal foi 45,26 ± 17,59 mg /g em comparação com 27,34 ± 11,59 mg /g nos tecidos do cólon normal (

P Art 0,005), enquanto o nível Cit em tecidos CRC foi 11,01 ± 4,16 ug /g em comparação com 5,60 ± 2,61 ug /g no tecido do cólon normal (

P

0,01, Quadro 4 e na Figura 2). Estes resultados indicam que a biodisponibilidade de Arg e Cit é elevado em tecidos de cancro do cólon, o que pode contribuir para os níveis mais baixos de ambos Arg e transportadores presentes no soro de pacientes com CCR, como relatado anteriormente [26].

A painel superior (a) mostra o resultado de o tecido normal adjacente emparelhado sigmóide flexão em um paciente com cancro do cólon sigmóide. O painel inferior (b) mostra o resultado de tecido de cancro do cólon sigmóide flexão no mesmo paciente. O indivíduo marcados picos (1) e (2) representam L-citrulina e L-arginina, respectivamente.

concentrações de ambos Arg e Cit foram significativamente mais elevados em tecidos de cancro colorectal em comparação com os tecidos normais de cólon adjacentes emparelhados (

P Art 0,05 e

P Art 0,01, respectivamente). As concentrações detalhadas e análises estatísticas são apresentados na Tabela 4.

superexpressão do CAT-1 em tecidos CRC pela Análise qRT-PCR

A acumulação de Arg e Cit em tecidos CRC estimulou uma investigação sobre a identidade do transportador relevante e a possibilidade de que ele pode regular a progressão do câncer. Os catiônicos ácidos aminados transportadores (os gatos), uma subfamília da família portadora de soluto 7 (SLC7A), são os principais transportadores responsáveis ​​pela Arg influxo. Há quatro confirmada proteínas de transporte de aminoácidos catiônicos, CAT-1 (SLC7A1), CAT-2A (SLC7A2A), CAT-2B (SLC7A2B) e CAT-3 (SLC7A3). A função de SLC7A3 humana e SLC7A4 é desconhecida, enquanto os chapéus de 4F2hc /y + LAT1 e 4F2hc /y + Lat2 (SLC3A2 /SLC7A7 e SLC7A6) aceitar tipo L catiônicos e aminoácidos neutros. Medimos a expressão de genes que codificam para estes transportadores de arginina em CRC emparelhados e tecidos normais adjacentes de cancro a partir de 122 pacientes com CRC utilizando qRT-PCR.

Como se mostra na Figura 3, quando mais do que três vezes a sobre-expressão foi definido como o valor de cut-off,

expressão-1 CAT

gene foi elevada em tecidos CRC em 86 de 122 pacientes (70,5%), nos quais o nível de expressão de CAT-1 em tecidos CRC foi 3.6- para 181 vezes mais elevada do que nos tecidos de cólon normais, enquanto que a expressão de SLC7A2A e SLC7A2B foi elevado em apenas 6/122 e 12/122 (4,9 e 9,8%) pacientes, respectivamente. Observamos também que a expressão SLC7A4 foi elevada em 8/122 (6,6%) pacientes. Expressão de SLC3A2, SLC7A6, e SLC7A7 foi elevada em 8, 14 e 12 dos 122 pacientes, respectivamente (6,6%, 11,5% e 9,8%) (Figura 3). Os nossos resultados indicam que a sobre-expressão de CAT-1 pode ser um contribuinte principal para a acumulação de Arg na CRC tecidos.

A expressão de ARNm de CAT nos tecidos de cancro colo-rectal foi medida por qRT-PCR, e a sobre-expressão foi definida como pelo menos 3 vezes maior do que a expressão no tecido do cólon normal. A Figura mostra a percentagem de amostras com superexpressão ( 3 vezes) de genes arginina transportadores individuais among122 amostras de tecido de CRC. O

CAT-1