3D HA-base

Abstract

Para estudar as funções individuais de ácido hialurônico interagindo proteínas no câncer de próstata (PCA ) motilidade através dos tecidos conjuntivos, foi desenvolvido um novo ensaio tridimensional (3D) de ácido hialurónico (HA) de hidrogel que fornece uma alternativa flexível, quantificável, e fisiologicamente relevante para os métodos actuais. Invasão neste sistema reflecte a prevalência de HA em tecidos conjuntivos e o seu papel na promoção da motilidade de células de cancro e invasão de tecidos, fazendo com que o sistema ideal para estudar invasão através de medula óssea ou outros tecidos conjuntivos de HA-ricos. O processo de cross-linking bio-compatível foi utilizado permite o encapsulamento direta de células cancerosas dentro do gel quando adoptam uma morfologia distinta, o cluster-like. células CaP metastático nesses hidrogéis desenvolver estruturas semelhantes a dedos, “invadopodia”, de acordo com suas propriedades invasivas. O número de invadopodia, bem como o tamanho do aglomerado, forma, e a convergência, pode proporcionar uma medida quantificável do potencial invasivo. Entre as proteínas que interagem hialuronano candidato que poderiam ser responsáveis ​​pelo comportamento observou-se, descobriu-se que a cultura no hidrogel HA desencadeia células CaP invasivos para expressar diferencialmente e localizar o receptor de hialuronano mediada motilidade (RHAMM) /CD168 que, na ausência de CD44, parece contribuir para CaP motilidade e invasão por interacção com os componentes de hidrogel de HA. invasão de células CaP através do hidrogel HA Também se verificou que dependem da actividade de hialuronidase. Estudos apresentados aqui revelam que enquanto a atividade de hialuronidase é necessário para invadopodia e inter-conectar a formação de cluster, a actividade por si só não é suficiente para a aquisição de capacidade de invasão de ocorrer. Assim, sugerimos que o desenvolvimento do comportamento invasivo em sistemas baseados em 3D-HA requer o desenvolvimento de características celulares adicionais, tais como a activação da motilidade associada vias que regulam a formação de invadopodia. Assim, relatamos o desenvolvimento de um sistema 3D passíveis de dissecção de processos biológicos associados à motilidade celular câncer através de-HA ricos tecidos conjuntivos

Citation:. Gurski LA, Xu X, Labrada LN, Nguyen NT, Xiao L, van Golen KL, et ai. (2012) de ácido hialurônico (HA) proteínas que interagem RHAMM e hialuronidase Impacto do cancro da próstata Comportamento celular e formação Invadopodia em hidrogéis 3D HA-base. PLoS ONE 7 (11): e50075. doi: 10.1371 /journal.pone.0050075

editor: Sharon Gerecht, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de junho de 2012; Aceito: 15 de outubro de 2012; Publicação: 16 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Gurski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (www.nih.gov) P01CA098912 (MCFC) e P20RR016458, P20RR017716, R01DC008965 (XJ), a National Science Foundation (www.nsf.gov) DMR 0.643.226 (XJ) e IGERT 0.221.651 (LG) e Delaware Saúde Ciência Alliance (DASIS) (www.delawarehsa.org) (XJ), o Departamento de Defesa (www.defense.gov) PCRP W81XWH-05-1-0005 e W81XWH-08-1-0356 ( KLVG) e PCRP W81XWH-11-1-0564 (LG), e do Centro de Pesquisa do Câncer Translational (www.udel.edu/ctcr). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A maioria dos pacientes que morrem de tumores sólidos a cada ano sofrem de metástases ósseas [1]. Os três tipos de cancro mais diagnosticado, próstata, pulmão e mama, metastizar para o osso. metástase óssea diminui drasticamente a qualidade de vida devido à dor, fraturas e hipercalcemia [2]. Além disso, a presença de metástases ósseas reduz as taxas de sobrevivência. Para o câncer de próstata (PCA), a taxa de sobrevivência de cinco anos para a doença local é de 100%, enquanto a taxa cai para 30% para a doença avançada com metástases distantes [1]. Actualmente, existem poucas terapias eficazes para o tratamento de metástases ósseas ou para prevenir metástases para o osso ou outros locais de [2]. Uma necessidade clínica definida existe, portanto, a desenvolver novas terapias para tratar e prevenir as metástases de osso, envolvendo células cancerosas invasivas motilidade que pode prontamente colonizam tecidos conjuntivos, tais como a medula óssea.

O estudo das vias que controlam a invasão de células do cancro ou da migração , e o desenvolvimento de novas drogas para prevenir estes processos requer sistemas que podem medir as propriedades invasivas de estas células [3], [4]. Actualmente ensaios de invasão e migração disponíveis são menos do que o ideal pelo facto de que muitas vezes: 1) são difíceis de quantificar, 2) são difíceis de adaptar aos comportamentos de células de cancro individuais, ou 3) empregar matrizes, tais como animais derivadas de Matrigel ™, que contêm factores de crescimento que complicar os resultados experimentais [3], [5], [6].

A matriz de medula óssea consiste em tecido macio, semelhante a gel conjuntivo rico em ácido hialurónico (HA) [7], [8]. HA é um glicosaminoglicano grande, não sulfatado composto de repetição de ácido β-1,4-D-glucurónico ligado e beta 1,3-unidades de dissacárido N-acetil-D-glucosamina [9]. HA é encontrado ubiquamente na matriz extracelular (ECM) de todos os tipos de células, mas é particularmente enriquecido em tecidos conjuntivos. As células podem ligar-se de HA através de vários receptores, incluindo o conjunto de diferenciação 44 (CD44) ou um receptor para a motilidade mediada pelo hialuronano (RHAMM) [10]. Em células de cancro, o RHAMM foi mostrado para ligar CD44 na superfície celular, e HA ligação a este complexo promove a jusante de sinalização resultando na activação de GTPase Rho e o aumento da migração de células [11], [12]. Ambos os níveis de expressão de CD44 RHAMM e têm sido associados a progressão de um certo número de cancros, incluindo CaP [13], [14].

Outra forma que as células interagem com HA é por degradá-la, através da expressão e secreção de hialuronidases (HAases). Relevante para CaP invasão são os HAases, Hyal-1 e Hyal-2, cuja expressão níveis têm sido implicados na CaP metástase [13], [15], [16]. Hyal-1 está ativo em baixas pHs de 3,5-3,8 e cliva qualquer HA de peso molecular em tetrâmeros [17]. Hyal-2 mostra a atividade ótima em pH 6,0-7,0 e se unirá alta HA de peso molecular em, 20 fragmentos de tamanho kDa intermediários [18]. Um, 57 kDa forma glicosilada da Hyal-1 pode ser segregada pelas células [19]. secreção HAase pode facilitar CaP metástase, permitindo que as células cancerosas para invadir a HA-rica matriz do tecido conjuntivo.

É importante ressaltar que HAases são alvos druggable, indicando seu uso potencial como alvos para retardar invasão e possivelmente prevenir a metástase [20], [21]. Um inibidor HAase, cromoglicato de sódio (DSC) [22], [23] é aprovado pela FDA para uso para aliviar os sintomas de alergia e asma, e apresenta baixa toxicidade em pacientes [24], [25]. A sua capacidade de inibir a invasão e metástase CaP não foi investigada.

anteriormente descrito o desenvolvimento de um hidrogel à base de HA para a cultura de células fracamente aderentes ósseas metastáticas CaP [26]. O hidrogel consiste em dois componentes HA quimicamente modificados,-aldeído transportando HA (HAALD) e ácido adípico de di-derivado HA (HAADH). Estes componentes de ligação cruzada através da formação de ligações de hidrazina, libertando a água como o único subproduto [27]. CaP células podem ser encapsuladas no hidrogel de HA durante o processo de reticulação. A viabilidade das células encapsuladas permanece elevada durante pelo menos uma semana [26]. Porque o HA é de origem bacteriana, é desprovida de fatores de crescimento eucarióticas que podem afetar o crescimento celular, invasão e migração.

Para estudar o desenvolvimento de propriedades invasivas das células CaP em uma matriz de tecido conjuntivo nativo, nós utilizada a série de células LNCaP de sublinhas de CaP humanos que foram desenvolvidos para imitar o processo de CaP metástase óssea. Estas células são consideradas como um dos melhores modelos de progressão CaP disponíveis devido à sua capacidade para formar lesões osteoblásticas clinicamente relevantes em ratos [28]. sublinhas individuais nas séries LNCaP refletem os passos na progressão da doença com células LNCaP que representa um tumor de próstata precoce que atingiu um nó de linfa nas proximidades, células C4 representando as células cancerígenas agressivas, localmente invasivos que sobrevivem após a castração, as células C4-2 representando agressivo, metastático doença, e células representativas C4-2B CaP castração resistentes metástases ósseas [29]. Usando estas células e o romance 3D HA sistema de invasão gel desenvolvemos, nós investigamos o papel dos receptores e HAases em CaP invasão e migração HA através de um tecido conjuntivo HA-rico como matriz. Para os fins deste trabalho que descreve o movimento de células APC nos hidrogéis 3D, que difere da migração através de superfícies de plástico, que descrevem a migração como a aparente movimento das células através de hidrogeles porosos evidenciado pela extensão de processos celulares que chamamos “invadopodia” e pela fusão de agrupamentos anteriormente separados nos hidrogéis.

Materiais e Métodos

Materiais

Eletroforese, cultura de células e reagentes de transfecção e suprimentos foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA) . substituição de soro definido TCM ™ foi adquirido a partir de MP Biomedicals (Solon, OH). O ácido hialurônico (sal de sódio, 500 KDa e 1,3 MDA) foi generosamente doada pela Genzyme Corporation (Cambridge, MA). anticorpos RHAMM (HMMR) e CD44 foram adquiridos a Novus Biologicals (Littleton, CO). Hyal2 e anticorpo β-actina foram adquiridos a Abcam (Cambridge, MA). anticorpo secundário-α-ratinho-HRP Equina foi adquirido a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticorpo HYAL1, hialuronidase testicular bovina (BTH), β-mercaptoetanol (βME), glicina, Tween® 20, albumina de soro bovino (BSA), formato de sódio, azul brilhante de Coomassie, cromoglicato de dissódio (DSC), e ácido desoxicólico foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). anticorpo secundário de cabra-α-coelho-HRP, os inibidores da protease (PI), tampão de amostra 5X, sulfo-NHS-SS-biotina e avidina agarose foram adquiridos a Thermo Scientific (Rockford, IL). de tampão de amostra de Laemmli e azul Alcian foram adquiridas de BioRad (Richmond, CA). tampão Tris, ácido acético glacial, metanol, de baixo ponto de fusão (LMP) de ágar, sulfóxido de dimetilo (DMSO), sulfato dodecilo de sódio (SDS), Triton X-100, e cloreto de sódio (NaCl) foram adquiridos a Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Nonidet P-40 foi adquirido a partir de Roche (Indianapolis, IL) e o etanol foi comprado de Decon Labs, Inc (King of Prussia, PA). Todos os compostos utilizados foram de grau reagente ou melhor.

Cultura celular

baixo número passagem células CaP foram mantidas em Corning (Lowell, MA) de cultura de tecidos de 75 frascos mm a 37 ° C em 5,0% ( v /v) CO

2 em t-meio suplementado com 5% (v v) de soro /fetal de bovino (FBS) e 100 U /ml de sódio da penicilina G e de sulfato de estreptomicina a 100 ug /ml em 0,085% (w /v ) solução salina (PS). O meio foi trocado a cada 2-3 dias. As células foram passadas em confluência de aproximadamente 80%, julgado por olho, utilizando 0,25% (w /v) de tripsina com ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) 4 • Na. sublinhas LNCaP [30] foram generosamente fornecidos pelo Dr. Leland Chung e células PC3 foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA).

Preparação de HAALD e HAADH

Para sintetizar o aldeído HA (HAALD ), reacção de oxidação de HA (1,3 MDA) foi realizada na presença de periodato de sódio sob condições aquosas. di-hidrazida adica (ADH) -Modified HA (HAADH) foi sintetizada por acoplamento mediado por carbodiimida de ADH com os grupos carboxilo do HA (500 kDa) em condições aquosas. Os procedimentos detalhados para a síntese e caracterização de ambos os derivados de HA foi relatado em nosso estudo anterior [26].

Cultura de Células em 2D e 3D Condições

HAALD e HAADH foram dissolvidos separadamente em Dulbecco salina tamponada com fosfato (DPBS) a uma concentração de 10 mg /mL durante a noite a 37 ° C. 2% (w /v) de agar LMP em DPBS foi preparado e foi fundido num heatblock C 70 ° (Labnet Internacional, Woodbridge, New Jersey), pelo menos, 1 hora antes de usar. derivados de HA dissolvido foram esterilizados por irradiação UV a 254 nm durante 15 minutos antes da utilização.

CaP células foram libertadas da sua balão utilizando 0,25% (w /v) de EDTA de tripsina 4NA e o número total de células foi contado utilizando um hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA). 100.000 (por placa de 24 cavidades) ou 600000 (para a placa de 6 poços), as células foram sedimentadas por cada cultura. inserções de cultura de células (Millipore, Billerica, MA, tamanho de poro: 0.4 mm, diâmetro 12 mm para a placa de 24 poços, em 30 mm para 6 placa poço) foram pré-molhado em t-forma depois colocados nos poços de uma de 24 cavidades ou 6-placa de cultura (Beckton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ). Para culturas 2D, sedimento de células foi misturado com t-meio (1 mL por placa de 24 poços, 4 mL para placa de 6 poços) e plaqueadas.

Para a cultura de hidrogel 3D HA, sedimento de células foi misturado com 100 ul (placa de 6 poços) (por placa de 24 cavidades) ou 300 ul de HAALD. Foi adicionado um volume igual de HAADH e a cultura foi bem misturada para dispersar uniformemente as células. A solução de hidrogel, em seguida, foram pipetados para inserções de cultura de células pré-molhadas e deixou-se solidificar durante cerca de 10 minutos a 37 ° C. T-forma (1 mL de 24 poços da placa, 4 mL para placa de 6 poços) suplementado com 1% (v /v) PS e quer 5% (v /v) de FBS e 2% (v /v) TCM ™ foi adicionado em torno do inserto e a cultura foi incubada a 37 ° C, 5% (v /v) CO

2. Esta concentração de TCM ™ é consistente com estudos anteriores que completam C4-2 cultura [31], [32].

Para a cultura de agar 3D, sedimento de células foi misturado com 85 ul (por placa de 24 cavidades) ou 510 ul (por placa de 6 poços) DPBS aquecida a 37 ° C. Pré-derretida 2% (w /v) de agar LMP foi adicionado à mistura /célula DPBS para uma concentração final de 0,3% (w /v) de agar LMP. cultura ágar foi incubada à temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos antes de pipetar para a inserção de cultura de células para prevenir gel de agar a partir de vazamento através dos poros da membrana. Uma vez colocadas em pastilha, o gel de agar foi deixado solidificar durante cerca de 10 minutos à temperatura ambiente. Solidificação foi realizada à temperatura ambiente, para acelerar a gelificação do agar mole. T-meio (1 mL por placa de 24 poços, a 4 mL por placa de 6 poços) foi subsequentemente adicionada em torno do inserto e a cultura foi incubada a 37 ° C, 5% (v /v) CO

2. Para todas as culturas, meio mudanças de meio foram efectuadas a cada dois dias.

e actividade de células metabólicas contagens foram realizadas para os tipos de células e condições de cultura descritas. Para medir a actividade metabólica das células, de tetrazólio solúvel em água salgada-1 (WST-1, Roche) de reagente foi utilizado como descrito [33] com as seguintes modificações: o ensaio foi realizado numa placa de 24 poços em células cultivadas de três ou seis dias. Reagente WST-1 (100 ul) foi aplicado a 1 mL de meio de cultura e a placa foi incubada a 37 ° C durante 1 hora. Após a incubação, 100 uL de meio de cultura foi removido e colocado numa placa de 96 poços. A absorvância foi medida a 450 nm num detector DTX880 multimodo (Beckman Coulter, Brea, CA). Para contar o número de células dentro do hidrogel HA, imagens de contraste de fase foram utilizados. Dentro destas imagens, um cluster de tamanho médio de célula com limites de células claras foi seleccionado e o número de células no agrupamento foi contado. Este número foi multiplicado pelo número total de pólos na imagem, produzindo uma contagem de células total aproximado por campo fotografado.

Invasão do ensaio de quantificação Métodos

Para todos os ensaios de invasão, imagens de contraste de fase foram tomadas de cada cultura de células utilizando um microscópio Nikon Eclipse TE2000-L (Tóquio, Japão) e uma objectiva de 10X. O número médio de invadopodia foi determinada por contagem do número total de invadopodia por campos fotografados para três réplicas biológicas. Um “invadopodium” foi definida como um processo celular fina que se estende para fora a partir de um grupo de células, e claro o suficiente para ser facilmente identificada a olho nu. A percentagem de glomérulos que se fundem foi calculada pela contagem tanto o número de clusters em contato físico com outro cluster eo número de clusters livres para três repetições biológicas. A partir destes valores, a percentagem de agregados fusão foi calculado e considerado um índice de migração em hidrogéis 3D. Em amostras em que foram observadas redes de grupos de células, um conjunto de célula única foi definida como uma área distinta, arredondada da rede celular, por vezes, parecendo conter uma densidade celular mais elevada. Para ambos os tipos de quantificação, cuidado foi tomado para assegurar a consistência quando as contagens foram cumpridas.

Reologia

reológico caracterização de amostras de hidrogel foram realizados em um reômetro controlado-stress (AR-G2, TA Instruments, New Castle, dE), com um padrão de aço geometria de placas paralelas 20 mm de diâmetro e em um intervalo de 100 mm. varre tempo oscilatórias dinâmicas foram realizadas a 25 ° C ou 37 ° C durante ágar e géis HA, respectivamente, e o armazenamento (G ‘) e de perda (G “) foram registados módulos. solução de agar a 30 ul (0,3% w /v) ou mistura HAADH /HAALD (1% w /v) foi carregado para a geometria que foi subsequentemente coberta com óleo mineral na borda para evitar a evaporação de água. Estas misturas foram deixadas a solidificar

in situ

como as medidas foram tomadas. varreduras tempo oscilatórios dinâmicos foram coletadas em freqüências angulares de 6 rad /s e 1% de deformação escolhidos a partir do regime viscoelástico linear [34]. Estas experiências foram repetidas pelo menos três amostras e em média, os dados são apresentados.

Proteína Extracção

As células combinadas a partir de dois poços de uma placa de cultura de 6 poços foram utilizados para experiências de extracção de proteína. BTH (180 ul a 10 mg /ml) foi aplicada e as culturas foram incubadas a 37 ° C durante 30 minutos. As culturas foram transferidas para tubos de centrífuga e as células foram sedimentadas por centrifugação durante 1 minuto a 3000 rpm. As células foram lavadas uma vez com DPBS. Radioimunoprecipitação (RIPA) de tampão (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,5% (w /v) de ácido desoxicólico, 1% (v /v) de Nonidet P-40, 0,1% (w /v) de SDS, DDH

2O, 200 ul) contendo PI foi aplicado aos peletes de células. Os lisados ​​foram incubados em gelo durante 45 minutos com vortex ocasional. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação a 13.000 rotações por minuto (rpm) durante 10 minutos. A concentração de proteína total a partir dos lisados ​​foi determinada utilizando um ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific) seguindo um protocolo padrão. Os lisados ​​foram armazenados a -20 ° C.

Western Blotting

Proteína (50 ug) foi misturada com tampão RIPA e tampão de 5X Pista Amostra e βME (3% (v /v) final, ) para um volume total de 25 ul. As amostras foram fervidas durante 5 minutos, depois arrefecida rapidamente e fiado. Amostras e uma escada de proteínas foram submetidas a electroforese sobre um gel de 4-12% NuPAGE Bis-Tris usando uma célula de electroforese SureLock ™ X-Cell e MOPS tampão de corrida. As amostras foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose utilizando um aparelho de transferência X-Cell ™ II e um tampão de transferência consistindo de 1,5125 mg /mL de Tris, 7,2 mg /mL de glicina e 0,01% (w /v) de SDS a uma configuração de 21V durante 1,5 horas.

A membrana foi bloqueada em 3% (w /v) de BSA em DPBS contendo 0,1% de Tween® 20 (PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Os anticorpos primários (1:10,000 para o RHAMM, 1:5000 para CD44 e β-actina, para 1:500 HIAL1 e Hyal2) em 3% (w /v) de BSA em PBST foram incubadas com a membrana durante 2,5 horas à temperatura ambiente com tremer. A membrana foi lavada 3 vezes, 10 minutos de cada vez, com PBST. anticorpos secundários (HRP de cabra 1:5000-α-coelho ou 1:10,000 equina-α-ratinho HRP) em 3% (w /v) de BSA (para HYAL1, Hyal2, e borrões β-actina) ou 3% (w /v) de leite magro seco (para o RHAMM e CD44 blots) foram incubadas com a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação. A membrana foi lavada 3 vezes, 10 minutos de cada vez, com PBST. Supersignal® Oeste Dura prolongado Substrato Duração (Thermo Scientific) foi preparado como dirigido e aplicado à membrana durante 5 minutos a temperatura ambiente com agitação. A membrana foi exposta usando BioMax luz de filme (Kodak, Rochester, NY) e desenvolvido num revelador SRX-101A (Konica Minolta Medical gráfico Inc, Tóquio, Japão). lisado de células PC-3 (50 ug) foi utilizada como um controlo positivo para CD44 Westerns.

Protocolo de imunocoloração

Células cultivadas em 2D foram cultivadas em um 8 bem Lab-Tek II Chambered lamela ( Nalge Nunc, Naperville, IL). O meio foi removido e as câmaras foram lavadas 2 vezes com DPBS. As células foram fixadas durante 10 minutos em 4% (v /v) de paraformaldeído (PFA) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) em ddH2O. O excesso de PFA foi removido e as câmaras foram lavadas duas vezes com DPBS. Triton X-100 em DPBS (0,2% (v /v)), foi preparado e aplicado a câmaras durante 10 minutos. O excesso de solução de Triton X-100 foi removido e as câmaras foram lavadas duas vezes com DPBS. As culturas foram bloqueadas em BSA a 3% em DPBS a 4 ° C (v /w) durante a noite. As células foram incubadas com solução 1:1000 (v /v) de anticorpos primários RHAMM ou CD44 em BSA a 3% a 4 ° C durante a noite. Uma solução 1:1000 (v /v) de DRAQ5 (Biostatus limitada, Leicestershire, Reino Unido) em DPBS foi aplicada durante 10 minutos à temperatura ambiente. Câmaras de novo foram lavadas com DPBS e Gel /Mount ™ (Biomeda, Foster City, CA) foi adicionado às câmaras para evitar a fotodegradação. As células foram visualizadas por microscopia confocal sobre um Zeiss LSM 510 VIS (Carl Zeiss, Maple Grove, MN).

células em 3D foram cultivadas em placas de 24 poços como descrito acima. grupos de células foram suavemente removidas a partir do hidrogel utilizando uma micropipeta. Clusters foram lavados cuidadosamente com 1 ml DPBS 2 vezes, de forma rápida centrifugação para recolher grupos de células de cada vez. Os clusters foram cuidadosamente ressuspensos em 4% (v /v) de PFA e transferidos para uma lamela 8 bem compartimentado. As culturas foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. Uma vez transferido para a lamela câmaras, foram utilizados os mesmos procedimentos de coloração que utilizado para cultura 2D. extremo cuidado foi tomado para reter a quantidade de aglomerados de células quanto possível durante cada passo de remoção de líquido.

A biotinilação da superfície celular Ensaio

C4-2 células foram cultivadas num frasco T-75 para cerca de 90% confluência. As células foram libertadas a partir do balão, suspenso em t-meio e contadas. As células foram lavadas três vezes em PBS arrefecido em gelo (pH 8,0, 5 mL). As células foram ressuspensas em PBS arrefecido em gelo (pH 8,0) até uma concentração final de 20 × 10

6 células /ml. Recentemente preparados, 10 mM de sulfo-NHS-SS-biotina (80 ul) foi adicionado à mistura de células e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. Tris 50 mM (pH 8,0, 2 ml) foi adicionado para desactivar a reacção de biotinilação, e o sedimento celular foi subsequentemente lavada duas vezes com PBS (pH 8,0, 2 mL). A lavagem final PBS foi removida completamente a partir da pelete de células, e tampão RIPA contendo PI (500 ul) foi aplicado ao sedimento celular. A reacção de lise foi incubada em gelo durante uma hora. O ligado foi clarificado por centrifugação a 12000 rpm durante 10 minutos, após o que o sobrenadante foi removido e armazenado a -20 ° C

Um ensaio BCA foi realizada no lisado biotinilado como descrito anteriormente.; Obteve-se aproximadamente 1,5 mg de proteína. de agarose avidina (1 ml) foi aplicada a um tubo de microcentrífuga e a resina foi resolvida por centrifugação 1 minuto a 2000 rpm. A resina foi lavada três vezes com tampão RIPA (500 ul). O lisado foi aplicada à resina e a mistura foi incubada num agitador rotativo tubo a 4 ° C durante a noite. A resina foi colonizada por centrifugação 1 minuto a 2.000 RPM e o ligado não ligado foi removido. lisado não ligada (10 ul) foi misturada com tampão Laemmli amostra contendo 5% (v /v) βME (10 ul). A resina foi lavada três vezes com RIPA contendo PI (500 ul). Tampão de amostra de Laemmli contendo 5% βME (50 ul) foi aplicado às pérolas. misturas contendo Laemmli foram fervidas durante 5 minutos, depois centrifugadas a 13.000 rpm. A suspenso biotinilado e fracção não ligada foram sujeitas a electroforese e transferida para nitrocelulose tal como descrito anteriormente. células CaP (PC3) lisado metastático do osso (10 ul) com tampão de amostra de Laemmli contendo βME (10 ul) foi incluído como um controlo positivo para a expressão de CD44. Western blot para CD44, RHAMM e GAPDH foram realizados conforme descrito na secção “Western Blotting”.

RHAMM Knockdown

C4-2 células foram mantidas em meio aos antibióticos livre para três dias antes a transfecção. Mixed 6 pmol /cm

2 duplex discrição RNAi ™ siRHAMM (GGCGUCUCCUCUAUGAAGAACUAUA e UAUAGUUCUUCAUAGAGGAGACGCC) e 0,5 ul /cm

2 Lipofectamine ™ RNAiMAX em Optimem® I para RHAMM knockdown ou 6 pmol /cm

2 baixo GC Discrição RNAi ™ duplex controle negativo e 0,5 l /cm

2 Lipofectamine em Optimem para controle de transfecção. misturas de transfecção foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente antes da aplicação às células. reacções de transfecção foram incubadas durante seis horas a 37 ° C e as placas foram suavemente rodado a cada hora para misturar os reagentes de transfecção.

A mistura de transfecção foi aspirado das células, e as células foram lavadas com DPBS. meio isento de antibiótico foi aplicada às células e as células transfectadas foram incubadas a 37 ° C durante a noite antes de usar para as experiências. Eficácia de RHAMM knockdown foi avaliada através de Western blot para RHAMM como descrito na secção “Western Blotting”.

hialuronidase Ensaio de Actividade

HAase Atividade foi examinada através de eletroforese em gel de substrato [35], [36 ]. Baixo peso molecular de HA Dissolveu-se durante a noite a 37 ° C em água destilada (0,17 mg /mL). Esta solução de HA foi usado em vez de água na preparação de um 12% (w /v) de gel de acrilamida ProtoGel® (National Diagnostics, Cherry Hill, NJ). LNCaP, C4, C4-2 e lisados ​​C4-2B ou 50 ug BTH foram misturadas com volumes iguais de tampão de amostra Lamelli (5% (v /v)) e carregada sobre o gel de HA contendo. O gel foi submetido a electroforese utilizando um tampão de X célula-célula de electroforese SureLock ™ e MOPS execução. O gel foi em seguida removido a partir da cassete e lavou-se durante uma hora à temperatura ambiente em 3% (v /v) de Triton X-100 em PBS. O gel foi então incubado num tampão de formiato-NaCl (0,1 M de sódio Formiato e cloreto de sódio 0,15 M dissolvidos em água destilada, pH 4,6) durante 16-20 horas a 37 ° C. O gel foi lavado duas vezes com água destilada, em seguida, incubadas com uma solução a 0,5% (w /v) de azul Alcian em 3% (v /v) de solução de ácido acético glacial durante uma hora para detectar a presença de HA. O gel foi lavado três vezes durante uma hora cada com uma solução de ácido acético a 7% (v /v) para descoloração e fixação. O gel foi em seguida lavada duas vezes com água destilada, e duas vezes com uma solução de metanol 50% (v /v), (v /v) de solução 10% de ácido acético glacial. Para detectar a presença da proteína no gel, que foi então incubada com um 0,25% (w /v) de Coomassie Brilliant Blue em 9% (v /v) de etanol, 45,5% (v /v) de ácido acético glacial durante uma hora. Isto foi seguido por três lavagens de uma hora com a solução de lavagem ácida de metanol /ácido acético.

Tratar culturas com HAase Inibidor

Uma solução de DSC a 125 mM foi preparada em 40% (v /v) DMSO e filtrou-se num filtro de Steriflip (Millipore) para esterilizar. DSC (3,33 ou 10 ul de 125 mM) foi adicionado a 800 ul de ou 2,4 ml de t-forma em 24 ou placas de 6 cavidades, respectivamente, a uma concentração final de 500 DSC? M, o valor de IC-50 do presente inibidor [37] . Uma quantidade igual de 40% (v /v) de DMSO foi usado como um controlo do veículo. O meio foi mudado de três em três dias e uma solução de DSC ou DMSO fresco foi aplicado tal como descrito.

Exclusão Trypan Blue

A toxicidade de DSC no CaP células foi determinada utilizando um ensaio de exclusão de azul de tripano. 600000 células foram plaqueadas em placas de 6 cavidades com forma T, 5% (v /v) de FBS, 1% (v /v) PS (4 mL). Após 24 horas de cultura, as culturas foram tratadas com DSC ou veículo de controlo como descrito anteriormente. Aos três e seis pontos no tempo do dia, o meio foi aspirado e as células foram libertadas com tripsina (250 mL). As células foram sedimentadas, em seguida ressuspensas em meio de 500 uL T. 50 uL de uma 0,4% (w /v) de solução de azul de tripano em solução salina isotónica tamponada foi adicionada a cada amostra. O número total de células e brancos (azul vivo) (mortos) foi determinada por contagem em um hemocitómetro. A percentagem de células vivas foi determinado a partir destes dados.

Análise Estatística

As barras de erro em todas as figuras exibir erro padrão da média (SEM). A significância foi determinada utilizando dois testes t de amostra bicaudal de Student com p . 0,05 considerado significativo

Resultados

Invadopodia e formação de cluster em 3D HA hidrogéis

Invadopodia e agrupamento formação resposta a factores motogenic.

em experiências iniciais, foram avaliados a morfologia das células C4-2 no sistema de cultura de células de hidrogel HA para determinar se as diferenças pode ser visto em resposta a FBS usado como um factor motogenic para estimular a motilidade. As culturas de controlo foram tratados com o TCM ™, um substituto de soro à base de plantas para manter o crescimento e viabilidade celular, sem a capacidade de promover a invasão e a migração. Enquanto TCM ™ tratada C4-2 células mostrou uma saída metabólica mais baixa em comparação com FBS, avaliada pelo ensaio de WST, não houve diferença significativa nas contagens de células estimados para as células em crescimento em qualquer condição em cada três ou seis pontos de tempo dia (ver Tabela S1). Foi observado e quantificado diferenças na morfologia de células nestes géis como uma medida de capacidade de invasão celular e capacidade de migração.

Como se mostra na Figura 1A, em ambos os pontos de tempo de três e seis dias, o TCM ™ tratada C4-2 culturas mostraram, aglomerados de células bem definidas menores principalmente desprovida de processos celulares invasivos (invadopodia). Em contraste, as culturas tratadas com FBS mostraram agregados de células maiores que apareceram mais irregulares na forma. Notavelmente, os grupos tratados de FBS foram observadas regularmente para se fundir em conjunto e apresentado um número considerável de invadopodia claramente evidentes em cada ponto temporal. A inserção da Figura 1A mostra a imagem ampliada destas estruturas invadopodia. Os grupos de células apareceu maior após seis dias do que depois de três dias para cada tratamento, mas o número de invadopodia foi relativamente constante entre os dois momentos.

Imagens de células C4-2 cultivadas durante três ou seis dias com 2 % TCM ™ (controlo) ou 5% de FBS (factor de motogenic) no ensaio de invasão hidrogel HA. Seta e inserir uma visualização ampliada da imagem para melhor invadopodia display. barras de escala representam Preto 200 mm, barra branca escala na inserção representa 50 mm (A). Quantificação de número médio de invadopodia (B) ou por cento fusão clusters (C) em cada campo trabalhada. As barras de erro = EPM, n = 3, *** p . 0,001

A quantificação do número de invadopodia revelou que o número destas estruturas foi significativamente maior (p 0,0001) do que para o tratamento de FBS para o tratamento de TCM ™ em ambos os pontos de tempo de três e seis dias (Figura 1B). O número de invadopodia não aumentou tanto para o tratamento entre os dois momentos. Quantificação de fusão percentual de cluster mostrou que FBS tratado grupos de células C4-2 eram mais propensos a ser a fusão em comparação com ™ células tratadas TCM para ambos os três e seis pontos no tempo do dia (Figura 1C). Agradecemos Drs.