Sumário

drogas perturbar microtúbulos inibir o tráfico lisossômico e induzir a permeabilização da membrana lisossomal seguido de morte celular dependente de catepsina. Para identificar as proteínas específicas relacionados com o tráfico que controlam a sobrevivência da célula e estabilidade lisossômico, nós analisamos uma biblioteca molecular siRNA do motor em células cancerosas da mama MCF-7 humano. SiRNAs segmentação quatro cinesinas (KIF11 /Eg5, KIF20A, KIF21A, KIF25), miosina 1G (MYO1G), uma cadeia pesada de miosina (MYH1) e tropomiosina 2 (TPM2) foram identificados como indutores eficazes da morte celular não apoptótica. A morte celular induzida por KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 ou TPM2 siRNAs foi precedida de permeabilização da membrana lisossomal, e todos os siRNAs identificados induzida várias mudanças no compartimento de endo-lisossômico,

ou seja

aumento do volume lisossômico (KIF11, KIF20A , KIF25, MYO1G, MYH1), aumento da atividade cisteína catepsina (KIF20A, KIF25), alterou a localização lisossômico (KIF25, MYH1, TPM2), o aumento da acumulação de dextrano (KIF20A), ou reduzido fluxo autofágica (MYO1G, MYH1). É importante ressaltar que todos os sete siRNAs também matou câncer humano cérvix (HeLa) e osteossarcoma (U-2-OS) e células cancerosas sensíveis aos tratamentos desestabilizar lisossoma,

ou seja

foto-oxidação, siramesine, etoposídeo ou cisplatina . Da mesma forma que KIF11 siRNA, o monastrol inibidor KIF11 permeabilização da membrana lisossomal induzida e sensibilizados várias linhas celulares de cancro de siramesine. Embora os inibidores KIF11 estão em desenvolvimento clínico como bloqueadores de mitose, os nossos dados revelam uma nova função para KIF11 no controle da estabilidade lysosomal e introduzir outros seis motores moleculares como alvos de drogas câncer putativos

Citation:. Groth-Pedersen L, S AITS , Corcelle-Termeau e, Petersen NHT, Nylandsted J, Jäättelä M (2012) Identificação do citoesqueleto-associados proteínas essenciais para a lisossomal Estabilidade e sobrevivência das células cancerosas humanas. PLoS ONE 7 (10): e45381. doi: 10.1371 /journal.pone.0045381

Autor: Michael Sherman, Boston University Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2012; Aceito: 17 de agosto de 2012; Publicação: 11 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Groth-Pedersen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo dinamarquês Cancer Society, o Conselho Dinamarquês de Pesquisa médica, o Ministério dinamarquês da Ciência, a Comissão Europeia FP7 (APO-SYS), a Fundação Nacional de Pesquisa Dinamarquês, o ML Jørgensen G. Hansen Foundation, a Fundação Alfred Benzon, a Fundação Meyer, o Nordisk Fundação Novo, Fundo Memorial do Landshövding Per Westling eo John e Fundação de Augusta Persson. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os lisossomos são vesículas ácidas contendo numerosos hidrolases, que degradam organelas e macromoléculas que lhes são entregues por autofagia, endocitose e fagocitose [1]. lisossomal síntese melhorada, tráfico e libertação extracelular de proteases lisossomais (catepsinas) são características importantes de cancro e estão associados com a capacidade metastática e invasiva de células cancerosas [2], [3], [4]. Interessantemente, estas alterações associadas à transformação de sensibilizar células de cancro para a via de morte celular lisossomal [5], uma forma de morte celular programada que pode assumir quando apoptose é inibida, como é o caso em muitos cancros [6]. morte celular lisossômico é caracterizada por permeabilização lisossômico e subsequente translocação de catepsinas para o citosol onde eles ativam a apoptose ou morte realizam sem ativação caspase [3].

Entre os medicamentos contra o câncer que ativam a morte celular lisossômico são microtúbulos-desestabilizando e -stabilizing drogas (

por exemplo, alcalóides de vinca e

taxanos), que inibem o tráfico lisossomal e induzem uma expansão do compartimento lisossómico seguido de ruptura lisossomal e morte celular dependente de catepsina [7], [8]. Infelizmente, tal perturbação do citoesqueleto grave também afeta os processos vitais nas células saudáveis ​​que conduzem a toxicidade em pacientes [9]. A segmentação mais específica do tráfico lisossômico pode, assim, melhorar a terapia consideravelmente.

dinâmica do citoesqueleto e transporte intracelular de vesículas, organelas e macromoléculas ao longo dos microtúbulos e actina citoesqueleto dependem motor proteínas moleculares. Eles podem ser divididos em cinesinas, dyneins e miosinas, todos os quais têm sido implicados no tráfico de lisossoma [10], [11], [12]. Além disso, numerosas proteínas acessórias regular a função das proteínas do motor [13], [14], [15]. Kinesins e dyneins, que se movem ao longo dos microtúbulos, transportar uma variedade de carga e ajudar a criar o fuso mitótico. Os 44 cinesinas humanos conhecidos mover predominantemente no sentido mais extremidades de microtúbulos na periferia da célula (transporte anterógrado) [13]. Em contraste, as duas cadeias de dineína-transporte de cargas pesadas humanas conhecidas, que formam complexos proteicos funcionamento do motor com várias proteínas acessórias, no sentido de mover as extremidades menos de microtúbulos na zona perinuclear da célula (transporte retrógrado) [14]. Além disso, o genoma humano codifica para catorze dyneins axonemais responsáveis ​​para o deslizamento dos microtúbulos que faz com que a batida de cílios e flagelos. Miosinas, de que os seres humanos possuem ~ 40, ligam-se a filamentos de actina que são concentradas por baixo da membrana plasmática. Eles são especialmente importantes para transporte de curta distância durante a endocitose e exocitose. Miosinas também gerar a força mecânica para a contracção muscular, a migração celular e a citocinese [15]. Outras proteínas de ligação de actina como tropomiosinas, que afetam dinamicidade actina e estabilidade [16], modular a função miosina.

Para identificar motores moleculares e proteínas relacionadas necessários para a sobrevivência da célula cancerosa, nós analisamos uma biblioteca siRNA segmentação 136 molecular motores e proteínas relacionados para siRNAs que reduzem a viabilidade das células MCF7. As sete proteínas identificadas foram, em seguida, caracterizada pelo seu papel na morte celular, do ciclo celular, a estrutura de citoesqueleto, autofagia, função e integridade lisossomal do lisossoma. Notavelmente, o esgotamento de todas as proteínas identificadas desencadeada morte celular não-apoptótica que foi precedido por mudanças dramáticas na estabilidade e função lisossômico.

Resultados

Identificação de proteínas associadas ao citoesqueleto cujo esgotamento induz não-apoptótica câncer morte celular

citoesqueleto de desregulação drogas são potentes indutores de morte celular lisossomal [7], [8]. Para identificar proteínas de regulação do citoesqueleto necessárias para a sobrevivência da célula cancerosa, nós analisamos uma Silencer® Molecular Motor Biblioteca Ambion (Tabela S1) para efeitos tóxicos sobre as células de câncer de mama MCF7 usando o ensaio de redução MTT. As proteínas foram considerados candidatos se ≥2 /3 siRNAs reduzida densidade celular em 40% em três experiências independentes. Quatro membros cinesina familiares (KIF11, KIF20A, KIF21A, KIF25), dois myosins (MYO1G e MYH1) e tropomiosina 2 (TPM2) cumpriu esses critérios (Fig. 1a) e foram ainda analisados ​​após a confirmação de knockdown pelos siRNAs (Fig. S1) .

(A, B) MCF7 (A), células HeLa (B) e U-2 OS-(B) As células foram deixadas sem tratamento, tratada com Oligofectamine (Oligo) ou transfectadas com ARNsi de controlo (CT) ou três siRNAs independentes contra os alvos indicados individualmente (8 nm; a) ou em piscinas (3 × 6,67 nM; B). A densidade celular foi medida após 72 h por ensaio de redução de MTT. células (c) MCF7-Bcl-2 ou MCF7-pCEP (controlo) foram transfectadas como em (B).

parte inferior esquerda, Depois de 96 h, a morte celular foi determinada por contagem das células Hoechst 33342-coradas com núcleos condensado (três campos aleatórios de 100 células). TNF (20 ng /mL, 24 h) serviu como um controlo positivo para a proteína Bcl-2 morte celular apoptótica sensível.

superior esquerdo

, Western blot confirmando a sobre-expressão de Bcl-2 em células não tratadas MCF7-Bcl-2.

núcleos direito

, exemplos de imagens de Hoechst 33342-manchadas de MCF7-pCEP e células MCF7-Bcl-2 96 h após a transfecção com siRNAs indicados. células (D) MCF7 foram tratadas como em (B).

Esquerda, Depois de 60 h, o DNA foi corado com iodeto de propídio e distribuição do ciclo celular analisada por citometria de fluxo (FL-2A).

direito

, Exemplos de histogramas que mostram a distribuição do ciclo celular de células 60 h após a transfecção com ARNsi indicados. Os valores representam a média ± DP de três experiências independentes (A, C, D) ou triplicados em uma experiência representativa (B, n = 3). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001, vs. controlar células transfectadas com siRNA ou conforme indicado ( C).

para experiências posteriores os três siRNAs para cada alvo foram reunidas salvo indicação em contrário. Tal como em células MCF7, a depleção das proteínas identificadas reduziu a densidade de carcinoma de colo do útero HeLa e células de osteossarcoma L-2-OS significativamente, apesar de o padrão tanto diferente daquela observada em células MCF-7 (Fig. 1A, B). Este resultado foi confirmado utilizando ARNsi individuais em células U-2 OS-(dados não mostrados). A seguir, nós examinamos se a morte celular observada foi de Bcl-2-sensível (apoptose) por transfecção de células MCF7 de Bcl-2 que sobre-expressam e transfectadas com vector [17] com os siRNAs e quantificar a condensação da cromatina associada à morte após 96 h. Os sete siRNAs causada condensação da cromatina em 20-60% das células. Bcl-2 inibiu a condensação da cromatina apenas após tratamento com o factor de necrose tumoral (TNF) (um controlo para a morte celular por apoptose), e parcialmente em células KIF21A siRNA-transfectadas (Fig. 1C). Notavelmente, KIF21A siARN ainda induzida a condensação nuclear em ~ 40% das células Bcl-2 que sobre-expressam (Fig. 1C). Resultados semelhantes foram obtidos com siRNAs individuais (dados não mostrados).

e KIF11 KIF20A são conhecidos para regular a formação de fuso mitótico e citocinese, respectivamente [18], [19]. depleção KIF11 preso as células na fase G2 /M, como esperado, enquanto que as células KIF20A siRNA-transfectadas acumulada em fase G1 (Fig. 1D). Os outros siRNAs não causou alterações significativas na distribuição do ciclo celular (Fig. 1D).

Efeito dos siRNAs identificados em lisossomos e citoesqueleto

Desde a morte celular não-apoptótica pode resultar de danos lisossômico, a seguir, estudaram o efeito dos siRNAs identificados em lisossomas de células MCF7. KIF11, KIF20A, KIF25, MYO1G e MYH1 siRNAs aumentou significativamente a proporção de células com uma endo-lisossomal alargada (ácida) do compartimento (Fig. 2A), e em células esgotadas para KIF20A, KIF25 ou MYO1G Este aumento estava associado com o aumento da protease lisossómica atividade (Fig. 2B). Pelo contrário, KIF11, MYH1 e TPM2 siRNAs reduzida actividade da catepsina possivelmente devido a permeabilização da membrana do lisossoma (ver abaixo). Lisossomas foram dispersos por todo o citoplasma de células transfectadas com o controlo, KIF11, KIF21A ou MYO1G siRNAs (Fig. 2C). Pelo contrário, as células KIF20A-empobrecido exibidos longas saliências que foram muitas vezes densamente povoadas pelos lisossomos e KIF25, TPM2 e MYH1 siRNAs causou agregação lisossômico periférica (Fig. 2C). lisossomal distribuição semelhante foi observada após a transfecção com todos os três siRNAs individuais de segmentação KIF20A, KIF25 e MYH1 e siRNAs 1 e 3 segmentação TPM2 (dados não mostrados).

(A-D), as células MCF-7 foram deixados sem tratamento, tratada com Oligofectamine (Oligo) ou transfectadas com ARNsi de controlo (CT) ou indicadas piscinas siRNA. (A) Após 60 h, as células com o compartimento ácido alargada (endossomas tardios e lisossomas) foram identificados por citometria de fluxo (FL-2A) de células Lyso Tracker manchado de vermelho. O limiar para a coloração de alta intensidade foi definida de modo a que 90% das células transfectadas com ARNsi de controlo eram inferiores. foi determinada (B) Após 72 h, a actividade total cisteína catepsina (clivagem ZFR-AFC). HSPA1 e CTSB siRNAs serviu como controles internos. (C, D) Após 60 h, as células foram coradas para Lamp-2 (C) ou F-actina (D) e analisadas por microscopia confocal. Imagens representativas são mostrados.

Arrows

, agregação de estruturas lisossomais na célula saliências /periferia.

Barras

, 20 mm. Os valores representam a média ± SD de um mínimo de três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001, vs. controlar células transfectadas com siRNA

em seguida, examinou se a localização lisossômico alterada foi associado com mudanças na actina ou microtúbulos do citoesqueleto, que estão ambos envolvidos no tráfico lisossomal [20]. Depleção de KIF25 e MYH1 dramaticamente aumentada e os níveis de fibras de stress de actina F, que podem contribuir para a relocalização do lisossoma (Fig. 2D). Observou-se um aumento menor em fibras de tensão após tratamento com MYO1G e TPM2 siRNAs, enquanto nenhuma alteração foi observada com as outras siRNAs (Fig. 2D). Nenhum dos siRNAs identificados teve efeitos detectáveis ​​sobre microtúbulos como visualizado por coloração α-tubulina (dados não mostrados).

Efeito dos siRNAs identificados no autofagia e acumulação de dextrano

lisossomos receber a sua carga principalmente através de autofagia e endocitose. Para testar o efeito dos siRNAs identificados no autofagia, utilizou-se células MCF7 que expressam tfLC3, uma proteína fluorescente em série sensível ao pH, que consiste em monomérica proteína fluorescente vermelha (MRFP), reforçada proteína fluorescente (EGFP) e a proteína associada a microtúbulos cadeia de 1 luz verde 3 (LC3) [21]. Em vacúolos autofágicos iniciais (AVI) tfLC3 emite fluorescência verde e vermelho enquanto que em vacúolos autofágicos de degradação (AVD) fluoresce apenas o vermelho desde eGFP fluorescência é perdido em amphisomes ácidos e autolysosomes. Como relatado anteriormente [22], a depleção de rapina, um componente do complexo mammalian target of rapamycin 1 que normalmente bloqueia autophagy, aumentaram o número de ambos AVI e AVD indicativa de aumento do fluxo autophagic (Fig. 3A, B). Em contraste, MYO1G e MYH1 siRNA piscinas, bem como todos os três siRNAs individuais de segmentação MYH1 e siRNAs 1 e 3 segmentação MYO1G aumento AVI mas não avd. SiRNAs segmentação dos outros cinco candidatos não teve nenhum efeito aparente neste ensaio (Fig. 3A, B e dados não mostrados). A capacidade de MYO1G e MYH1 siRNAs para inibir fluxo autophagic também foi indicado por um aumento na p62 /sequestesome (p62 /SQSTM1 mutada, uma proteína eficazmente degradados por autofagia) níveis e capacidade de um indutor autofagia, rapamicina reduzida, para reduzir os níveis de p62 /SQSTM1 depois de tratamentos de siRNA (Fig. 3C).

(A-D) tfLC3 células MCF7-(A, B) ou as células MCF7 (C, D) foram deixados sem tratamento, tratada com Oligofectamine (Oligo) ou transfectadas com ARNsi de controlo (CT) ou piscinas ARNsi indicados (3 × 6,67 nM). (A, B) Depois de 48 h, as células tfLC3-MCF7 foram analisadas por microscopia confocal. Imagens representativas (A;

Barras

, 10 uM) e quantificação de pontos lacrimais (B) são mostrados. Raptor siRNA (RPTOR) serviu como um controle para aumento do fluxo autofágica. setas fechadas indicam AVD, setas abertas indicam AVI. (C) Após 60 horas, o nível de p62 /SQSTM1 (p62), que é degradado por autofagia, foi analisada por Western blot. A rapamicina (20 nM, 4 H) foi usado para induzir autofagia. Os números representam os níveis de p62 como a percentagem do nível em células transfectadas com ARNsi de controlo não tratado. (D)

Top of, Depois de 60 h, as células MCF-7 foram tratadas com 100 ug /mL de Alexa Fluor 488-dextrano (dextrano-488) durante 1 h, e analisadas por citometria de fluxo (FL1-H). O limiar para a coloração de alta intensidade foi definida de modo a que 88% das células transfectadas com ARNsi de controlo eram inferiores.

inferior

, o exemplo histogramas mostrando dextrano-488 conteúdo das células transfectadas com o controle ou KIF20A siRNA. M1 = portão em alta coloração intensidade. Os valores representam a média ± SEM de 20 células em uma experiência representativa (B, n = 3) ou meios + DP de três experiências independentes (D). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001, vs. controlar células transfectadas com siRNA

em seguida, examinou-se o efeito dos siRNAs identificados na absorção de 10 kDa Alexa Flour 488-dextrano por citometria de fluxo. esgotamento KIF20A aumentou a acumulação de dextrano significativamente enquanto KIF11 siRNA causou um ligeiro (p = 0,066) aumento. Os outros cinco ARNic não teve nenhum efeito neste ensaio (Fig. 3D). Deve notar-se que este ensaio não pode distinguir entre o aumento e diminuição da endocitose exocitose.

redução da estabilidade lisossomal por os siRNAs identificados e monastrol

a morte de células não apoptóticas e numerosas alterações observadas de cima lisossomais levou-nos a estudar o efeito dos siRNAs identificados na estabilidade lisossomal. Primeiro, foi medida a capacidade de lisossomas para reter laranja de acridina, um corante básico metacromática, quando desafiado com luz azul [23]. KIF11, KIF20A, KIF21A, MYH1 e TPM2 siRNAs sensibilizados células MCF7 significativamente a fugas lisossomal foto-induzida por oxidação e KIF25 siARN mostrou uma tendência semelhante 60 h após a transfecção (fig. 4A, B). Quando analisados ​​após 72 h, todos os siRNAs tinha induzido vazamento lisossomal (aparecimento de proteases lisossómicas no citosol), mesmo que o efeito de KIF20A e MYO1G siRNAs não atingiu significância estatística (Fig. 4C). Notavelmente, o tratamento de células MCF7 com monastrol, um bem caracterizado inibidor de molécula pequena de KIF11 [24], também induziu a permeabilização da membrana do lisossoma (Fig. 4D). Assim, a depleção de cada um dos sete proteínas, bem como os resultados do tratamento monastrol na desestabilização do lisossoma.

células (A-C) MCF7 foram deixados sem tratamento, tratada com Oligofectamine (Oligo) ou transfectadas com ARNsi de controlo (CT ) ou piscinas ARNsi indicados (3 × 6,67 nM). (A e B) após 60 h, as células foram tratadas com laranja de acridina e analisadas por imagem de células vivas para medir a perda de integridade lisossomal (aumento da fluorescência verde) por tratamento a laser. Um miminum de 25 células de áreas pré-definido foi examinado para cada experimento. Três experiências independentes são apresentados em A e B representam os valores em meio SD + destas experiências no ponto de tempo de 60 seg. (C) Após 72 h, citosólicas e atividades totais cisteína catepsina foram medidos por meio da análise da clivagem de ZFR-AFC. As atividades em extractos citossólicos são mostrados como porcentagens das atividades nos extractos totais correspondentes. HSPA1 e CTSB siRNAs serviram como controlos para a indução de vazamento lisossomal e eficácia de transfecção, respectivamente. (D) citossólicos actividades da catepsina cisteína em células MCF7 deixada sem tratamento ou tratada com veículo (sulfóxido de dimetilo a 2%, DMSO) ou concentrações indicadas de monastrol durante 72 h foram determinados como em (C). Os valores representam a média ± DP de cinco (C) ou (D) três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001, vs. controlo transfectadas com siRNA (B, C) ou células tratadas com o veículo (D).

sensibilização a lisossomo perturbadoras drogas pelos siRNAs identificados e monastrol

Uma vez que os siRNAs desestabilizou os lisossomos, examinamos se também sensibilizar células para lisossomo perturbadoras drogas. Para este efeito, as células MCF-7 foram transfectadas com ARNsi durante 48 h e depois tratou-se durante um adicional de 48 h com siramesine, etoposido ou cisplatina, todos os quais são capazes de causar a morte celular lisossomal [5], [25]. Todos os ARNic excepto células sensibilizadas KIF25 siRNA para siramesine com o efeito mais forte observada para KIF11 e KIF21A siRNAs (Fig. 5A, B). Para KIF11, este foi confirmada utilizando os três siRNAs individuais (dados não mostrados). Sensibilização de etopósido foi visto com KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 e TPM2 siRNAs (Fig. 5A, B). KIF20A siRNA não teve nenhum efeito, ao passo que MYO1G siRNA reduziu a morte celular em resposta a etoposida, possivelmente devido à sua capacidade para inibir a autofagia, o que pode contribuir para a morte induzida por etoposido [26]. Além disso, KIF11, KIF21, MYH1 e TPM2 siRNAs melhorada morte celular induzida por cisplatina, mas devido a variações entre experiências, o efeito foi significativo apenas para KIF21A siARN. Além disso, combinando monastrol siramesine e resultou na indução sinérgica de morte celular em células MCF7, HeLa, L-2-OS e células de DU-145 (Fig. 5C, S2). Assim, todos os siRNAs sensibilizados células cancerosas a um ou vários fármacos com os efeitos mais fortes observados em células sem KIF11 ou KIF21A perturbadoras do lisossoma.

(A, B) As células MCF7 foram deixados sem tratamento, tratada com Oligofectamine (Oligo) ou transfectadas com siRNA controle ou piscinas siRNA indicados (3 × 6,67 nM). Após 48 h, as células foram deixados sem tratamento ou tratados com 2 siramesine? M (

topo

), 50 mM etoposídeo (

média

) ou 10 mM cisplatina (

parte inferior

) para mais 48 h antes de luz por microscopia de fotos foram tiradas imagens representativas (em B) e a morte celular foi quantificada pelo ensaio de libertação de LDH (a). células (C) MCF7 foram deixados sem tratamento ou tratada com 2 uM siramesine juntamente com as concentrações indicadas de monastrol durante 72 h e a morte celular foi quantificada pelo ensaio de libertação de LDH. Os valores representam a média ± SD de um mínimo de três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001, vs. controlar células transfectadas com siRNA (a) ou As células tratadas com 2 mM siramesine sozinho (C).

Discussão

neste estudo, identificamos KIF11, KIF20A, KIF21, KIF25, MYO1G, MYH1 e TPM2 como proteínas cuja depleção provoca a inibição do crescimento e morte celular não apoptótica em células de cancro (Tabela 1). Para o nosso conhecimento, este estudo é o primeiro a identificar KIF21A, KIF25, MYO1G, MYH1 e TPM2 como proteínas essenciais para a sobrevivência da célula cancerosa, enquanto outros têm a morte celular relatado mais cedo sobre o esgotamento dos KIF11 [27], [28], [29 ] e KIF20A [30] em outras linhas de células de cancro. Da mesma forma que os resultados do nosso estudo anterior que mostram que o esgotamento de KIF5B é mais tóxico para as células HeLa que para as células MCF-7 [31], observamos algumas diferenças nas sensibilidades das diferentes linhas celulares de cancro para os siRNAs identificados. Isto pode ser devido a diferenças nos níveis de expressão dos genes alvo ou genes relacionados com funções redundantes.

Notavelmente, a expressão ectópica de Bcl-2 não resgatar células MCF7 da citotoxicidade induzida por todos os siRNAs identificados exceto KIF21A siRNA. Mesmo em células empobrecido-KIF21A, ectópica Bcl-2 reduziu a morte celular apenas parcialmente 60-40%. A insensibilidade a Bcl-2 sugere um envolvimento de mecanismos de morte celular alternativos, em vez de apoptose clássica. Esta ideia foi fortemente apoiada pela observação subsequente que a depleção de todas as sete proteínas causado algum grau de desestabilização do lisossoma, uma característica da via de morte celular lisossomal [3], [32]. É, no entanto, não é imediatamente óbvio que a depleção das proteínas identificadas leva a perturbação lisossomal.

da cinesinas identificados, KIF11, também chamado de proteína cinesina do fuso ou Eg5, tem sido estudada extensivamente mais, especialmente no contexto de cancro [33]. KIF11 forma um homotetrâmero que é responsável pela formação do fuso durante a mitose [18]. Assim, e de acordo com outros estudos [28], [29], exaustão KIF11 presos células MCF7 na fase do ciclo celular G2 /M. KIF11 inibição também foi relatado para matar as células de carcinoma de ovário humano e Leucemia através da via intrínseca de apoptose de uma forma de Bcl-2-sensíveis [28], [34]. Em contraste, KIF11 siARN causada Bcl-2 insensíveis a morte não apoptótica em células MCF7 que provavelmente resultou da desestabilização dos lisossomas e a libertação subsequente de catepsinas de cisteína para o citosol. inibição KIF11 podem desencadear a via de morte celular lisossomal também em outros tipos de células uma vez que a depleção de Hsp70 protege as células de mieloma contra a citotoxicidade induzida por dimethylenastron, um inibidor farmacológico de KIF11 [29].

De modo semelhante ao KIF11, estabilizadores de lisossoma de KIF21A causada permeabilização lisossomal excessiva e a morte celular. Deve notar-se que a morte celular induzida por depleção KIF21A já começou ~ 50 h após a transfecção e pode, assim, ter afectado outras medidas da função lisossómica no presente estudo (Tabela 1). KIF21A liga-se ao factor de guanina de permuta de nucleótidos big1 [35], o que ajuda a manter a organização do aparelho de Golgi [36]. Assim, a depleção KIF21A pode afectar o tráfico de componentes lisossomais do aparelho de Golgi para o compartimento lisossomal endo-fazendo assim com que a disfunção do lisossoma. Caso contrário, praticamente nada se sabe sobre KIF21A e os nossos resultados encorajam fortemente uma análise mais aprofundada do seu papel em células normais e cancerosas.

O terceiro kinesin identificados em nossa tela, KIF20A (também chamado Rabkinesin-6, RAB6KIFL ou MKlp2) foi relatado ser essencial para a citocinese em células HeLa em que os seus resultados de inibição na formação de células multinucleadas [19], [37], e para a sobrevivência de células de cancro do pâncreas, por um mecanismo que não envolvam o bloqueio da citocinese [30]. Da mesma forma que as células de câncer de pâncreas, as células MCF-7 KIF20A-empobrecido não prendeu na mitose ou exibir um fenótipo multinucleada sugerindo que outros kinesins pode ter tomado a sua função mitótico nestas células. Em vez disso, a depleção KIF20A resultou na acumulação de células MCF7 na fase G1 do ciclo celular e morte celular causada lisossomal. A morte celular foi precedido pelo aumento do volume lisossômico, atividade catepsina cisteína e acumulação de dextrano e desestabilização das membranas lisossomais. Os efeitos observados no compartimento da endo-lisossomal pode estar relacionada com outra função previamente relatados de KIF20A, ou seja, o seu envolvimento no tráfico de vesículas relacionados-Golgi para a membrana plasmática através de uma interacção com Rab6 [30], [38].

o esgotamento do último identificada cinesina, KIF25, causou agregação lisossomal periférica e um aumento no volume do lisossoma, um fenótipo que se assemelha a causada por fármacos que perturbam microtúbulos [7]. tráfico desregulamentado e aumento do volume lisossômico pode ter contribuído para a permeabilização lisossômico como lisossomos ampliadas são propensos à ruptura [39]. depleção KIF25 também causou a formação de fibras de stress de actina, os quais podem ser devidos a Rho alterada de sinalização tal como anteriormente observado em cima do microtúbulo desestabilização [40]. Estas primeiras pistas para a função KIF25 em tráfico lisossômico e biologia do câncer justificar um estudo mais profundo desse membro em grande parte desconhecida da família cinesina.

Além das kinesins-interagindo microtúbulos, foram identificadas três proteínas se ligam à actina, MYH1, MYO1G e TPM2, proteínas, essenciais para a sobrevivência da célula cancerosa. MYH1, também chamada miosina de cadeia pesada de 2 × (MyHC-2X), faz parte do sarcómero em fibras musculares esqueléticos rápidos [41]. Suas funções em células não musculares são praticamente desconhecida, mas pode ajudar a organizar fibras de actina e, assim, afetar o tráfico dependente de actina ou ancoradouro organela. Em conformidade com isso, as células MCF7 MYH1-empobrecido mostraram um aumento no fibras de stress de actina e agregação lisossomal periférica, acompanhada por um compartimento lisossomal expandido e permeabilização lisossomal. Além disso, o esgotamento MYH1 causou a inibição da degradação autofágica e acumulação de vacúolos autofágicos iniciais indicativas da fusão autophagosome-lisossoma defeituosa, que pode ser devido ao extravio dos lisossomos.

O segundo miosina identificado, MYO1G, é enriquecida pelo a membrana plasmática de células hematopoiéticas em que tem sido sugerida para aumentar a elasticidade celular [42], [43]. Como outros myosins classe I [15], MYO1G também podem estar envolvidos no tráfico de vesícula. No entanto, nem a localização lisossomal nem acumulação de dextrano alterado nas células empobrecido-MYO1G, e os outros efeitos lisossomais eram mais leves do que após a depleção dos outros acessos identificados. esgotamento MYO1G tinha, no entanto, um forte efeito inibidor sobre o fluxo autofágica, que pode resultar das mudanças observadas em fibras de actina. Recentemente, MYH9 /NMHC-IIA foi encontrado para ser envolvido na formação autophagosome durante a fome [44], e os nossos resultados indicam que o papel das miosinas adicionais, especialmente MYH1 e MYO1G, em autofagia deve ser mais investigada.

a única proteína não-motor identificados em nossa tela foi TPM2, que forma filamentos ao longo das fibras de actina e controla a contração do músculo, bloqueando a interação miosina-actina. Em células não musculares, TPM2 e outros tropomiosinas são acreditados para estabilizar os filamentos de actina e regulam as funções da actina, incluindo a motilidade celular e organelo e transporte vesicular [16]. esgotamento TPM2 causou agregação lisossômico periférica indicando que TPM2 pode, de fato, a função no tráfico lisossômico dependente de actina. Isto é consistente com os dados que mostram que a micro-injecção de anticorpos e TPM1 TPM2 inibe o transporte de grânulos intracelulares [45].

alterações observadas lisossomais deletérios sobre a depleção de KIF25, TPM2 MYH1 e pode estar ligado à sua função aparente em lisossomal tráfico mas continua a ser menos claro como a regulação negativa das outras proteínas perturbado lisossomos. É possível que seu esgotamento teve efeitos sutis sobre o tráfico lisossômico, tais como mudanças no tráfico de curto alcance dos lisossomos ou tráfico de uma subpopulação lisossoma, que não eram detectáveis ​​com os métodos utilizados. Em alternativa, o transporte dos lípidos ou proteínas que promovem a integridade lisossomal, tais como proteínas da membrana lisossomal, Hsp70 e esfingomielinase ácida [5], [23], pode ter sido alterado. Mais indirectamente, o seu esgotamento pode causar alterações do citoesqueleto que danificam outros organelos celulares e, assim, ativam cascatas de sinalização que desencadeiam lisossômico permeabilização.

As proteínas identificadas podem ser alvos adequados para terapia de câncer, como as células cancerígenas são sensibilizados à morte celular lisossomal [ ,,,0],4], [5]. Vários inibidores de KIF11, que é regulada positivamente em uma ampla gama de cancros (Oncomine, https://www.oncomine.org), já estão em ensaios clínicos como drogas anti-cancerosas [9], e um inibidor KIF20A foi recentemente identificado [46]. Estes inibidores foram desenvolvidos como bloqueadores mitóticos mas os nossos resultados indicam que a actividade anti-cancro pode também resultar de interrupção do lisossoma. Nós também descobrimos que a depleção dos sete acertos reforçada a toxicidade de foto-oxidação e das drogas perturbadoras do lisossoma siramesine, etoposídeo e cisplatina. sinergismo forte com todas as drogas foi observada após depleção de KIF11, KIF21A e TPM2 enquanto que a regulação negativa das outras proteínas era sinérgica apenas com algumas das drogas, reflectindo possivelmente diferenças no mecanismo de interrupção do lisossoma ou absorção da droga. Consequentemente, a combinação de inibição de proteína de motor com outros tratamentos perturbadoras do lisossoma parece ser uma estratégia promissora para a terapia do cancro. Isto deve ser especialmente testados para os inibidores já disponíveis KIF11, que têm apenas efeitos modestos anti-câncer como agentes únicos [9].

Além das conexões de câncer estudados aqui, nossos resultados fornecem pistas sobre a etiologia da doenças genéticas raras, resultantes de mutações em KIF21A e TPM2.