PLOS ONE: Identificação e Avaliação de Plasma MicroRNAs para detecção precoce de Colorectal Cancer

Abstract

Fundo

O câncer colorretal (CRC) é um dos cânceres mais comumente diagnosticados. microARNs circulante (miARNs) têm sido sugeridos como marcadores potencialmente promissoras para a detecção precoce de CRC. Nós teve como objetivo identificar e avaliar um painel de miRNAs que poderia ser mais adequado para a detecção precoce CRC.

Métodos

MiRNAs foram perfilado por TaqMan MicroRNA matriz e rastreados para a expressão diferencial em 5 grupos de amostras de plasma dos pacientes de CRC (N = 50) e 5 piscinas de controles sem neoplasia (N = 50). miRNAs adicionais foram selecionados a partir de uma revisão da literatura. candidatos identificados foram avaliados em amostras de validação independentes no que diz respeito à discriminação de pacientes com CCR (n = 80) ou pacientes adenoma avançados (N = 50) e controles livres de neoplasia (N = 194). desempenho diagnóstico do painel de miRNAs foi avaliado por meio de regressão logística múltipla, por meio de análise de bootstrap para corrigir o excesso de otimismo.

Resultados

Cinco miRNAs identificados para ser diferencialmente expressos de TaqMan MicroRNA Array (miR -29, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p), e sete miRNAs relatados para ser diferencialmente expressos na literatura (miR-18a, -20, -21, -92a, -143, -145 , -181b) foram selecionados para validação. Nove dos doze miARNs (miR-18a, -20, -21, -29, -92a, -106b, -133a, -143, -145) foram encontrados para ser diferencialmente expressos em pacientes de CRC e controlos nas amostras de validação. A área corrigiu-o otimismo sob a curva foi 0,745 (95% intervalo de confiança: 0,708-0,846). Nenhum dos miRNAs selecionados apresentaram expressão diferencial significativa entre os pacientes adenoma e controles avançados livre de neoplasia.

Conclusão

O painel identificou de miRNAs poderia ser de uso potencial no desenvolvimento de um multi-marcador teste baseado sangue para detecção precoce do CRC. Impacto: O estudo ressalta o elevado potencial dos miRNAs de plasma para a melhoria das ofertas atuais de triagem CRC não-invasivo

Citation:. Luo X, Stock C, Burwinkel B, Brenner H (2013) Identificação e Avaliação de MicroRNAs de plasma para detecção precoce do câncer colorretal. PLoS ONE 8 (5): e62880. doi: 10.1371 /journal.pone.0062880

Autor: Antonio Moschetta, Universidade de Bari Consorzio Mario Negri Sud, Itália |

Recebido: 22 Dezembro, 2012; Aceito: 26 de março de 2013; Publicado: 14 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Luo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

com mais de 1,2 milhões de novos casos e mortes por 608,700 ano, o câncer colorretal (CCR) é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda em mulheres, ea quarta causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo [1]. Devido ao seu desenvolvimento normalmente muito lenta ao longo de muitos anos, as perspectivas para a detecção precoce são muito melhores do que para muitas outras formas de câncer. Estimou-se que mais de 95% dos casos de CRC iria beneficiar da cirurgia curativa se o diagnóstico foi feito numa fase precoce ou pré-maligna pólipo [2], [3]. Um certo número de procedimentos de detecção precoce foram desenvolvidos e estão cada vez mais aplicado, incluindo exames endoscópicos, Stool e testes baseados em sangue. Os exames de sangue com base parece ser particularmente atraente como são minimamente invasiva e pode receber níveis elevados de aderência quando aplicados como testes de rastreio primário na triagem baseada população. Um grande número de marcadores de sangue foram propostas e avaliadas, incluindo a proteína, citológica, ARNm, e marcadores de DNA [4], [5], mas o desempenho de diagnóstico tem sido principalmente insuficiente para aplicação como um instrumento primário no rastreio populacional. Além disso, a maioria dos estudos se baseou em amostras de conveniência pequenas a partir das definições clínicas e resultados bastante promissores de estudos pequenos muitas vezes não foram replicados em subseqüentes validações de maior escala.

Os microRNAs (miRNAs) são 18~22 nucleotídeos RNAs não-codificantes que o pós-transcricional regular a expressão gênica e controlar vários mecanismos celulares [6]. Há evidências crescentes de que os miRNAs são amplamente desregulado no cancro e pode ter aplicação potencial para diagnóstico de câncer, prognóstico e tratamento [7]. Além disso, o desenvolvimento recente de microarrays miRNA tem feito grandes estudos de perfis em pacientes com câncer possíveis.

A estabilidade dos miRNAs livre de células em fluidos corporais permite miRNAs circulantes como potenciais biomarcadores para o diagnóstico não-invasivo de câncer e outras doenças [8 ]. Vários estudos recentes encontrados alguns miARNs circulantes, tais como o miR-29a, miR-92a e miR-221, para ser diferencialmente expressos em pacientes de CRC e, por conseguinte, para ser de uso potencial como biomarcadores não invasivos para o rastreio CRC [9] – [11 ].

o objetivo deste estudo foi identificar e avaliar um painel de miRNAs de plasma que pode servir como biomarcadores para a detecção precoce do CRC.

Materiais e Métodos

desenho do estudo e estudo População

casos com CRC esporádicos foram recrutados antes do início do tratamento na Clínica Universitária de Heidelberg, no contexto da DACHS + estudo, que é um estudo de satélite para DACHS, um estudo de caso-controle em curso realizado na região de Rhine-Neckar da Alemanha [12], [13].

os pacientes com adenomas colo-rectal avançado e controles livres de neoplasias colorretais foram selecionados aleatoriamente de participantes da triagem colonoscopia recrutados no estudo BLITZ, um curso estudo concebido para avaliar novos marcadores promissores para a detecção precoce de CRC e previamente descrito em detalhe noutro local [14] – [16]. Resumidamente, os pacientes foram recrutados, e amostras de sangue foram tomadas em gabinetes dos gastroenterologistas em uma visita preparatória, tipicamente cerca de uma semana antes da colonoscopia da seleção.

Tanto o DACHS + eo estudo BLITZ foram aprovados pelos comitês de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Heidelberg e dos Conselhos de Medicina de Baden-Wuerttemberg e Rhineland-Palatinate. . Consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante

A nossa investigação envolveu duas fases principais, uma fase de identificação do marcador e uma fase de validação marcador:

Na fase de identificação do marcador, prometendo miRNAs foram rastreados por TaqMan matriz MicroRNA em amostras de plasma reunido de 50 pacientes de CRC e 50 controles sem neoplasia, usando cinco conjuntos de amostras de plasma de dez pacientes com CCR cada, e cinco piscinas de amostras de plasma de dez controles sem neoplasia cada. Além disso, sete miRNAs descrito a ser diferencialmente expressos em casos e controles em publicações anteriores CRC foram identificados a partir de uma revisão sistemática da literatura (miR-18a, -20, -21, -92a, -143, -145, -181b) [17 ].

na fase de validação marcador, expressão dos miRNAs identificados foi avaliada em amostras independentes de (i) 80 casos de CRC e 144 controles livres de neoplasias colorretais e (ii) 50 pacientes com adenomas avançados e 50 controles livre de neoplasias colorretais.

Procedimentos laboratoriais

extracção (i) preparação de amostras e RNA.

As amostras de sangue foram coletadas em tubos de EDTA. Amostras de sangue de pacientes com câncer foram tomadas antes da cirurgia ou qualquer outra terapia e amostras de sangue dos participantes que realizaram a triagem colonoscopia foram tomadas antes da colonoscopia. As amostras de sangue foram centrifugadas a 2123g durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante foi transferido para novos tubos. As amostras de plasma foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. O ARN total contendo ARN pequeno foi extraído a partir de 200 ul (amostras utilizadas na fase de identificação) ou 115 ul (amostras utilizadas na fase de validação) de plasma usando uma combinação de reagente Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) e miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), bem como 5 fmol /ul CEL-miR-39 como controlo preparação para uso externo, tal como descrito antes [18]. As amostras foram eluídas num volume final de 30 ul.

(ii) MicroRNA perfis a partir de amostras de plasma.

Profiling foi realizada utilizando TaqMan MicroRNA Array (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA) o que permite a quantificação de 667 microARNs humanos. reacção de transcrição reversa (Tabela S1) Megaplex e de reacção de pré-amplificação foram realizadas por G-tempestade GS2 Thermal Cycler (L-tempestade, Reino Unido). Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qRT-PCR) foi realizada usando 7900HT rápido Real-Time PCR System (Applied Biosystems). O limiar de ciclo (Ct) é definido como o número de ciclos necessários para o sinal de fluorescência para cruzar o limiar de qRT-PCR. valores Raw Ct foram calculados usando o SDS versão do software 2.2 aplicar as configurações de linha de base automáticos e um limiar de 0,1 foi definido. Apenas miRNAs cuja Ct valor foi igual ou inferior a 33 em, pelo menos, tanto o caso ou o grupo de controle foram tomadas em consideração para uma análise mais aprofundada dos dados. A normalização de dados foi realizada como descrito por Kroh et ai. [19].

(III) em tempo real de verificação de PCR quantitativo.

miARNs seleccionados foram medidos utilizando TaqMan Ensaios MicroRNA (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo do fabricante. Triplicados de qRT-PCR de cada amostra foram realizados utilizando LightCycler 480 em tempo real do sistema de PCR (Roche Applied Science, Alemanha). ΔCt foi calculado subtraindo os valores Ct de controles internos a partir dos valores Ct dos miRNAs de interesse, e os valores médios de ΔCt foram comparados entre casos e controles. ensaios multiplex foram realizadas utilizando pools predefinidos de RT-iniciadores (Tabela S2). A eficiência do ensaio de cada miARN foi determinada pela construção de uma curva padrão, utilizando uma série de diluições de ARN totais. Todos os ensaios apresentaram boa linearidade (R

2 0,96) entre os valores de Ct e o logaritmo da quantidade de partida de ARN total de cada diluição (dados não mostrados)

Análises Estatísticas

os níveis de expressão de miRNA foram comparados entre pacientes com CCR e controles livres de neoplasia e entre pacientes adenoma e controles avançados livre de neoplasia usando o Wilcoxon-Mann-Whitney-test (a seguir: teste de Wilcoxon). A comparação dos níveis de expressão de miRNA entre pacientes com CCR e controles livres de neoplasia em fase de identificação marcador foi realizada utilizando a versão exata do teste de Wilcoxon. Todos os testes foram dois lados valores e P de 0,05 ou menos foram consideradas estatisticamente significativas.

A regressão logística múltipla foi utilizada para avaliar o uso conjunto do painel identificados de miRNAs na previsão CRC em fase de validação marcador . operating characteristic (ROC) do receptor foram construídas e as áreas sob as curvas ROC (AUC) foram calculados tanto do não ajustado (aparente) e ajustado ( “corrigido otimismo-“) estima para avaliar a discriminação do modelo de previsão entre pacientes com e sem CRC. The.632 + método bootstrap (com 1000 repetições) foi utilizado para ajustar para overfitting do erro misclassification aparente e sobre-estimação da AUC pelas estimativas não ajustadas [20], [21]. intervalos de confiança de 95% (IC) para as estimativas ajustadas e não ajustadas foram obtidos por análises de bootstrap ordinárias (com 1000 repetições).

A correlação dos níveis de expressão de miRNA plasma através dos 324 participantes da fase de validação foi avaliada por Spearman coeficientes de correlação.

SAS versão 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, Carolina do Norte, EUA) foi usado para conduzir testes de Wilcoxon e R versão 2.15.0 foi usada (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria) a realização de todas as outras análises. O R-pacotes “Daim” e “arranque” foram utilizados para realizar análises de bootstrap [22], [23].

Resultados

Estudo da População

Um total de 424 indivíduos foram incluídos (130 pacientes CRC, 50 pacientes adenoma avançados e 244 controles sem neoplasia) no estudo. As características demográficas da população do estudo e distribuição de estágios tumorais foram sintetizadas para a fase de identificação do marcador e a fase de validação marcador na Tabela 1.

Identificação de miRNAs diferencialmente expressos em CRC pacientes e controles Neoplasia-livres

em microarray análises, cinco miRNAs foram encontrados para ser estatisticamente significativa sobre-expressos no plasma de pacientes com CCR em relação aos controles sem neoplasia (miR-29a: p = 0,016, miR-106b: p = 0,008, miR -133a: p = 0,032, miR-342-3p: p = 0,008, miR-532-3p: p = 0,016, teste exato de Wilcoxon)

Avaliação de Controles internos para Tempo real PCR quantitativo

.

em nossos dados microarray observamos nenhuma diferença significativa em termos dos valores Ct de miR-188-5p (p = 0,83, teste de Wilcoxon) e miR-16 (p = 0,40, teste de Wilcoxon) entre CRC e neoplasia-livre controlos. RNU6B e miR-16 têm sido os miARN endógenos de controlo mais amplamente utilizado para qRT-PCR nos estudos de miARN [8]. Por isso, os chamados três miARNs foram considerados como controlos internos para miARN quantificação. No entanto, os níveis de RNU6B e miR-188-5p no plasma de expressão foram demasiado baixos para ser quantificada por TaqMan MicroRNA Ensaio (média de valores de Ct foram maiores do que 35). Assim, miR-16 foi selecionado como o controle interno, uma vez que apresentaram alta abundância e menor variabilidade de expressão. Não foi observada diferença significativa em termos de valores Ct de miR-16 (p = 0,40, teste de Wilcoxon) entre CRC e amostras livres de neoplasia.

Validação em uma amostra independente de CRC pacientes e controles Neoplasia-livres

Para confirmar os cinco miRNAs (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) identificado na análise microarray e mais sete miRNAs (miR-18a, -20, -21 , -92a, -143, -145, -181b) que foram previamente relatado para ser diferencialmente expressos em CRC (excepto o miR-92a, foram todos eles a partir de estudos com base em amostras de tecido) [17], de qRT-PCR foi realizada para analisar a expressão dos miRNAs selecionados no nosso conjunto de validação (224 amostras de plasma total de 80 pacientes com CCR e 144 controles sem neoplasia).

(i) a expressão de miRNAs.

Nove miRNAs ( miR-18a, -20, -21, -29, -92a, -106b, -133a, -143, -145) apresentaram maior expressão no plasma de pacientes com CCR do que nos controles sem neoplasia (miR-18a: p 0,0001, miR-20a: p = 0,001, miR-21: p 0,0001, miR-29a: p = 0,001, miR-92a: p = 0,004, miR-106b: p = 0,028, miR-133a: p = 0,0002, miR-143 0,0001, miR-145: p = 0,0004, teste de Wilcoxon). Sem miRNA foi encontrado para ser reprimidos. Os correspondentes níveis de expressão no plasma de pacientes com CCR e controles livres de neoplasia (normalizados para miR-16) são mostrados na Figura 1.

Os diagramas de caixa com menor observação, quartil inferior, mediano, quartil superior e maior observação são mostrando. Os bigodes estender-se às observações que não são mais do que 1,5 vezes o comprimento da caixa (intervalo interquartil) de distância da caixa. observações mais extremos são considerados valores discrepantes. Os valores de P são baseados em testes de Wilcoxon.

(ii) Relação entre os miRNAs e características clínico-patológicas de pacientes com CCR.

Foi examinada a associação entre os níveis de expressão de miRNA e algumas características clínico-patológicas. nível de expressão de miR-181b foi maior em pacientes com metástases em linfonodos que em pacientes sem metástases em linfonodos (p = 0,024, teste de Wilcoxon). Nenhum dos miRNAs mostrou qualquer associação com local do tumor ou o estágio do tumor. Da mesma forma, não há associações foram vistos com a idade, nem em casos nem nos controlos livres de neoplasia (dados não mostrados).

Para avaliar se os níveis de expressão dos miARNs investigados estão associados com o desenvolvimento de CRC, os pacientes eram estratificada por fases AJCC. Em geral, os níveis de expressão eram muito semelhantes em cancros fase precoce e tardia. MiR-18a, 20a, 21, 29a, 133a, 143 e 145 foram encontrados para ser sobre-expresso no plasma de pacientes de CRC nas fases iniciais comparados com os controles sem neoplasia. MiR-18a, -20, -21, -92a, -133a, -143, -145 e -181b mostraram níveis de expressão mais elevados no plasma de pacientes com CCR em estágios tardios em comparação com controles sem neoplasia. MiR-181b apresentaram maior expressão no plasma de pacientes estágio CRC atrasados ​​do que os pacientes estágio CRC primeiros (Tabela 2).

(iii) A análise multivariada.

Com o painel de 12 miRNAs (miR-18a, -20, -21, -29, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p, -532-3p), o ROC análises rendeu um não ajustado AUC de 0,803 (IC 95%: 0,774-0,888) e um ajustado, ou seja, corrigido de optimismo, AUC de 0,745 (IC 95%: 0,708-0,846). As curvas ROC estão representados na Figura 2. Para cada miARN, as curvas ROC estão representados na Figura S1.

ajuste durante mais de optimismo foi feito pelo método de bootstrap the.632 +. Abreviaturas:. AUC, área sob curva ROC

A expressão de miRNAs em avançado Adenoma pacientes e controles Neoplasia-Grátis de

adenomas colorretais avançadas representam um estágio precursor da CRC. Para avaliar o uso potencial para a detecção precoce, mesmo de adenomas avançados, os identificados 12 miRNAs foram determinadas por qRT-PCR em amostras de plasma de 100 participantes do estudo (50 com adenoma avançado e 50 controles sem neoplasia). Foram observadas diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão de miRNA no plasma de pacientes adenoma e controles avançados livre de neoplasia.

correlações dos níveis de expressão de Plasma miRNAs

Entre os participantes da fase de validação, forte foram observadas correlações entre os níveis de miR-18a e miR-20a (r = 0,800, p 0,001) de expressão, que são ambas codificadas no agrupamento de miR-17-92; miR-143 e miR-145 (r = 0,762, p 0,001), que são ambas codificadas no agrupamento de miR-143/145; e miR-29a e miR-106b (r = 0,694, p 0,001), dois miRNAs intimamente que residem no cromossomo 7q. Os níveis de alguns outros miARNs que não são colocados no genoma de expressão também foram altamente correlacionadas. Por outro lado, o miR-92a que também é codificada em conjunto miR-17-92 não estava altamente correlacionada com miR-18a ou miR-20a (R = 0,340 e 0,251, respectivamente) (Tabela S3).

discussão

neste estudo, foram comparados os níveis de doze miRNAs em amostras de plasma de pacientes com CCR e controles livres de neoplasia de expressão. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório sobre circulando miRNA para detecção CRC utilizando TaqMan MicroRNA Array para miRNA perfil. Cinco miRNAs (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) foram identificados a partir do microarray analisa e sete foram selecionados a partir da literatura (miR-18a, -20, -21, -92a, -143, -145, -181b) para posterior investigação [17]. Em nosso estudo de validação, os níveis de miR-18a, -20, -21, -29, -92a, -106b, -133a, -143 e -145 expressão foram encontrados para ser significativamente maior em pacientes com CCR do que em neoplasm- controles livres. análise ROC dos miRNAs identificados ajustados para excesso de otimismo por inicialização produziu uma AUC de 0,745 (IC 95%: 0,708-0,846). Este resultado compara favoravelmente com os resultados de outras análises de sangue para detecção CRC [5].

características de diagnóstico de circulando miRNAs para CRC foram previamente avaliados em dois estudos recentes. Ng et al. relatado 0,89 sensibilidade e especificidade de 0,70 em um determinado ponto de corte de miR-92a, e uma AUC de 0,885 (IC 95%: 0,83-0,94) com base em 90 pacientes com CCR (estágio TNM I /II /III /IV: 6 /34/23/27) e 50 controlos [10]. Huang et ai. relataram 0,830 0,847 sensibilidade e especificidade, e uma AUC de 0,883 (Cl 95%: 0,830-0,937) obtido em uma análise multivariada, incluindo o miR-29a e miR-92a com base em 100 pacientes de CRC (TNM fase I /II /III /IV : 27/25/38/10) e 59 controles [9]. Assim, ambos os estudos encontraram estimativas de AUC superiores obtidos no presente estudo. Estes estudos não tinha ajustado por excesso de optimismo. Enquanto o intervalo de confiança de 95% (,774-,888) da AUC não ajustados em nosso estudo abrangeu as AUC relatados por Ng et al. e Huang et al., o ajuste para excesso de optimismo atenuou a AUC em cerca de 6 por cento de unidades. No entanto, mesmo a nossa estimativa AUC não ajustada foi um pouco menor do que os relatados anteriores, apesar do maior número de miRNAs incluídos. Os fatores que podem, em parte, responsáveis ​​por essas diferenças incluem a distribuição estágio de CRCs e oportunidade. A percentagem de doentes CRC início de carreira (AJCC fase I e II) foi maior em nosso estudo (59%) do que nos estudos previamente relatados (44% e 52%, respectivamente) e, provavelmente, mais perto a distribuição estágio esperado em um ambiente de triagem [5]. No entanto, não houve grande diferença dos níveis de expressão por etapa em nosso estudo.

adenomas colorretais representam um estágio precursor da adenocarinoma. Um estudo anterior havia relatado que a expressão diferencial de plasma miR-29a e miR-92a também pode discriminar pacientes adenoma avançados de controles sem neoplasia, embora a discriminação era menos pronunciada do que para pacientes de CRC [9]. No nosso estudo, nenhum dos miARNs investigados foi significativamente expresso diferencialmente nos doentes de adenoma avançada em comparação com os controles isentos de neoplasma. Estes resultados sugerem que os investigados miARN pode não ser útil para o diagnóstico de adenomas avançados. No entanto, a falta de diferenças significativas também pode ser devido ao poder limitado de detectar diferenças moderadas com o tamanho da amostra do nosso sub-estudo comparando portadores de adenomas avançados e indivíduos sem neoplasia Dada a observada falta de expressão diferencial de miRNAs individuais, um modelo multivariada para predição de adenomas avançados não foi aplicado.

Embora a expressão diferencial de plasma miR-18a, -20, -21, -106b, -133a, -143, -145 e -181b em pacientes CRC foi examinada em alguns estudos em amostra de tecido [24] – [27], isto é, para o nosso conhecimento, relatando o primeiro estudo sobre a expressão destes miARNs em amostras de plasma de um grande número de pacientes com CCR e controlos livres de neoplasma. diferenças estatisticamente significativas na expressão de todos os analisados ​​miRNAs exceto miR-181b, miR-342-3p e foram observados miR-532-3p. Curiosamente, os nossos dados mostram que os níveis de -143 miR-133a expressão, e -145 foram significativamente sobre-expressos no plasma de pacientes de CRC em comparação com os controlos livres de neoplasia, a qual parece contradizer dados que mostram consistentemente menor expressão destes três estudos miRNAs em câncer em amostra de tecido com base [28] – [34]. Novos estudos, com maior número de pacientes e medições simultâneas de expressão miRNA no plasma e tecido pode ser garantido para esclarecer esta questão.

Um problema comum na pesquisa sobre circulando miRNAs é que nenhum controle interno consenso foi estabelecido. Foram avaliados o miR-16, o miR-188-5p e RNU6B, e devido à expressão consistente, estável e alta em todas as amostras de plasma, o miR-16 foi seleccionada como controlo interno nos testes baseados amostra de plasma, mas validações mais empíricos são ainda precisava de um consenso sobre os controles internos robustos e precisos.

os nove miRNAs encontrados para ser sobre-expresso no plasma de pacientes de CRC em nosso estudo também foram investigados com relação às outras doenças na pesquisa anterior [9] [10], [33], [35] – [48]. (Tabela 3) Por exemplo, o plasma de miR-21 foi encontrado para ser sobre-expresso em uma ampla variedade de doenças malignas incluindo carcinoma hepatocelular, cancro da próstata, e cancro gástrico [35], [36], [42], [46] – [49]. Estas semelhanças no padrão de expressão de miR-21 em diferentes tipos de câncer suggestes que miR-21 função de poder como um oncogene. investigações funcionais mostraram que os genes supressores de miR-21 alvos de tumor tais como a fosfatase e tensina homólogo (PTEN) e inversamente regula a sua expressão [50]. PTEN é classificada como o segundo gene supressor de tumor mais frequentemente mutado após p53. Ele pode ser inactivado por mutação com a perda de heterozigosidade, metilação do promotor, a interferência miARN e alguns outros mecanismos em um certo número de cancros, incluindo o cérebro, da próstata, cancro uterino [51]. A expressão diferencial de alguns miRNAs em vários cancros apoiar as sugestões de que eles deveriam normalmente ser combinado com miRNAs adicionais quando usado para a detecção de cânceres específicos.

Há algumas limitações que precisam ser levados em conta na interpretação do os resultados deste estudo. Em primeiro lugar, a dimensão da amostra é ainda pequena, especialmente na fase de marcador de selecção. Em segundo lugar, uma grande quantidade de abundâncias ‘miARNs no plasma são demasiado baixa para ser quantificada de forma precisa por qRT-PCR, por conseguinte, algumas potenciais marcadores relevantes poderia não ser considerada. Em terceiro lugar, continua a ser determinado até que ponto modificado níveis de miRNAs encontrados entre pacientes com CCR neste estudo expressão são específicas CRC.

Conclusões

Plasma miRNAs parecem ser biomarcadores potencialmente úteis para a detecção precoce e diagnóstico do CRC. Embora a investigação sobre o plasma com base de perfis miRNA ainda está em fase muito precoce em comparação com a pesquisa sobre o tecido com base de perfis de miRNA, pode ter o potencial para contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens de não-invasivo, com base no sangue CRC triagem. No entanto, o desempenho diagnóstico do painel identificados de miRNAs pode ainda não ser suficiente para competir com o desempenho de alguns outros testes não-invasivos, nomeadamente os ensaios imunoquímicos fecais de sangue oculto [52]. Mais estudos sobre um teste com base no sangue multi-marcador, potencialmente incluindo o painel de miRNAs identificados neste estudo pode ser uma abordagem promissora para aumentar o repertório para o rastreio do cancro não invasivo.

Informações de Apoio

Figura S1 .

Curvas ROC usando 12 microRNAs selecionados (miR-18a, -20, -21, -29, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p e miR- 532-3p) para a discriminação de 80 pacientes com câncer colorretal e 144 controles sem neoplasia. Abreviaturas: FPR, taxa de falsos positivos. TPR, a verdadeira taxa positiva. . AUC, área sob curva ROC

doi: 10.1371 /journal.pone.0062880.s001

(DOC)

Tabela S1.

667 microRNAs humanos testados utilizando TaqMan MicroRNA matriz

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062880.s002

(DOC)

Tabela S2. piscinas

RT-iniciadores utilizados para multiplex PCR em tempo real quantitativa

doi: 10.1371. /journal.pone.0062880.s003

(DOC)

Tabela S3.

Spearman coeficientes de correlação dos níveis de expressão de microRNAs entre 324 participantes da validação (p 0,001, se não anotada)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062880.s004

(DOC)

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