Abstract

Na era da terapia-alvo, a mutação de perfis de câncer é um aspecto crucial da tomada de decisões terapêuticas. Para caracterizar o cancro a um nível molecular, o uso de tecido embebido em parafina e fixado em formalina é importante. Testamos o v2 Painel Ion AmpliSeq Cancer Hotspot e nCounter Copiar número de variação do ensaio em 89 amostras de câncer gástrico embebidos em parafina fixadas em formalina para determinar se eles são aplicáveis ​​em amostras clínicas de arquivamento para terapias direcionadas personalizados. Nós validado com os resultados de sequenciação de Sanger, PCR em tempo real quantitativo, de fluorescência de hibridação in situ e imuno-histoquímica. detectados frequentemente mutações somáticas incluídos

TP53

(28,17%),

APC

(10,1%),

PIK3CA

(5,6%),

KRAS

(4,5 %),

SMO

(3,4%),

STK11

(3,4%),

CDKN2A

(3,4%) e

SMAD4

(3,4%) . Amplificações de

HER2

,

CCNE1

,

MYC

,

KRAS Comprar e

EGFR foram observadas

genes em 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1.1%) e 1 (1,1%) casos, respectivamente. Nos casos com a amplificação, hibridação in situ fluorescente para

HER2

amplificação do gene verificada e imuno-histoquímica para HER2, CCNE1 EGFR e verificou-se a sobre-expressão de proteínas em células de tumor. Em conclusão, foi realizada com sucesso sequenciação à base de semicondutores e analisa a variação nCounter número de cópias em amostras de câncer gástrico embebidos em parafina fixadas em formalina. high-throughput screening em amostras clínicas de arquivo permite uma detecção mais rápida, mais precisa e de baixo custo de mutações de ponto de acesso ou amplificação dos genes

Citation:. Kim S, Lee J, Hong mim, não IG, Kang SY, Ha SY, et ai. (2014) High-throughput seqüenciamento e número do exemplar de detecção Variação Usando fixados em formalina tecido embebido em metastático câncer gástrico. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10.1371 /journal.pone.0111693

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 28 Abril de 2014; Aceito: 29 de setembro de 2014; Publicação: 05 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Coréia Healthcare Tecnologia R D Project, Ministério da Saúde Assuntos de bem-estar, República da Coreia (A101130) e uma subvenção Instituto de Pesquisa Biomédica Samsung (# SBRI-SP1B20112). Este estudo também foi apoiado por uma concessão intramural Samsung Medical Center, 20 x 20 Projeto (# GFO1140111). Os co-autores Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Bae Lua, Sung Kim e Kyoung-Mee Kim são empregados por Samsung Medical Center. Co-autor Duk-Hwan Kim é empregada pela Samsung Biomedical Research Institute. Samsung Biomedical Research Institute e Samsung Medical Center forneceu apoio sob a forma de salários para os autores Seokhwi Kim, JL, meh, IGD, SYK, SYH, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Sung Kim, KMK e DHK , mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: Este estudo foi financiado em parte pela Samsung Biomedical Research Institute e Samsung Medical Center. Os co-autores Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Bae Lua, Sung Kim e Kyoung-Mee Kim são empregados por Samsung Medical Center. Co-autor Duk-Hwan Kim é empregada pela Samsung Biomedical Research Institute. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Enquanto o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum no mundo, é o segundo principal causa de morte. [1] Sua incidência é significativamente maior em países asiáticos, incluindo a Coréia, onde é o segundo câncer mais comum. [2] Recentemente, várias terapias direcionadas para o câncer gástrico foram descobertos, que fornecem opções adicionais para médicos e pacientes [3] – [5]

Na era da terapia-alvo, perfil mutação do câncer causador. é crucial para as decisões terapêuticas. As tentativas de perfil mutações foram feitas utilizando sequenciamento Sanger tradicional; No entanto, isso não é um método óptima em situações clínicas devido ao custo, tempo e trabalho necessário. Além disso, seqüenciamento Sanger requer quantidades substanciais de DNA; avaliar pequenas quantidades de amostra para vários genes ao mesmo tempo não é possível. Introdução de próxima geração de sequenciamento métodos (NGS) resolveu este problema por sequenciação multiplex, alto rendimento de muitas amostras de vários genes simultaneamente. [6], [7] Uma das plataformas NGS, o Painel de cancro Ion Torrent AmpliSeq, baseia-se na detecção de não-óptico de iões de hidrogénio em um dispositivo semicondutor, [8] e é capaz de detectar 2,855 mutações oncogénicas em 50 genes vulgarmente mutadas (Tabela S1). É superior a outros métodos de sequenciação à base de espectroscopia de massa, proporcionando sequenciamento resultados mais rapidamente e com menor custo. [8] É aplicável em espécimes embebidos em parafina (FFPE) de tecidos fixados em formalina e com pequenas quantidades de ADN. Porque garante alta sensibilidade no rastreio conhecido mutações oncogênicas, [9], [10] o Painel de cancro da Ion Torrent AmpliSeq é a escolha de 5 centros de câncer principais nos Estados Unidos para o diagnóstico molecular em terapia-alvo [11].

a amplificação de oncogenes é um mecanismo importante para a sobre-expressão do gene e contribui para o desenvolvimento do tumor. [12] Os exemplos incluem a amplificação do

HER2

,

MET

,

FGFR2

e

KRAS

genes em cancros gástricos. [13], [14] para a detecção de variações no número de cópias (CNVs) em amostras clínicas, hibridação in situ fluorescente (FISH) e /ou imuno-histoquímica (IHC) tem sido amplamente usado. No entanto, elevados custos e pequenas amostras de biópsia de materiais limitam a aplicação destes métodos, e há ainda uma necessidade de novas tecnologias de alto rendimento com a fácil acessibilidade, elevada sensibilidade e baixo custo. Codesets nCounter CNV (tecnologias Nanostring, Ciências Biológicas, Seattle, WA) fornecer uma precisão superior e reprodutibilidade de estudos de todos os tamanhos e produzir melhores resultados, mais rapidamente com substancialmente menos esforço do que com a reação em tempo real em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) ou matrizes CNV [ ,,,0],15].

tratamento do câncer melhor sob medida pode melhorar o resultado paciente. amostras de tumores de doentes vai ser necessário, a fim de caracterizar o cancro a um nível molecular e identificar os subgrupos de doença que deve receber tratamentos diferentes. O uso de tecido FFPE é importante para permitir que esses estudos. [16] Aqui nós testamos AmpliSeq e nCounter personalizados painéis CNV em amostras de câncer gástrico FFPE para determinar se eles são aplicáveis ​​em amostras clínicas de arquivamento para terapias direcionadas personalizados.

Materiais e Métodos

Amostras

a percentagem de células tumorais com mais do que 75% foram dissecados sob microscopia de secções coradas 4 mm, em comparação com um de H e coradas corrediça, e o ADN genómico foi extraído usando um kit de tecido ADN Qiagen FFPE (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante de 96 pacientes com câncer gástrico avançado. Após extracção, medimos concentração, bem como 260/280 e 260/230 relação nm por espectrofotometria (ND1000, NanoDrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, EUA). Cada amostra foi então quantificada com o fluorómetro Qubit (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia). O ADN genómico com 10 ng medido pelo fluorómetro Qubit foi sujeito a preparação da biblioteca e sete amostras falharam para construir bibliotecas e foram excluídos deste estudo. Finalmente, 89 casos foram finalmente analisados ​​e incluídos 31 do sexo feminino e 58 do sexo masculino. A Tabela 1 apresenta as características clínicas e patológicas dos pacientes neste estudo. Recidiva ou metástase desenvolvido em 11 pacientes com período médio de acompanhamento de 76 meses (variação de 5,5-149,3). O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) no Samsung Medical Center. Tudo investigação clínica foi realizada de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. O consentimento informado foi dispensado pelo IRB devido à análise retrospectiva e os dados anónimos. As amostras foram coletadas como parte de um procedimento médico de rotina e foram recolhidas pelos autores deste estudo. As amostras de pacientes falecidos ou pacientes vivos estavam todos de-identificados, incluindo a remoção de toda e qualquer informação demográfica, antes da análise e formulário de consentimento informado foi dispensado pelo IRB.

Painel de câncer Ion AmpliSeq v2

foi utilizado o Painel Cancer Ion AmpliSeq v2 (Ion Torrent) para detectar mutações somáticas frequentes que foram selecionados com base na revisão da literatura. Examina 2855 mutações em 50 oncogenes mutados comumente e genes supressores de tumor (Tabela S1). Em primeiro lugar, 10 ng de ADN de cada uma das 89 amostras tumorais FFPE foram submetidos a um único tubo, amplificação por PCR multiplex utilizando o Ion AmpliSeqCancer pool de primers e os reagentes Ion AmpliSeqKit (Life Technologies). O tratamento dos produtos de amplificação resultantes com FUPA Reagente digerido parcialmente os iniciadores fosforilados e os produtos de amplificação. Os amplicons fosforilados foram ligados para Ion Adaptadores e purificada. Para a preparação da biblioteca com código de barras, nós substituído adaptadores de código de barras a partir do 1-96 Kit Ion Xpress código de barras Adaptadores para a mistura adaptador não-código de barras fornecida no Kit Ion AmpliSeq Library. O DNA ligado passou por nick-translation e amplificação para completar a ligação entre os adaptadores e amplicons e gerar material suficiente para a preparação de modelo a jusante. Duas rodadas de Agencourt AMPure XP reagente de ligação em 0.6 e 1.2 índices de volume do grânulo-a-amostra colhida DNA entrada e primers não incorporados dos amplicons. As moléculas de biblioteca finais foram 125~300 pb de tamanho. Em seguida, transferiu as bibliotecas para o OneTouch Sistema Ion para a preparação automática de modelos. A sequenciação foi realizada no sequenciador Ion PGM de acordo com as instruções do fabricante. Usamos IonTorrent Software para análise de dados automatizado.

Para medir a sensibilidade e especificidade do painel câncer do Ion AmpliSeq, inteiros exome sequenciamento resultados a partir de 4 amostras de câncer gástrico com estado de mutação conhecida foram utilizados [17].

nCounter Copiar número de variação codesets

Para a detecção de CNV, codesets Número nCounter Copiar Variação foram usados ​​com 300 ng de ADN genómico purificado extraído de 2-3 seções de FFPE blocos de tumor representante 4 mícrons de espessura utilizando QIAamp ADN FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA foi fragmentado por digestão Alui e desnaturadas a 95 ° C. ADN fragmentado foi hibridado com o conjunto de códigos de 86 genes do cancro CN Assay Kit nCounter (Nanostring Technologies) durante 18 horas a 65 ° C e processado de acordo com as instruções do fabricante. O nCounter Digital Analyzer contados e apurados os sinais de sondas repórter e números de contagem média de 3 foram chamados e confirmado por IHC, FISH ou PCR em tempo real

IHC para HER2, EGFR (HER1) e CCNE1.

para a validação dos resultados obtidos a partir da CNV nCounter, realizamos IHC para HER2 em todos os casos, e EGFR e CCNE1 em casos selecionados. Após desparafinização e reidratação, 4 seções mm em lâminas com revestimento de silano histoquímica para HER2. O HercepTest (Dako, Glostrup, Dinamarca) foi utilizado de acordo com as orientações do fabricante, como descrito anteriormente. [18] Para o EGFR foi utilizado anticorpo anti-NCL-EGFR-L-384 de rato monoclonal primário (diluição 1:100; Novocastra /Visão Biosystems, Newcastle, UK) e para CCNE1 o uso do anti-CCNE1 /ciclina E1 anticorpo (clone HE12 ; 1:200 diluição; Thermo Fisher Scientific, MA). O sistema de processamento automatizado corrediça Ventana BenchMark XT foi utilizada de acordo com o protocolo do fabricante. Um patologista especialista (KMK) avaliaram os resultados

FISH para HER2

FISH foi realizada utilizando sondas específicas de DNA dual-cores da PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ e CEP 17 SpectrumGreen ™) como anteriormente descrito em casos com sobreexpressão de HER2 ambígua. [19] Nós contamos os sinais de hibridação em 20 núcleos por amostra sob um microscópio fluorescente (Zeiss Axioskop), utilizando conjuntos de filtros recomendados pelo Vysis (DAPI /Spectrum laranja dupla de banda, DAPI /Spectrum verde dupla de banda). Todos os núcleos que se sobrepõem foram excluídos, e apenas núcleos com uma borda nuclear distintas foram avaliados.

gene HER2

amplificado foi considerado quando o rácio sinal FISH de

HER2 /CEP17

foi maior do que ou igual a 2,0 [20].

-PCR em tempo real para KRAS e amplificação MET

Foram utilizados DNAs obtidos a partir de tecidos tumorais FFPE carcinoma gástrico. A mistura reaccional continha 2 uL molde de ADN genómico, 10 uL de mistura de PCR universal mestre Taqman (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) e 0,2 uM de cada iniciador. Para a detecção precisa de alterações NC, foram analisados ​​três diferentes regiões do

gene KRAS

: uma região dentro intron 1 (TaqMan Copiar Número Ensaio Hs06943812_cn), uma região dentro intron 2 (Hs002534878_cn), e uma região dentro do exão 6 (Hs02739788_cn). . Para

gene MET

, foram utilizados os iniciadores tal como descrito anteriormente [21]

Medimos cópia ganho número usando o seguinte perfil: 2 min a 50 ° C, a desnaturação a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Nós determinamos quantificação relativa usando o rápido sistema de PCR em tempo real 7900 HT em quadruplicado. Um kit de ensaio de RNaseP (Applied Biosystems) foi utilizado como um controlo. Após a amplificação, que importou os resultados da experiência contendo valores de ciclo limite para o número de cópias e ensaio de referência para o Software CopyCaller (Applied Biosystems) para análise de dados pós-PCR, como descrito anteriormente. [22] Nós atribuído o status ganho CN eo número de

KRAS

cópias com base no concordância dos resultados em pelo menos duas das três sondas.

Métodos analíticos

foram excluídas todas as alterações sinónimas depois de um algoritmo de chamada de mutação automatizado foi usado para detectar mutações supunha. chamadas recorrentes em mais de 10 de 89 amostras foram consideradas como falso positivo e foram excluídos. Nós usamos valores de corte de frequência variante mais de 6% e mais de cobertura X100 para detectar mudanças verdadeiras mutações, de acordo com estudos anteriores e nossa própria experiência. [9], [10] Nós filtrados polimorfismos de nucleotídeo único após revisão manual de cada polimorfismo no Catálogo do Somatic Mutações em Câncer (COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) ( Figura 1). Para genes bem conhecidos mutantes em carcinomas gástricos (

TP53

,

APC

,

PIK3CA

,

STK11

,

CDKN2A

,

KRAS

,

HRAS

,

BRAF

e

CTNNB1

), uma revisão manual de resultados de chamada automatizados foi realizada para pegar mutações deletérias com baixo teor ligeiramente frequência variante.

resultados

os resultados do painel de câncer Ion AmpliSeq

as concentrações de DNAs, seu rebanho concentração, a cobertura média das amostras, o número total de bases, Q20 bases, lê-se, significa ler comprimento, mapeou lê, on-meta para a taxa (%), média profundidade e uniformidade dos resultados estão descritos na Tabela S2. No total, obtivemos 8178 chamadas variantes de 89 amostras, entre eles 3554 chamadas foram alterações não sinónimas. Depois de filtrar as chamadas recorrentes, 6% de frequência variante de alelo, cobertura 100X e aquelas na região intrão, foram selecionados 65 chamadas variantes. Além disso, analisamos as chamadas automatizadas em mutações conhecidas, tais como

BRAF

,

KRAS Comprar e

PIK3CA Comprar e poderia salvar duas chamadas variantes, que foram excluídos durante a filtragem processos. Trinta e nove dos 89 amostras (43,8%), continham pelo menos uma mutação (Figura 1). Dois casos apresentaram 22 e 5 mutações, respectivamente. O último caso abrigou

MLH1

mutação somática [mutação sem sentido no exão 20: c.1147A G (p.M383 V)] e

MLH1

hipermetilação promotor com perdas de proteínas MLH1 por IHC utilizando o métodos anteriormente descritos, [23] sugerindo tumor hipermutada. No entanto, embora as mutações encontradas na antiga frequência variante caso passou e cobertura cortar offs, essas mutações não foram confirmadas por seqüenciamento Sanger, sugerindo falso positivo, neste caso, devido à má qualidade do DNA. Assim, neste caso, foi excluído da análise final dos resultados. detectados frequentemente mutações somáticas incluídos

TP53

(24 casos, 27,0%),

APC

(9 casos, 10,1%),

PIK3CA

(5 casos, 5,6%), %),

KRAS

(3 casos, 3,4%),

SMO

(4 casos, 4,5%),

STK11

(3 casos, 3,4%),

CDKN2A

(3 casos, 3,4%), e

SMAD4

(3 casos, 3,4%) como mostrado na Tabela 2. a Tabela 2 também resumidas as alterações de aminoácidos nos genes frequentemente mutados. Foram identificados 19 pacientes (21,3%) com duas ou mais mutações somáticas únicas e concomitantes.

Em quatro amostras de câncer gástrico com frequências de mutação conhecido, determinado por toda a sequenciação exome e confirmados pelo seqüenciamento Sanger, identificamos somática mutações no

TP53

,

ErbB4

e

CTNNB1

com nenhuma chamada falso-positivos em outros genes (Tabela S3).

Amplificação por nCounter e validação por IHC, FISH ou PCR em tempo real

As amplificações de

HER2

,

CCNE1

,

MYC

,

KRAS Comprar e

EGFR

genes foram observadas em 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1.1%) e 1 (1,1%) casos, respectivamente (Tabela 3). Não foi observada amplificação do

MET

,

FGFR2

,

CDK4 Comprar e CDK6 em qualquer dos casos. Em casos com amplificação, IHC para HER2, EGFR e CCNE1 mostrou sobre-expressão de proteínas nas células de tumor (Figura 2A, B e C). Em um caso com HER2 2+ por HercepTest, FISH mostrou amplificação heterogêneo de

HER2

genes (Figura 2D).

Casos com número de cópias aumenta mostraram forte positivo para EGFR (A), CCNE1 ( B) e HER2 (C). Um caso com HER2 2+ por imuno-histoquímica revela a amplificação de genes HER2 nos peixes (D).

Na PCR em tempo real para o

KRAS

, um caso com a amplificação mostrou números aumentaram de cópia (36, 37 e 49); nos casos em que foram negativos para

KRAS

amplificação, não houve aumento do número de cópias (0,9 a 2,4, com média de 1,4).

Para

MET

gene, não encontramos caso positivo por causa de sua raridade [21]. Portanto, nós utilizamos adicional dez (cinco cada amplificada e não amplificada) amostras de câncer gástrico e

MET

amplificado linhas celulares de cancro gástrico (MKN45 e SNU5) com números de cópias conhecidos e mRNA montantes. CNVs detectado por nCounter correlacionados bem com número de cópias detectadas por PCR em tempo real (Tabela S4) e mRNA níveis de

MET

gene (teste de correlação de Pearson; r = 0,874, p = 0,001). (Figura S2)

Discussão

Ao usar Ion AmpliSeq v2 descobrimos que 39 de 89 amostras de adenocarcinoma gástrico avançado continha mutações somáticas, demonstrando que esta plataforma é facilmente aplicável em amostras de arquivo de tecido FFPE.

TP53

foi o mais freqüente mutação, seguido de

APC

,

PIK3CA

e

KRAS

. Além disso, o nosso painel CNV costume detectado com sucesso aumentos NC de

HER2

,

CCNE1

,

MYC

,

EGFR

e

KRAS

genes, o que confirmados por IHQ e PCR em tempo real

frequências mutacionais no banco de dados COSMIC revelam semelhanças substanciais para os dados que obtivemos a partir deste estudo:.

TP53

(32%),

PIK3CA

(10%),

KRAS

(6%),

APC

(6%),

CTNNB1

(5%),

CDKN2A

(5%),

FBXW7

(5%),

SMO

(4%),

ERBB2

(2%) e

STK11

(2%). Estudos toda exome sequenciamento recentes sobre adenocarcinoma gástrico mostrou frequências um pouco mais elevados de

TP53

(36% e 73%) e

PIK3CA

(14% e 20%) mutações em comparação com os nossos resultados. [24], [25] Apesar de nossas frequências de mutação foram menores quando comparados com exome resultados de sequenciamento, houve um aumento significativo quando comparado com os nossos dados anteriores sobre espectrometria de massa com base em OncoMap v4. [26] Ambos AmpliSeq e OncoMap detectar mutações nas regiões de ponto de acesso, que explicam resultados de mutação menos frequente em alguns oncogenes e genes supressores de tumor. Figura S1 compara AmpliSeq V2 e V4 OncoMap em perfis mutacionais detectáveis. testes OncoMap anteriores em 237 adenocarcinomas gástricos revelou que

PIK3CA

mutações foram freqüentes em estágios avançados da doença (5,1% em Fase IV; 6,4% em fase II /III; 2,4% em estádio IB). [26] Neste estudo, observamos três

PIK3CA

mutações em pacientes com estágio III e dois na doença em estágio II, apoiando o seu papel biológico na progressão tumoral. Observamos, também,

HER2

(

ERBB2

) c.2524G A (V842I) mutação em um caso de câncer gástrico. Em estudos pré-clínicos, linhas de células que abrigam a mutação V842I eram resistentes ao trastuzumab, mas foram sensíveis ao inibidor irreversível HER2, neratinib [27].

sequenciação à base de semicondutores tem diferenças fundamentais na detecção e transdução de sinal em comparação com espectrometria de massa sequenciamento baseado. Em vez de usar métodos ópticos para detectar alterações de nucleótidos, a técnica baseada em semicondutores detecta mudanças de pH por liberação de prótons (H

+), quando nucleotídeos integrar a cadeia de ADN em crescimento. [8] Por isso, há uma redução significativa no custo e o tempo requerido para o processamento de dados em comparação com outras plataformas NGS. O fornecimento de informações rápidas e precisas sobre as mutações de baixo custo é crucial para pacientes com cancros altamente agressivos, incluindo câncer gástrico.

Neste estudo, nós manualmente avaliaram as chamadas automatizadas em mutações conhecidas após a aplicação de valores de corte de frequência e cobertura, adicionando subsequentemente duas chamadas com baixa cobertura variante. Embora os valores de cobertura não atingiu os nossos critérios iniciais, as suas frequências excedeu a nossa primeira configuração (6%) e da qualidade dos dados foi bom. Isso enfatiza a importância da revisão manual após a triagem automatizada. resultados recentemente publicados utilizando AmpliSeq como a plataforma de análise também enfatizam a compensação dos dados de rastreio com revisão manual [9], [10].

terapia personalizada alvo de cancros avançados baseia-se principalmente no conceito de “vício oncogene,” em qual múltiplas anormalidades genéticas são dependentes de um ou alguns genes para a manutenção de células tumorais e sobrevivência. [28] Um open-label, ToGA internacional, a fase 3, randomizado e controlado (Trastuzumab para o cancro gástrico) julgamento indicaram que trastuzumab em combinação com a quimioterapia é uma nova opção padrão para pacientes com câncer avançado junção gástrica ou gastro-esofágico HER2-positivo. [29] Um estudo pré-clínico mostrou que um subconjunto de cânceres gástricos com

EGFR

ou terapia com inibidor da quinase

MET

amplificação e responder superexpressão ao cetuximab ou MET receptor tirosina. [30] Além disso, amplificações de mediador ciclo celular

CCNE1

sugerem o potencial de inibição terapêutica de quinases dependentes da ciclina em cancros gástricos. [31] O rastreio genes amplificados para terapia-alvo com a tecnologia de elevado rendimento é muito importante. Os métodos tradicionais, como peixe e matriz hibridização genômica comparativa sofrem de baixa resolução de regiões genômicas, alto custo e são trabalhoso e demorado. [32] Neste primeiro estudo sobre nCounter CNV análises, verificou-se que esta tecnologia é aplicável em amostras clínicas FFPE e validou os resultados por IHC, FISH e PCR em tempo real. Apesar de não validar todos os genes utilizados nos iniciadores personalizados, validação resultados em vários genes selecionados foram notável.

Em resumo, foi realizada com sucesso sequenciação à base de semicondutores e analisa nCounter CNV em amostras de tecido FFPE de 89 gástrica adenocarcinomas. sequenciamento de alto rendimento e rastreio CNV em amostras clínicas de arquivo permite uma detecção mais rápida, mais precisa e de baixo custo de mutações de ponto de acesso e CNV em genes. Na era da medicina genômica personalizada, pretendemos usar essas ferramentas para triagem de pacientes com câncer gástrico que podem beneficiar de terapias direcionadas.

Informações de Apoio

Figura S1.

Comparação de cobertura do painel câncer Ion AmpliSeq v2 contra Oncomap v4

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s001

(TIF)

Figura S2. Terrenos de correlação entre

MET

CNVs detectados por níveis nCounter e de mRNA de

MET

gênica por PCR em tempo real

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s002

(TIF)

Tabela S1.

A Lista de Gene para o Painel Cancer Ion Torrent AmpliSeq

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s003

(XLS)

Tabela S2.

As concentrações de DNAs, seu rebanho concentração, a cobertura média das amostras, o número total de bases, bases Q20, lê, significa ler comprimento, mapeou lê, on-meta para a taxa (%), média profundidade e uniformidade.

doi: 10.1371 /journal.pone.0111693.s004

(XLS)

Tabela S3.

mutações somáticas no

TP53

,

ErbB4

e

CTNNB1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s005

(XLS)

Tabela S4.

CNVs detectado por nCounter correlacionados bem com número de cópias detectadas por PCR em tempo real

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s006

(XLSX)