PLOS ONE: MicroRNAs de tecidos como preditores de evolução em pacientes com câncer colorretal metastático tratados com Primeira Linha capecitabina e oxaliplatina com ou sem Bevacizumab

Abstract

Purpose

Nós testamos a hipótese de que a expressão de microRNAs (miRNAs) em tecido de cancro pode prever eficácia do bevacizumab adicionado a capecitabina e oxaliplatina (CAPEOX) em pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC).

Experimental design by

Os pacientes com mCRC tratados com o primeiro linha CAPEOX e bevacizumab (CAPEOXBEV): triagem (n = 212) e validação (n = 121) coortes, ou CAPEOX sozinho: grupo de controlo (n = 127), foram identificados retrospectivamente e amostras de tumor primário de arquivamento foram recolhidos. Expressão de 754 miARNs foi analisado na coorte de rastreio utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) matrizes e os níveis de expressão foram relacionadas com o tempo de progressão da doença (TTP) e sobrevivência global (OS). miRNAs significativas a partir do estudo de despistagem foram analisados ​​em todos os três coortes com personalizados matrizes de PCR.

In situ

hibridação (ISH) foi feito por miRNAs selecionados.

Resultados

No estudo de triagem, 26 miRNAs foram significativamente correlacionados com o resultado na análise multivariada. Vinte e dois miARNs foram seleccionados para estudo posterior. Maior expressão de miR-664-3p e menor expressão de miR-455-5p foram preditivos de melhor evolução nas coortes CAPEOXBEV e mostrou uma interação significativa com eficácia bevacizumab. Os efeitos foram mais fortes para OS. Ambos os miARNs apresentaram expressão elevada em células estromais. maior expressão de miR-196b-5p e miR-592 previu melhoria do resultado, independentemente do tratamento bevacizumab, com estimativas efeito semelhante em todos os três grupos.

Conclusões

Nós identificamos miRNAs potencialmente preditivos para bevacizumab eficácia e miRNAs adicionais que poderiam ser relacionadas com a eficácia da quimioterapia ou prognóstico em pacientes com mCRC. Nossas descobertas precisa de maior validação em grandes coortes, de preferência de ensaios randomizados concluídos

Citation:. Boisen MK, Dehlendorff C, Linnemann D, Nielsen BS, Larsen JS, Osterlind K, et al. MicroRNAs (2014) de tecido como preditores de evolução em pacientes com câncer colorretal metastático tratados com Primeira Linha capecitabina e oxaliplatina com ou sem Bevacizumab. PLoS ONE 9 (10): e109430. doi: 10.1371 /journal.pone.0109430

editor: Ratna B. Ray, Saint Louis University, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de julho de 2014; Aceito: 22 de agosto de 2014; Publicação: 15 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Boisen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que, por razões aprovadas, algumas restrições de acesso aplicam-se aos dados subjacentes às conclusões. Os dados estão disponíveis a partir Comitê Institucional Data Access /Ética do Departamento de Oncologia do Hospital Universitário Herlev para os investigadores que preencham os critérios para o acesso a dados confidenciais. pedidos de dados devem ser enviados para Professor Julia S. Johansen em [email protected]

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por um donativo incondicional da Roche Dinamarca (www.roche.dk), o Herlev Fundação Hospital Research (www.herlevhospital.dk), e uma concessão à prova de conceito da Universidade Técnica da Dinamarca (www.dtu.dk). Todas as concessões foram dadas a MKB sozinho, ou a ambos MKB e JSJ. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e os autores deste manuscrito ter a seguinte competindo interesses: BVJ: Roche, consultor /papel consultivo; SEN: Roche, consultor /papel consultivo; PP: Roche, consultor /papel consultivo; JSJ: Roche, honorários e financiamento da investigação; MKB: Roche, o financiamento da investigação. JSJ e MKB são co-inventores sobre a patente aplicação relacionada com os miRNAs mencionados. Informação pedido de patente: Nome “microRNAs para a previsão da eficácia do tratamento e prognóstico de pacientes com câncer”; número do pedido “PCT /DK2013 /050015”. BSN é empregado por uma empresa comercial (Bioneer). Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. A maioria das mortes ocorrem como resultado do desenvolvimento de câncer colorretal metastático (mCRC). Padrão de cuidados para pacientes com CCRm que não podem sofrer ressecção radical das metástases é a quimioterapia sistema com ou sem um agente alvejado [2]. Bevacizumab é um anticorpo monoclonal que se liga ao ligando “factor de crescimento endotelial vascular” (VEGF-A) e, assim, inibe a capacidade dos cancros para produzir novos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes, um processo chamado de angiogénese. Bevacizumab demonstrou eficácia em pacientes com mCRC quando usado em combinação com quimioterapia padrão, mas o benefício é modesto, quando utilizado unselectively e bevacizumab adiciona toxicidade e custos significativos para o tratamento de [3] – [7]. Portanto, a identificação de biomarcadores preditivos para bevacizumab tornou-se um dos principais objetivos da pesquisa com biomarcadores em pacientes com mCRC. Devido à sua adopção generalizada como um tratamento de primeira ou segunda linha padrão [8], a capacidade de individualizar o tratamento bevacizumab teria um grande impacto na prática clínica. Numerosos estudos têm investigado biomarcadores potenciais na forma de RNA, DNA, ou proteína [9], [10]. Nenhum tornou para a clínica. Atualmente, o teste não disponível comercialmente pode identificar os pacientes que serão beneficiados com bevacizumab.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos, ± 22 nucleotídeos de comprimento, não-codificante RNAs envolvidos na regulação pós-transcricional da expressão gênica. Eles têm sido intensamente investigados como biomarcadores em pacientes com cancro, pois os seus níveis de expressão são desreguladas em células de cancro, eles podem influenciar o comportamento de cancro, e são relativamente resistentes à degradação em meios de amostragem utilizada [11] – [16]. Vários estudos têm identificado a desregulação dos miRNAs no tecido tumoral CRC e em amostras de sangue de pacientes com CCR; e alguns dos miRNAs identificados também foram associados com fatores prognósticos como profundidade de invasão, estágio, e de metástases linfáticas, [17]. Além disso, as características moleculares em CRC importantes, tais como a instabilidade micro-satélite (MSI) e

estado mutacional BRAF

foram mostrados para ser associado com os padrões de expressão de miARN distintas [18]. Assim, existe uma forte fundamentação para investigar a utilidade potencial de expressão miARN como um biomarcador preditivo ou prognóstico em pacientes com CCR. Até o momento, nenhum estudo publicado explorou o valor preditivo de expressão miRNA para a eficácia bevacizumab de uma forma abrangente.

O objetivo foi identificar os miRNAs que foram preditivo dos resultados em pacientes com mCRC tratados com capecitabina primeira linha e oxaliplatina com e sem bevacizumab (CAPEOXBEV /CAPEOX) e identificar quais desses miRNAs poderia ser preditivo para o efeito de bevacizumab-adição à quimioterapia.

Métodos

desenho do estudo

a estudo de despistagem mediante a utilização de uma abordagem de matriz foi realizada em amostras de tecido primárias CRC de pacientes tratados com CAPEOXBEV (coorte screening) para identificar miRNAs candidatos com os níveis de expressão relativos aos resultados. Em seguida, os níveis dos miARNs candidatos identificados de expressão foram medidos usando um método mais preciso com determinações em duplicado em três grupos: um subgrupo do grupo de rastreio; uma coorte de validação, que era um grupo independente de pacientes tratados com CAPEOXBEV; e um grupo controle, composto por pacientes tratados somente com CAPEOX.

Os pacientes, extração de dados e pontos finais

Os (microRNAs Tissue bevacizumab em câncer colorretal) BETmiRC estudo incluídos retrospectivamente pacientes com mCRC tratada com o primeiro CAPEOXBEV linha em 10 hospitais dinamarqueses 2006-2011, e os pacientes tratados com primeira linha CAPEOX em Herlev Hospital ou num estudo randomizado 2003-2006 [19], antes de bevacizumab foi aprovado, conforme descrito anteriormente [20] .A final pontos de tempo para progressão da doença (TTP) e sobrevida global (OS) foram medidos a partir do início do tratamento para a progressão da doença ou morte por qualquer causa, respectivamente (definição detalhada em S1 Arquivo). status vital foi atualizado 05 de julho de 2013.

As amostras de tecido

blocos (FFPE) de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina contendo amostras de tumores primários foram recuperados usando a Patologia Registro Nacional. As amostras de controlo de pacientes ressecados para a doença inflamatória dos intestinos também foram incluídos. Um patologista gastro-intestinal experiente (DL) selecionado blocos que tecido para recuperar e marcou os blocos para a porcentagem de células tumorais. Três seções de 10 ^ m foram cortados de cada bloco, sem micro ou macro-dissecção e os cortes foram colocados em tubos Eppendorf estéreis. Todas as amostras de tecido foram recolhidos antes de qualquer tratamento sistémico ou radioterapia.

miARN análise de expressão

O RNA foi purificado utilizando o Kit de miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Alemanha) usando as instruções do fabricante. A ordem de purificação foi randomizado para as amostras de coorte de validação e de controlo. O miARN não humano ATH-miR-159a foi adicionado a cada amostra antes da síntese de ADNc como um

foi usado espiga no controle. A TaqMan MicroRNA humano matriz A e B Jogo de cartões v3.0 (Applied Biosystems) para quantificar a expressão de 754 miRNAs humanos com análises individuais no estudo de triagem. No estudo subsequente do screening- reduzida, validation- e coortes de controle, expressão miRNA foi medido utilizando TaqMan personalizado LDA cartões (Applied Biosystems) profiling 22 miRNAs selecionados em duplicata com 8 amostras em cada cartão. Os 22 miRNAs foram selecionados a partir do estudo de despistagem e os cartões micro-fluídicos foram pré-configurado a partir do fabricante de acordo com nossas especificações. As amostras foram analisadas de forma aleatória sobre os cartões personalizado LDA.

As instruções e reagentes do fabricante foram utilizados em todas as etapas (https://www.products.appliedbiosystems.com). Todos os estudos de expressão de ARN e purification- miARN foram realizadas por AROS Applied Biotechnology (Aarhus, Dinamarca). A empresa foi cego para toda a informação clínica.

Mirna

hibridização in situ

A hibridização in situ

(ISH) foi realizada utilizando double-FAM ( carboxifluoresceína) marcado bloqueado ácidos nucleicos (LNA [21]) sondas (Exiqon, Vedbæk, Dinamarca) para miR-185-5p, miR-455-5p, miR-592, miR-664-3p, miR-21-5p e miR-126-3p, como previamente descrito [22]. Todos os estudos ISH foram realizadas por Bioneer (Hørsholm, Dinamarca).

A análise estatística

No cálculo do tamanho da amostra foi feito antes do início do estudo. Nosso objetivo para o maior tamanho da amostra possível e tamanhos iguais das três coortes

analisa expressão Mirna -.. Triagem estudo

limiar ciclo Raw (C

t) para cada miRNA foi verificada para outliers e dados foram corrigidos usando valores de pico-in. Num método de selecção univariada, a expressão de cada miARN estava relacionada com TTP e OS usando um modelo de risco proporcional de Cox (CPH) [23], [24]. miRNAs candidatos foram incluídas em um modelo CPH multivariada ajustada para idade, sexo, histologia, número de sítios metastáticos, localização do tumor primário e tratamento adjuvante anterior, que foi simplificado usando um procedimento de eliminação para trás com base no Critério de Informação de Akaike [25]. A análise foi então repetido para conjuntos de dados normalizados utilizando quantile- e normalização dizer. Finalmente, foram selecionados 22 miRNAs para um estudo mais aprofundado principalmente com base em seu desempenho nas análises multivariadas. O número de miRNAs para incluir no segundo estudo foi escolhido de forma pragmática, uma vez que permitiu medições duplicadas sobre a plataforma personalizada

analisa expressão Mirna -.. Screening-, validation- e coortes de controle

significa C

T das medições em duplicado e foi calculada a transformada 40-C

t. Se uma das duas medições não foi determinada, utilizou-se o C

t da outra medição. Em cada uma das três coortes, expressão dos miRNAs 22 estava relacionado com TTP e OS usando modelos CPH com ajuste para idade, sexo, localização do tumor primário, tratamento adjuvante anterior, eo número de locais metastáticos. Os resultados foram apresentados como taxas de risco (HR) por aumento do intervalo inter-quartil em nível de expressão com intervalos de confiança de 95% (CI) .A possível interação entre o nível de expressão de miRNA e efeito do tratamento bevacizumab foi testado em três coortes combinados usando um teste de razão de verossimilhança .

Desde resultado para os pacientes tratados com bevacizumab diferia muito, dependendo da localização do tumor primário [20], nós também realizadas análises a interação para proximal e distal cânceres primários separadamente.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo e sem correções formais para comparações múltiplas foram feitas. Os pacotes de software estatístico R [26] (www.r-project.org) e GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) foram utilizados para todas as análises.

Alvo previsão

in silico

previu genes alvos para miRNAs selecionados foram identificados usando a abertura de acesso ferramenta de Diana-microT-CDS (http://www.microrna.gr/microT-CDS) [27].

Ética

o estudo foi aprovado pelo Comité Regional Scientific Ética da Região Capital da Dinamarca (http://www.regionh.dk/vek, número de aprovação: H-1-2010-081). Uma vez que este estudo retrospectivo não teria qualquer influência sobre o tratamento e uma vez que a maioria dos participantes foram mortos, o consentimento escrito não foi obtida, e este foi aprovado pela comissão de ética.

Relatórios dos resultados foi preparado de acordo com o orientações OBSERVA [28], [29].

Mais detalhes estão descritos no S1 Arquivo.

resultados

expressão miRNA foi medida em 460 amostras de FFPE. O número de amostras em cada coorte foi:. Screening coorte = 212, reduzida coorte de triagem = 155, validação coorte = 121, e grupo de controlo = 127 (Figura S1 S1 Arquivo)

Os pacientes incluídos no reduzido screening- ea validação coortes miRNA diferiam dos pacientes não incluído. Eles eram mais propensos a ter: ressecada tumor primário, um único local metastático, performance status 0 e terapia adjuvante antes. Eles também experimentou uma TTP mais e OS (Tabela 1). Os pacientes do grupo de controlo foram semelhantes aos pacientes não incluídos, exceto para eles serem mais susceptíveis de ter tido o tumor primário ressecado.

Screening estudo

Nove amostras foram identificadas como valores extremos com base no baixo número de miARNs detectado e estes foram excluídos, deixando 203 amostras para os cálculos de resultados. Vinte e seis miRNAs foram associados com TTP ou OS na análise multivariada usando dados de expressão-primas, quantílicas normalizada, ou média normalizada (Tabela S1 S1 Arquivo). Vinte e dois deles foram selecionados para um estudo mais aprofundado: miR-1, miR-15a-5p, miR-17-3p, miR-22-3p, miR-29b-3p, miR-145-3p, miR-155-5p , miR-185-5p, miR-193b-5p, miR-196b-5p, miR-204-5p, miR-214-5p, miR-338-3p, miR-382-5p, miR-449a, miR-455 . -5p, miR-497-5p, miR-501-5p, miR-545-3p, miR-552-3p, miR-592 e miR-664-3p

painel de miRNA Focada – miRNAs associados com TTP

miRNAs Onze foram significativamente associados com TTP tanto no screening- ou coorte de validação, mas não em ambos os grupos e não foram encontradas interações significativas entre a expressão de miRNA e efeito bevacizumab (Tabela 2).

curvas de Kaplan-Meier para TTP acordo com quartis de miR-664-3p- e miR-455-5p expressão são mostrados na Figura S2 e S3 em S1 Arquivo

painel de miRNA Focada -. miRNAs associado com oS

Doze miRNAs foram significativamente associados com o oS em um ou mais do screening-, validation- e controlar coortes (Tabela 3). Maior expressão de miR-664-3p foi associada com mais OS na triagem e validação coortes com expressão crua: HR 0,64 (IC 0,48-0,86) e 0,60 (IC 0,44-0,82); e expressão normalizada: HR 0,66 (CI 0,49-0,91) e 0,55 (CI 0.39-0.79). Não houve associação entre a expressão de miR-664-3p e OS foi encontrada no grupo de controlo. A interação significativa entre expressão e bevacizumab efeito miR-664-3p foi observada usando a expressão tanto cruas e normalizada (

P

= 0,02 e

P

= 0,02). Gráficos de Kaplan-Meier para OS de acordo com quartis de expressão de miR-664-3p são mostrados na Figura 1.

Gráficos de Kaplan-Meier são mostrados para os pacientes tratados com CAPEOXBEV utilizando matérias-(A) ou média normalizada (B ) expressão e pacientes tratados com CAPEOX sozinho utilizando matéria (C) e expressão significa normalizada (D). taxas de risco (HR) são intervalos não ajustados e confiança (IC) são calculadas usando bootstrapping. Os intervalos de expressão mostrada no canto superior direito são 40-C

t, valores tão elevados correspondem a mais elevada expressão. linha preta = quartil mais baixo; linha vermelha = segundo quartil; linha verde = terceiro quartil; linha azul = quartil mais alto

miR-455-5p maior expressão foi associada com menor OS no grupo tratado com bevacizumab combinado pelo uso da expressão normalizada:. HR 1,24 (IC 1,06-1,45) , mas não no grupo de controlo. Houve uma interação significativa com efeito de bevacizumab (

P

= 0,02). Gráficos de Kaplan-Meier para OS de acordo com quartis de expressão de miR-455-5p são mostrados na Figura 2.

Gráficos de Kaplan-Meier são mostrados para os pacientes tratados com CAPEOXBEV utilizando matérias-(A) ou média normalizada (B ) expressão e pacientes tratados com CAPEOX sozinho utilizando matéria (C) e expressão significa normalizada (D). taxas de risco (HR) são intervalos não ajustados e confiança (IC) são calculadas usando bootstrapping. Os intervalos de expressão mostrada no canto superior direito são 40-C

t, valores tão elevados correspondem a mais elevada expressão. linha preta = quartil mais baixo; linha vermelha = segundo quartil; linha verde = terceiro quartil; linha azul = quartil mais alto

miR-592 maior expressão foi associada com mais OS nas screening- e validação coortes com expressão crua:. HR 0,69 (IC 0,69-0,92) e 0,76 (CI 0.60- 0,95); e na coorte de validação normalizadas usando a expressão: HR 0,76 (CI 0,63-0,93), com uma tendência similar na coorte de rastreio utilizando a expressão normalizada: HR 0,77 (CI 0,59-1,00). Superior miR-592 expressão também foi associada com mais OS no grupo controle quando se utiliza a expressão normalizada:. HR 0,71 (IC 0,53-0,96)

maior expressão de miR-196b-5p foi associada com mais OS usando-prima e expressão normalizada tanto no grupo tratado com o bevacizumab combinado: HR 0,77 (CI 0,66-0,90) e 0,79 (CI 0,64-0,97); e no grupo de controlo:. HR 0,78 (IC 0,62-0,98) e 0,73 (IC 0,58-0,93)

Painel de miRNA Focada – localização e tumor primário segunda linha resultado

Na análise estratificada por localização do tumor primário, uma interação significativa com efeitos bevacizumab foi vista para a expressão de miR-664-3p no grupo cólon sigmóide e reto tanto para TTP usando expressão crua e para oS usando a expressão-prima e normalizada. Os níveis de expressão de todos os miRNAs de acordo com a localização do tumor primário são apresentados na Figura S4 em S1 Arquivo.

Em pacientes bevacizumab na segunda linha contínua, a alta expressão de miR-664-3p foi associada com mais TTP (HR 0,30,

P

= 0,04) e alta expressão de miR-455-5p foi associada com uma tendência para menor TTP (HR 2,72,

P

= 0,09), enquanto nenhuma dessas associações foram observadas em pacientes que fizeram não continue bevacizumab (Figura S5 em S1 Arquivo).

Mirna

hibridização in situ

um sinal ISH miR-664-3p intenso, principalmente com uma localização citoplasmática, foi visto em subpopulações de linfócitos que se infiltram no tumor, fibroblastos e células endoteliais localizadas na fronteira invasiva (Figura 3). Um sinal de ISH miR-664-3p fraca foi vista em células epiteliais de tumor, mas uma coloração semelhante foi observado com a sonda de precipitação, o que sugere uma ligação não especifica da sonda para estas células. ISH sinal de miR-455-5p foi encontrado em algumas células do estroma de linfócitos do tipo em metade das amostras, enquanto que as células epiteliais tumorais foram negativos (Figura S6 em S1 do ficheiro). Não há sinal de ISH foi obtido com as sondas contra miR-185, miR-449a ou miR-592. sondas de controlo positivo para miR-21-5p e miR-126-3p mostrou moderada a intensa coloração em fibroblastos e células endoteliais, respectivamente, em todos os casos.

exemplos

Os painéis A e B mostram de miR-664-3p ISH à infiltração de linfócitos (a) e (B) fibroblastos. secções consecutivas foram coradas com sondas LNA contra miR-664-3p, miR-126-3p e uma sequência de encriptação. sinal de ISH miR-664-3p é visto em infiltrando linfócitos (um, setas; B, seta vermelha) e em fibroblastos (B, setas pretas), enquanto nenhum sinal ISH é obtido com a sonda corrida. Um sinal ISH forte é visto em células endoteliais com a sonda de controlo positivo miR-126-3p. O “A” no painel B indica uma artéria.

Alvo previsão

Tabela S2 no arquivo S1 mostra as 20 maiores genes alvos previstos classificados para miR-196b-5p, miR- 455-5p artigos, miR-592 e miR-664-3p e referências publicadas a respeito do nível de função e expressão desses miRNAs em câncer.

Discussão

Este é o primeiro estudo abrangente dos miRNAs como biomarcadores preditivos para a eficácia bevacizumab no CRC. Dos 22 miRNAs selecionados a partir do estudo de despistagem, miR-664-3p e miR-455-5p mostrou o maior potencial como biomarcadores preditivos para a eficácia bevacizumab.

A associação entre miR-664-3p e OS diferiram significativamente entre os pacientes tratados com bevacizumab e pacientes tratados apenas com quimioterapia: aumento da expressão de miR-664-3p no tecido CRC primário foi associada com mais oS em ambos os grupos de doentes tratados com bevacizumab combinado com CAPEOX mas não no grupo tratado apenas com quimioterapia. O aumento da expressão de miR-664-3p também foi associada com mais TTP em pacientes tratados com bevacizumab, mas o teste de interação foi significativa apenas no subgrupo de pacientes com Colon- sigmóide e tumores primários retais. Anteriormente, a hipótese de que este subgrupo de pacientes poderia ser mais propensos a beneficiar do tratamento com bevacizumab do que pacientes com tumores primários proximais mais [20]. expressão de miR-664-3p também foi maior nesses pacientes do que em pacientes com tumores primários proximais mais (Figura S4 no arquivo S1). No pequeno grupo de pacientes com dados disponíveis de segunda linha de resultado, a alta expressão de miR-664-3p também foi associado com um TTP mais apenas em pacientes bevacizumab contínua, apoiando uma conexão entre a expressão de miR-664-3p ea eficácia bevacizumab.

observada elevada expressão de miR-664-3p em células do estroma, incluindo células endoteliais, o que está de acordo com um papel para miR-664-3p na angiogénese. Muito poucos dados foram publicados sobre este miRNA (Tabela S2 no arquivo S1). Curiosamente, entre os principais alvos previstos de miR-664-3p são neuroligin 1 (NLGN1), MDGA2, e gephyrin, que estão todos envolvidos no mesmo processo synaptogenic no sistema nervoso [30], [31]. Recentemente, neuroligin e o seu parceiro de ligação neurexin foram mostrados para ser amplamente expressos no sistema vascular e envolvido na angiogénese [30]. A sobre-expressão de neuroligin 1 em células endoteliais cultivadas num ambiente tumorigénico aumento da angiogénese, e de knockdown reduzida neurexin angiogénese factor de crescimento de fibroblastos 2 induzida por [32]. Em um modelo de embriões de peixe zebra de angiogénese, inibição do VEGF-A ou neuroligin causada magnitudes semelhantes de defeitos vasculares, mas a inibição de ambos resultou num efeito mais do que aditivo anti-angiogénico [33]. Hipoteticamente, o impacto da expressão de miR-664-3p em resultado pode ser explicado pela sua regulação negativa do sistema neuroligin e a sinergia resultante com VEGF-A inibição por bevacizumab.

O aumento da expressão de miR-455-5p estava associado com menor SO na coorte tratada bevacizumab combinado enquanto nenhuma associação foi observada no grupo tratado com a quimioterapia sozinha. Identificou-se elevada expressão desta miARN em células de linfócitos semelhante localizados no estroma em torno das células cancerosas. MiR-455-5p foi relatado para ser desregulado no cancro; no entanto, há alvos validados foram identificados (Tabela S2 em S1 Arquivo).

expressão crescente de ambos miR-196b-5p e miR-592 foi associada com mais OS em todos os três grupos, com estimativas de efeito semelhantes. Ambos estes miARNs têm sido mostrados para ser regulada negativamente em CRCs com a reparação deficiente incompatibilidade (dMMR) [34]. Maior expressão de miR-592 foi mostrada para ser associada a uma melhor OS em doentes que receberam tratamento de salvamento anti-EGFR e mais elevada expressão de miR-196b-5p tem sido associada à resposta ao neo-adjuvante com 5-FU e radioterapia em pacientes com rectal localmente avançado câncer [35], [36]. expressão de miR-592 tem sido relatada a ser maior no lado esquerdo em comparação com CRCs do lado direito [37], que também encontramos em nosso estudo. Não conseguimos manchar nossos secções de tecido para miR-592, mas a expressão de ambos miR-592 e miR-196b-5p foi previamente demonstrado ser 2,5-3,7 vezes maior do que no epitélio CRC CRC estroma em [38]. A função de miR-592 não foi descrita. MiR-196b-5p está desregulada em muitos tumores malignos, tem sido relacionada ao prognóstico do câncer, e tem como alvo c-myc, ERG, MEIS1, FAS, ABL1, BCL-2 e vários genes HOX (Tabela S2 em S1 arquivo).

Existem limitações importantes a considerar sobre os nossos resultados. Estudamos retrospectivamente identificados coortes de diferentes períodos de tempo, o que aumenta o risco de viés, uma vez que outros do que os tratamentos utilizados pudesse existir entre os grupos diferenças. Nós usamos a expressão média para a normalização, mas desde que os miRNAs utilizados para o cálculo da média foram relacionados para o resultado, este é sub-óptima. Embora a associação com o resultado para alguns dos miARNs foi identificada em dois ou três grupos independentes, o efeito preditivo relacionadas com o bevacizumab permanece não validado. Nós não corrigir para testes múltiplos, mas miR-664-3p ainda estaria significativamente associada com OS na coorte de validação, mesmo após a correção para os 22 miRNAs testados. Além disso, estimativas de efeito foram semelhantes nos grupos, indicando uma associação não-aleatória. Entre os pontos fortes do nosso estudo são o grande tamanho da amostra, o estudo inicial de triagem abrangente, o uso de três coortes independentes e randomização de purification- e miRNA ordem análise de expressão.

Em conclusão, este é o primeiro estudo para examinar o potencial de expressão miRNA em tumores primários de prever benefício de bevacizumab em pacientes com mCRC. Nós identificamos miR-664-3p e miR-455-5p como possíveis biomarcadores preditivos de bevacizumab. MiR-592 e miR-196b-5p foram preditivo dos resultados, tanto com e sem bevacizumab e estas poderiam ser biomarcadores de prognóstico ou biomarcadores relativos a eficácia da quimioterapia. Estes achados precisam de validação em coortes independentes – de preferência a partir de ensaios clínicos randomizados e usando normalizadores miRNA estáveis ​​-antes eles podem ser implementados na tomada de decisão clínica. Elucidação das origens celulares e funções biológicas destes miRNAs é justificada.

Informações de Apoio

arquivo S1.

Este arquivo contém métodos complementares, quadro suplementar S1 e S2, e Figura complementar S1-S6

doi:. 10.1371 /journal.pone.0109430.s001

(PDF)

Agradecimentos

gostaríamos de agradecer: Jørgen Hansen, MD, do Departamento de Oncologia Aalborg Hospital, Dinamarca por ajuda em relação a aquisição de dados do paciente; Mel Heeran, PhD pela excelente assistência técnica com o seccionamento das amostras de tecidos FFPE; Jakob Z. Johansen, MD para a introdução de dados clínicos no banco de dados BETmiRC; Mogens Kruhøffer, PhD, da AROS Applied Biotechnology A /S, Dinamarca para obter ajuda com o miRNA analisa, eo CancerBiobank Dinamarquês (DCB) para material biológico e para os dados referentes ao manuseamento e armazenamento.

Deixe uma resposta