Abstract

Fundo

A ativação da via de sinalização Wnt está implicado em proliferação celular aberrante em vários cancros. Em 40% dos cancros do ovário endometrióides, activação constitutiva da via é devido a mutações oncogénicas em β-catenina ou outras mutações inactivadoras em reguladores negativos principais. Proteína secretada frizzled-relacionadas 4 (SFRP4) foi proposto para ter actividade inibidora através da ligação e isolar ligantes Wnt.

Metodologia /Principais Achados

Foi realizada RT-qPCR e Western-blot no ensino primário culturas e linhas de células de ovário de SFRP4 e seus reguladores a jusante chave activado β-catenina, β-catenina e GSK3β. SFRP4 foi então examinada por imuno-histoquímica numa coorte de 721 pacientes e devido à sua função secretora proposto, no plasma, apresentando o primeiro ELISA para SFRP4. SFRP4 foi mais altamente expresso no epitélio das trompas e diminuiu com a transformação maligna, tanto no ARN e no nível de proteína, onde foi ainda mais profunda na fracção de membrana (p 0,0001). SFRP4 foi expressa no nível da proteína em todas as histotipos de cancro do ovário, mas foi reduzida de tumores borderline para cancros e com perda de diferenciação celular. Perda de expressão de membrana foi um preditor independente de sobrevivência pobre em pacientes com câncer ovariano. (P = 0,02 não ajustada; p = 0,089 ajustado), o que aumentou o risco de um paciente a morrer desta doença pelo fator 1,8

conclusões /Significado

os resultados suportam um papel para

SFRP4

como um gene supressor de tumor no ovário

via

inibição da via de sinalização Wnt. Isto não tem apenas implicações de previsão, mas também poderia facilitar um papel terapêutico usando alvos epigenéticos

Citation:. Jacob F, Ukegjini K, Nixdorf S, Ford CE, Olivier J, Caduff R, et al. (2012) Perda de proteína secretada Frizzled-relacionadas 4 correlaciona-se com um fenótipo agressivo e prediz pior evolução no ovário pacientes com câncer. PLoS ONE 7 (2): e31885. doi: 10.1371 /journal.pone.0031885

editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Centro de Investigação, Arábia Saudita

Recebido: 15 Agosto, 2011; Aceito: 14 de janeiro de 2012; Publicação: 21 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Jacob et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Cancer League Canton Zurich (para VHS); Oncosuisse (02115-08-2007 para V.H.S.); Fundação Nacional da Suíça (320000-12.543 para V.H.S .; PBZHP3-133289 para F.J.); European Science Foundation (para V.H.S.); Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul (09 /CRF /2-02 para V.H.S.); Royal Australian e Nova Zelândia College de Obstetras e Ginecologistas (a V.H.S.); William Maxwell Trust (para V.H.S.) e do Hospital Real para mulheres da fundação (a V.H.S.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução câncer de ovário

epitelial (EOC) é a quinta causa mais comum de morte por todos os cânceres que ocorrem em mulheres ea principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas. Mais de 75% das mulheres apresentam com doença avançada localmente ou disseminada, tipicamente caracterizados por uma invasão gradual dos órgãos circundantes e, nos casos em fase alta, da cavidade peritoneal. Survival pouco mudou desde o início de 1980, apesar de novos medicamentos quimioterápicos. A taxa de sobrevivência de três quartos dos pacientes com doença metastática difundida é apenas cerca de 20% [1].

Este pobre globais prognóstico resulta de uma falta de sintomas precoces e diagnóstico precoce, terapia ineficaz para a doença avançada, resistência à quimioterapia à base de platina e de compreensão limitada dos primeiros eventos de iniciação e estágios iniciais de desenvolvimento de cancro do ovário. Um grande desafio continua a identificação de vias oncogénicas de cancro do ovário para ajudar no diagnóstico, como indicadores de prognóstico e como alvos para novas estratégias terapêuticas [2]. Muitos grupos, incluindo a nossa, têm utilizado plataformas de descoberta do genoma com base na matriz para identificar a expressão do mRNA aberrante e sequência de ADN somaticamente adquiriu variantes ou mutações para determinar as alterações moleculares subjacentes ao desenvolvimento de câncer de ovário, como um primeiro passo para identificar marcadores moleculares com potencial utilidade clínica [3], [4].

Usando esta tecnologia, os membros da via de sinalização Wnt foram implicados na carcinogénese do ovário, como tendo o potencial para objectivos de diagnóstico, prognóstico e terapêutico [5], [6]. A via de sinalização Wnt é altamente conservada durante toda animais e medeia uma variedade de funções celulares, incluindo polaridade celular, padronização tecidual, o controlo da proliferação e desenvolvimento de neoplasia [7] celular, [8]. proteínas Wnt são secretadas, as moléculas de sinalização ricos em cisteína com estruturas conservadas. proteínas Dezanove Wnt foram identificados e ligados a diferentes fases do desenvolvimento humano e carcinogénese, incluindo cancros da mama, pulmão, cólon, ovários e pele [9], [10], [11], [12], [13], [14]. As proteínas Wnt sinalizar

via

receptores Frizzled através de um número de diferentes, mas interligados vias de sinalização, incluindo a Wnt /Ca

2 +, β-catenina e de células planar vias de polaridade [15], [16] , [17]. Em geral, a família Wnt é classificada com base em ligando e receptor de envolvimento na via canonical /β-catenina e a β-catenina via independente /não-canónica. sinalização Wnt Curiosamente, não canônica pode antagonizar a sinalização de Wnt canônico, e pode representar uma nova via para atingir cânceres impulsionados por Wnt canônica sinalização [18]. genes alvo a jusante do /β-catenina via de sinalização Wnt /TCF foram identificados como sendo crucial para a transformação de células epiteliais do ovário, e foram sobre-regulada em todos os cancros do ovário endometrióides com defeitos da via Wnt [19], [20]. Vários outros estudos apoiaram esta observação, relatórios sobre-expressão de ciclina D1 em cancros do ovário portadores de mutações β-catenina [21], [22], [23], [24].

proteínas frizzled relacionadas com secretadas (SFRPs) são inibidores extracelulares de sinalização de Wnt que actuam directamente através da ligação a ligandos Wnt [25] ou a receptores Frizzled [26]. receptores Frizzled são encontradas exclusivamente na membrana plasmática, localizada na superfície de células de Wnt-responsivas. Em anos recentes, numerosos relatórios têm descrito silenciamento epigenético destes antagonistas de sinalização Wnt canónicas em vários cancros humanos, o que sugere que eles podem funcionar como supressores de tumor [27]. No cancro do ovário,

SFRP1

foi o primeiro membro da família a ser relatados hipermetilado e silenciado em linhas celulares de cancro do ovário e amostras de pacientes, mas não em controlos normais, sugerindo um papel potencial como um supressor de tumores [28]. hipermetilação do promotor de

SFRP2

e

SFRP5

foi, posteriormente, também encontrado em câncer de ovário [29]. Um estudo recente relatou perda de

SFRP5

expressão a ser associada com a progressão da carcinogênese ovariana e resistência à quimioterapia [29].

Como tínhamos previamente identificados

SFRP4

ser expressas de forma aberrante ao nível de ARN em uma grande experiência perfis de transcrição de pacientes de cancro do ovário (dados não publicados), aqui investigamos pela primeira vez SFRP4 ARN e a expressão de proteína em 725 pacientes usando transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), Western -blot, imuno-histoquímica (IHQ) e captura de enzima ligada ensaio imunoenzimático (ELISA) em culturas primárias, linhas celulares de ovário, ascite, tecidos e plasma.

Métodos

paciente clinico-patológica coorte

a aprovação ética e consentimento informado foi concedido em três locais diferentes na Suíça, Alemanha e Austrália: 1. Departamento de Ginecologia do Hospital Universitário de Zurique e do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Spital Limmattal, Zurique (Spuk, StV06 /2006, a VHS); 2. Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade de Schleswig-Holstein (Comitê de Ética da Universidade de Schleswig-Holstein, Campus Lubeck; a D. H.); e 3. Cancer Centre Ginecológica do Hospital Real para Mulheres, Sydney (HREC 08/09/17 /3,02, para V.H.S.). tecido de arquivo de 721 pacientes no estudo Suíço com câncer de trompas /normais, benignas e ovarianos /peritoneal ou endometriais foram incluídos no microarrays de tecido (281 diagnósticos benignos, 440 cancros), com a maioria dos cânceres sendo de origem ovariana (69,8%; Tabela 1). Hematoxilina Eosina (H E) coradas secções de cada amostra de ambos os suíços e coortes australianos foram revisadas por um patologista especializado em patologia ginecológica (R.C. para Swiss Cohort; J. S. para Cohort australiano) e as áreas correspondentes a tumor de tecido /benigna marcada. biópsias de tecidos de 1,0 ou 2,0 mm foram incorporados em microarrays de tecido de média densidade (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, EUA). Cada paciente foi representado por dois núcleos de amostra a partir de diferentes áreas do tumor. As secções de cada matriz era H E coradas para confirmar a inserção do tecido seleccionado em cada núcleo, e pacientes com histologias pouco claras ou mistos excluídos. Todos os dados do paciente clínico-patológicas, tais como estágio FIGO, grau, doença residual, presença de ascite, passado e presente doença médica, achados ultra-sonográficos e dados dos resultados foram armazenados em um banco de dados especialmente concebidos in-house (perov) com base no Microsoft Access (não publicado; Microsoft , Seattle, EUA). Pacientes com história prévia de câncer ou doenças inflamatórias /auto-imunes foram excluídos deste estudo.

A nossa coorte plasma foi prorrogado por 52 pacientes (coorte alemã) com a finalidade de facilitar um grupo de pacientes de endometriose maior. Amostras de sangue foram coletadas em tubos de sangue EDTA (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, EUA) antes da cirurgia e armazenados em gelo até posterior processamento. As amostras foram processadas dentro de 3 h por centrifugação de 3’000 g durante 10 min a 4 ° C e o plasma armazenado a -80 ° C.

cultura celular

A linha celular SKOV3 (cancro do ovário seroso ) foi cultivada em meio RPMI 1640 contendo penicilina /estreptomicina (Pen /Strep), 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e L-glutamina (L-Glut). TOV112D (câncer de ovário endometrioid) e TOV21G (cancro do ovário células claras) foram cultivadas em DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. células de ovário humanos normais epiteliais superfície (HOSE6-3) foram cultivadas em meio 199 /MCDB 105 (01:02) contendo Pen /Strep + FCS a 10% + L-Glut. Todas as linhas celulares de cancro foram derivados de ATCC (www.atcc.org), HOSE6-3 foi um presente do Instituto Garvan de Pesquisa Médica, Sydney, Austrália.

culturas primárias

As culturas primárias foram coletados durante a cirurgia ou repetidamente durante paracentesis necessário para doença progressiva resistente à quimioterapia (grupo australiano). culturas derivadas de cancro do ovário durante paracentese foram tomadas a partir do sedimento celular de centrifugação gerada depois da ascite a 4 ° C com 3’000 g. células tubárias para a cultura foram recolhidos usando um cytobrush no final da fímbria do tubo imediatamente após profilática salpingo-ooforectomia bilateral. As duas linhas de células tubárias utilizados nesta publicação foram obtidos a partir de dois pacientes submetidos a cirurgia de redução de risco para o

BRCA1

estado de mutação (Tubo 1) e forte histórico familiar de câncer de ovário /mama (Tubo 2), onde informado por escrito consentimento ética foi concedida (HREC 08/09/17 /3,02, para VHS). Após a recolha, as culturas foram imediatamente armazenadas em DMEM e transferidas para o laboratório para o cultivo. As culturas primárias ou foram cultivadas em DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (linhas celulares de cancro do ovário) ou Médio 199 /MCDB 105 (01:02) contendo Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (normal linhas celulares de trompas) até à confluência. A segunda passagem de cada cultura foi utilizado para as experiências.

RT-qPCR

RT-qPCR foi realizado de acordo com as orientações MIQE células foram cultivadas em placas de 6 poços (Nunc, Thermo Fisher Scientific , Roskilde, Dinamarca) até uma confluência de 60%, lavadas com 1 x DPBS (Gibco, Invitrogen Austrália Pty Ltd, Mulgrave) e extraiu-se ARN (kit total de NucleoSpin RNAII, Macherey Nagel, Düren, Alemanha). A concentração de RNA foi medida utilizando o espectros otómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca), a integridade confirmada por electroforese em gel de agarose (gel de agarose a 1,7%) e uma razão de densidade óptica de 260/230 nm≈2.1 (2,0 a 2.2) e 260 /280≈2.0 (1,8 a 2,2) seleccionados como os critérios de inclusão. QPCR foi realizada em três genes de referência, bem como o gene alvo,

SFRP4

utilizando 500 ng de ARN transcrito reverso num volume total de 20 ul (iScript Transcrição Reversa Supermix, Bio-Rad Laboratories Pty Ltd, Gladesville, Austrália ). Primers para genes de referência foram selecionados devido à sua expressão estável: proteína de ligação caixa de TATA [30] para a frente 5′-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3 ‘e reverso 5′-CACATCACAGCTCCCCACCA-3′; beta-glucuronidase [31] para a frente 5’-AGCCAGTTCCTCATCAATGG-3 ‘e inverso 5′-GGTAGTGGCTGGTACGGAAA-3′; succinato complexo desidrogenase, subunidade a [32] para a frente 5’-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3 ‘e inverso 5′-CCACCACTGCATCAAATTCATG-3’; e

SFRP4

frente 5′-ACACCCTCTTAAGCAGCACCAG-3 ‘e reverso 5′-AGGGTGGATGTCCTGGGAAGTAAG-3’ [33] (Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, Austrália). QPCR realizada no Stratagene Mx3005® (Ciências Integradas Pty Ltd, Chatswood, Austrália) usando placas de 96 poços de microtitulação (Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Austrália) eo kit SensiFAST ™ SYBR lo-ROX (Bioline ( Aust) Pty Ltd, Alexandria, Austrália) com baixa ROX como o corante de referência de fluorescência. condições de reacção óptimas foram obtidas pela mistura 2 × SensiFAST ™ SYBR, 400 nM de iniciador de sentido específica, 400 nM de iniciador anti-sentido específico, RNase água /livre de DNase e 25 ng de ADNc molde até um volume final de 20 ul. As amplificações foram realizadas começando com a activação da enzima de 30 seg a 95 ° C seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 5 seg e emparelhamento /extensão a 60 ° C durante 30 seg. Uma curva de fusão foi subsequentemente produzido em 65-95 ° C. Todas as amostras e os controlos negativos foram amplificados em triplicado e a média dos sinais de fluorescência corrigido normalizados a linha de base (dRn) obtido para cálculos posteriores. ciclo de quantificação (CQ) valores de nossos genes de referência foram combinados em uma média geométrica para cada amostra [32] e subtraído do

SFRP4

expressão: ΔCq = Cq

SFRP4

-Cq

Ref. Para quantificar relativamente

SFRP4

expressão (R) em todas as linhas de células estudadas, HOSE6-3 foi escolhido como nosso controle e expressões de outras linhas foram calculados como uma proporção em relação ao HOSE6-3 da seguinte forma: R = 2

-. [ΔCqSFRP4- ΔCqHOSE6-3]

análise de Western-blot

a ascite foram coletados durante paracentesis de dois pacientes de cancro do ovário em dois momentos consecutivos, três meses de intervalo. Tubulina foi utilizada como um controlo de carga para linhas de células e anti-beta-2-microglobulina para os extractos de proteína de ascites de doentes. Alíquotas de 30 mg foram combinados com a amostra NuPAGE® LDS e reduzindo buffers (Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) e fervida antes do carregamento para dodecil sulfato de sódio (SDS) géis de poliacrilamida. Todos os géis foram transferidos electricamente para membranas de PVDF, antes de serem bloqueadas durante 1 h, à RT em 0,01% TBS /Tween contendo 3% de leite em pó não gordo (TBS /Tween com leite não gordo). As membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C em TBS /Tween com leite não gordo e, em seguida, lavados três vezes durante 5 min em TBS /Tween. A visualização das proteínas foi realizada

através da adição de um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP), que foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente em TBS /Tween com leite não gordo. As membranas foram lavadas três vezes durante 10 min em TBS-Tween, incubadas em ECL e desenvolvidos com Hyperfilm. Digitalização e quantificação de intensidades de sinal foi realizado utilizando um densitómetro da Bio-Rad GS-800 com software Quantity One (Hercules, CA, EUA). Os anticorpos foram utilizados nas seguintes diluições: SFRP4 (Abnova, # 6424-A01): 1:1’000, activado β-catenina (Millipore, # 05-665) 1:1’000, β-catenina (Santa Cruz Biotechnology, # SC-7963), GSK3β (Sigma, # G7914) 1:1’000, anti-beta-2-microglobulina (Sigma, # WH0000567M1, 1:1’000). Todos os anticorpos secundários eram da Dako (Dako Australia Pty Ltd, Botany, Austrália) e foram utilizados nas seguintes diluições: de cabra anti-coelho, 1:5’000 e de cabra anti-ratinho, 1:5’000

imunohistoquímica

Para a detecção da expressão SFRP4 em vários tecidos, lâminas de tissue microarray foram analisados ​​utilizando o sistema de coloração automática Ventana Referencial (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, EUA). Para a recuperação de antigénio, as lâminas foram aquecidas com solução de células condicionado durante 1 h (CC1; tampão à base de Tris com pH ligeiramente alcalino), utilizando um protocolo padrão. As lâminas foram incubadas durante 1 h com anticorpo anti-humano SFRP4 rato policlonal primário (01:30; Abnova, Taipeh, Taiwan). A detecção foi levada a cabo utilizando o sistema UView HRP (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, EUA). Os controlos negativos omitido o anticorpo primário, e um tecido de controlo positivo e negativo para cada um dos anticorpos foi identificado a partir de dados de Northern blot electrónico ou na literatura publicada. A contracoloração foi realizada com hematoxilina e ácido 1% de álcool. A imunocoloração foi pontuado como porcentagem e intensidade de expressão SFRP4 em vários compartimentos celulares (membrana, citoplasma, núcleo). Scoring foi avaliada independentemente por dois pesquisadores e discrepâncias resolvidas por consenso. expressão SFRP4 de todos os núcleos de um paciente foi em média.

ELISA

As concentrações séricas de SFRP4 foram determinadas por um sanduíche in-house desenvolvido ELISA. (Imunoplacas de 96 poços NUNC MaxiSorp; Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com um anticorpo policlonal de ratinho criado contra a captura de uma proteína humana recombinante SFRP4 parcial (# H00006424-A01, Abnova, Taipei, Taiwan) e diluiu-se 1:250 em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2. Revestimento e a incubação foram realizadas durante a noite a 4 ° C. A proteína recombinante, primários e anticorpos secundários foram diluídos em PBS e as placas lavadas três vezes com 0,05% (v /v) de Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suíça). As placas foram bloqueadas com PBS contendo 5% (w /v) de leite em pó disponível comercial padrão durante 40 minutos a 37 ° C e lavadas três vezes. Após o bloqueio dos locais de ligação não específicos de uma curva padrão foi desenvolvido utilizando proteína recombinante SFRP4 (# H00006424-Q01, Abnova, Taipei, Taiwan) variando de 3’200 ng /ml para 12,5 ng /ml. amostras de plasma não diluído foram incubados em duplicado, durante 1 h a RT. SFRP4 ligado foi detectado utilizando o anticorpo primário de coelho policlonal para SFRP4 humana à RT durante 60 min (o Dr. R. Friis, Universidade de Berna, Suíça). As placas foram lavadas três vezes seguido de incubação com o anticorpo anti-ratinho policlonal secundário conjugado com peroxidase de rábano de coelho (1:1’000, Abcam, Cambridge, UK) durante 60 min à TA. Depois de cinco etapas de lavagem, o cromogénio TMB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suíça) foi aplicado como substrato e a reacção parou com peroxidase aos 30 min por um volume igual de ácido sulfúrico 2 M. A densidade óptica foi medida utilizando um leitor de ELISA a 450 nm (Tecan Spectrafluor Plus Tecan, Mannedorf, Suíça).

A análise estatística

Embora a expressão da proteína SFRP4 nos tecidos foi inicialmente quantificado como citoplasmática, e membrana coloração nuclear, os números eram muitas vezes demasiado baixa para mais análises estatísticas dos subgrupos histológicos individuais. Portanto, a expressão SFRP4 foi combinada, independente do local de coloração, e foi chamado total “SFRP4 expressão” (unidades arbitrárias). expressão SFRP4 em ambos os tecidos e plasma foi inicialmente descrita usando boxplots para vários grupos de diagnóstico. Um gráfico quantil normal para expressão SFRP4 no plasma foi indicativo de assimetria positiva de fazer quaisquer análises posteriores que requerem uma suposição de distribuição normal questionável. No entanto, a variação estabilização transformação logarítmica melhorou a questão. As diferenças de expressão entre os grupos SFRP4 diagnóstico foi avaliada utilizando uma série de modelos lineares gerais, juntamente com um ajustamento de Bonferroni para comparações de pares. Possíveis associações entre a expressão SFRP4 e parâmetros clínicos foram avaliados por meio do coeficiente de correlação de Pearson. sobrevida específica da doença e sobrevida livre de doença para a expressão de SFRP4 foram descritos por meio de curvas de Kaplan-Meier ea significância estatística foi determinada por meio de regressão Cox calculando as taxas de risco brutas e ajustadas. modelos de Cox ajustada incluída categorias etárias (≤60, 60), o grau do tumor (1-2, 3), fase FIGO cancro (I-II, III-IV) e de doença residual ( 10 mm, ≥10 mm) . Os valores de p inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise dos dados foram gerados usando o software SAS (v9.2, Cary, NC, EUA).

Resultados

Perda de expressão SFRP4 se correlaciona com fenótipo agressivo

SFRP4

foi altamente expressa em culturas primárias de trompas quando comparado com a linha de células normais de ovário epitelial superfície HOSE6-3 e era particularmente elevada no paciente com a mutação BRCA (tubo 1) em comparação com o paciente com história familiar positiva de cancro da mama /cancro do ovário (Tubo 2; Figura 1 A). Enquanto que uma célula clara e linha celular de cancro do ovário endometrióide (TOV21D, TOV 112D, respectivamente) expresso

SFRP4

em níveis semelhantes aos controlos de uma das trompas, a linha celular de cancro do ovário seroso indiferenciado (SKOV3) apresentaram níveis muito baixos de

SFRP4

(Figura 1 A). expressão SFRP4 foi então medida ao nível da proteína em várias linhas celulares de cancro saudáveis ​​e ovarianos por Ocidental-blot. expressão SFRP4 foi comparada com a sua chave a jusante reguladores ativado e β-catenina total. HOSE6-3 foi comparada para várias linhas de células do cancro do ovário de diferentes histotipos e diferenciação celular. SFRP4 expressão foi perdido em todas as linhas celulares de cancro em comparação com HOSE6-3 (Figura 1 B). Curiosamente, TOV112D, a linha celular de cancro do ovário endometrióide, expressa elevados níveis de ambos β-catenina activados e totais, consistente conhecido o rompimento de sinalização de Wnt na cancros endometrióides (Figura 1 B) [19]. fluido de ascites recolhidos durante a resistência à quimioterapia progressiva foi então analisado para a sua expressão de SFRP4 e alvos a jusante como uma medida da progressão ao longo do tempo. Usando ascite em dois momentos consecutivos de dois doentes com cancro e com agressividade supostamente diferente (Pt 1 mista G1 cancro do ovário, Pt 2 serosa G3 câncer peritoneal), esses experimentos mostraram uma redução da expressão da proteína SFRP4 durante a doença resistente à quimioterapia progressiva (Figura 1 C, D ). Em paralelo com a diminuição SFRP4, os níveis do regulador de sinalização Wnt jusante GSK3β também foram reduzidas, ao passo que activado β-catenina aumentado, sugerindo que a sinalização de Wnt foi efectivamente activado nestes pacientes.

Perda de

SFRP4

expressão de linhas epiteliais tubária primárias de células no sentido de linhas celulares de cancro do ovário é mostrado em várias configurações experimentais. fluorescência (A) Temos aplicado com base RT-qPCR para investigar

SFRP4

expressão gênica em pacientes saudáveis ​​() tubária primárias e linhas celulares imortalizadas. HOSE6-3 foi selecionado como controle e expressões de outras linhas celulares foram calculados como uma proporção em relação ao HOSE6-3: R = 2

– [ΔCq

SFRP4 viajantes – ΔCqHOSE6-3]. (B) e a sua SFRP4 alvos a jusante activados β-catenina (ABC), β-catenina e GSK3 β foram medidos por Western-blot em várias linhas celulares (HOSE6-3, TOV21G (células claras, cancro do ovário Tipo I), TOV112D ( endometrióide) e SKOV3 () Tipo serosa II cancros do ovário), bem como em (C) As amostras de ascites de pacientes de alto grau serosa do cancro do ovário com quimiorresistência, recolhidos em dois momentos consecutivos durante a progressão da doença (TP, ponto de tempo como Westernblot ; B2M, beta-2-microglobulina foi utilizado como controlo de carga). (D) resultados para SFRP4, ativado β-catenina (ABC), β-catenina, β GSK3 são apresentados quantitativamente usando análise densitométrica de um experimento em amostras de ascite de pacientes.

Correlação de expressão tecido SFRP4 com vários parâmetros clínico

localização SFRP4 foi então medido ao nível da proteína, devido à sua função proposta na membrana, citoplasma e, ocasionalmente, também no núcleo das células (Figura 2), utilizando IHC num grande coorte de 721 pacientes em microarrays de tecido ligado a extensos dados de acompanhamento (Tabela 1). a coloração das membranas pode ser identificado na fronteira célula-célula e na membrana apical, o que é consistente com a sua função secretora sugerida. Nossa coorte incorporados 281 pacientes do grupo controle que eram saudáveis ​​ou com doenças benignas como a endometriose ou Cystadenomas /-fibromas. O grupo com câncer também constou de 440 pacientes com tumores borderline ou cancros invasivos de ovário em sua maioria (69,8%), mas também endometrial (11,3%) e outras origens (18,9%). A média de idade no momento do diagnóstico foi de 57,1 anos (19-88 anos) para toda a coorte, com a média para o grupo controle sendo cinco anos mais jovem do que a coorte de câncer (53,7

vs.

58,9 anos). Nosso banco de dados abrangente incorporou dados de acompanhamento de um período máximo de 29 anos (média de ambas as coortes de 48,4 meses (1-348 meses)).

IHC demonstrando a expressão da proteína SFRP4 representativa a duas ampliações (× 10 coluna da esquerda , × 40 coluna da direita) em tecidos normais (epitélio do ovário superfície (a) e epitélio tubário (B)) e vários tipos de cancros do ovário (endometrióide (C), serosa (D) e de células claras (e)).

SFRP4 foi expresso positivamente no tecido em 296 de 721 tecidos de pacientes (41,1%) e em 128 de 142 amostras de plasma (90,1%). Dentro da coorte câncer, 279 pacientes (86,4%) tinham tumores de alto grau (grau 3) e 221 pacientes (55,3%) apresentavam avançado (FIGO III /IV) estágio da doença. A taxa de mortalidade cinco anos em todo o grupo de cancro /Tipo I /Tipo II foi de 29,5 /20,6 /41,3%, respectivamente. A taxa de recaída cinco anos nos mesmos subgrupos de coorte foi de 20,5 /15,3 /27,5%, respectivamente, reflectindo assim uma coorte câncer representativa.

possíveis associações entre a expressão SFRP4 determinada tanto no tecido e plasma, com os parâmetros clínico derivado a nossa in-house de banco de dados clínico-patológico (banco de dados perov; Access (Microsoft, Seattle EUA)) foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson, r. os parâmetros clínico que eram acessíveis dentro de nossa coorte incluiu o aborto, a idade no momento do diagnóstico, IMC, níveis de CA125, níveis CA72-4, níveis HE4, grau e fase do câncer, doença residual, ascite no momento do diagnóstico, tamanho e bilateralidade de tumores do ovário, o desempenho Status no momento do diagnóstico, tempo de follow-up, e livre de recidiva sobrevivência específica da doença, a quimioterapia platina, anticoncepcionais ou reposição hormonal terapias orais, gestações /partos, idade da menarca e menopausa, presença de acne, ovários policísticos, excesso de pêlos, infertilidade , infecções, diabetes, hipertensão, ingestão de álcool /drogas, tabagismo, consumo de drogas não esteróides, passado histórico de internações, doenças da mama, endometriose, miomas, cistos ovarianos, e histórico de cancro ou cancros familiares.

a correlação apenas moderadamente forte encontrado para a expressão SFRP4 tanto no tecido e no plasma foi detectada no caso da ascite estar presente na primeira diagnóstico (SFRP4 IHC: r = 0,55, p = 0,01; SFRP4 ELISA: r = -0,60, p = 0,03 ). Outra correlação moderadamente forte estava presente para a amamentação quando correlacionados com SFRP4 expressão plasma (r = -0,79, p = 0,06). No entanto, este é de significância limítrofe como o tamanho da amostra para a amamentação era bastante pequeno. correlações fracas foram encontrados para o IMC (SFRP4 IHC: r = 0,19, p = 0,003) eo novo HE4 marcador tumoral (SFRP4 ELISA: r = -0,25, p = 0,02) [34]. Uma relação marginalmente significativa pôde ser detectado por antecedentes de operações ginecológicas (IHC: p = 0,038, ELISA: p = 0,099), terapia de reposição hormonal (ELISA: p = 0,097) e ingestão de álcool. (IHC: p = 0,098)

SFRP4 é cada vez mais perdida durante a transformação maligna

como teria sido previsto a partir de sua suposta função, expressão SFRP4 apresentado em particular no que membrana e coloração citoplasmática. De todos os tecidos examinados, apenas a extremidade da fímbria da trompa de Falópio expressa SFRP4 coloração nuclear, que foi uma descoberta inesperada (Figura 2 B). epitélio de superfície do ovário, que foi até recentemente proposto para ser o lugar uniforme de origem de cânceres mais ovarianos, exibida somente mínima coloração citoplasmática e sem membrana, como foi o caso para os cistos de inclusão, a localização das alterações metaplásicas dentro do ovário. A expressão mais elevada SFRP4 dentro de todos os tecidos estudados foi encontrada no epitélio das trompas, o que é consistente com as nossas conclusões ao nível de ARN em culturas primárias de trompas (Figura 1 A). As novas propostas cânceres do tipo II estão cada vez mais pensado para ter a sua origem no final da fímbria da trompa de Falópio, que deve então ser antes o controlo normal para a maioria dos tipos de câncer (38). De fato, encontramos uma diminuição na expressão SFRP4 acumulado de epitélio tubário, tecidos benignos (incluindo epitélio de superfície do ovário e cistos de inclusão), endometriose para limítrofes tumores e cancros (Figura 3.1 A, B), novamente em coerência com a tendência que encontramos por RT -qPCR em linhas de células (Figura 1 a). Perda de expressão SFRP4 de benigno para o câncer foi estatisticamente significativa, tanto quando medida como expressão membrana sozinho (p 0,0001 geral, a Figura 3.2; benigna

vs

cancro, p = 0,07;. Borderline

vs

Câncer, p 0,0001) e quando membrana, citoplasma e expressão nuclear foram medidos em combinação (p = 0,0004 geral, Figura 3.1 a; benigna

vs

cancro, p = 0,039;. borderline

vs.

cancro, p = 0,002). Enquanto uma subdivisão da coloração da membrana era difícil de medir devido a amostras de pequenas dimensões em tecidos que expressam membrana, a expressão mais elevada no grupo benigno para a expressão total de SFRP4 estava no epitélio tubário, seguido de endometriose e menor no epitélio de superfície do ovário e inclusão cistos (Figura 3.1 B; tubo vs. OSE, p 0,0001; tubo vs. endometriose, p = 0,014).

Boxplots representando expressão SFRP4 cumulativa (unidades arbitrárias) em citoplasma, membrana e do núcleo (SFRP4 expressão em