Abstract
é cada vez mais reconhecido que o microambiente do tumor desempenha um papel crítico na iniciação e progressão do câncer de pulmão. Em particular, a interacção das células cancerígenas, macrófagos, e resposta inflamatória no microambiente tumoral foi mostrado para facilitar a invasão de células cancerosas e metástases. As vias moleculares específicos em macrófagos que immunoedit crescimento do tumor não são bem definidas. Desencadeando receptor expresso em células mielóides 1 (TREM-1) é um membro da família das imunoglobulinas super-expressos em um grupo seleccionado de células mielóides principalmente monócitos /macrófagos. Estudos recentes sugerem que a expressão de TREM-1 em tumores pode prever a agressividade do cancro e de doenças resultados no fígado e no cancro do pulmão no entanto, o mecanismo de TREM-1 expressão no contexto de cancro não é definida. Neste estudo foi demonstrado que o tecido do tumor a partir de pacientes com cancro do pulmão de não pequenas células mostram um aumento da expressão de TREM-1 e PGE
2. A imuno-histoquímica e imunofluorescência confirmou que a expressão de TREM-1 foi visto selectivamente em macrófagos CD68 positivas. Ao empregar um
In vitro
modelo que confirmou que a expressão de TREM-1 é aumentada em macrófagos que são co-cultivadas com células de cancro do pulmão humano. Estudos com inibidores COX-2 e siCOX-2 mostrou que a expressão de TREM-1 nos macrófagos no microambiente do tumor é dependente de COX-2 de sinalização. Estes estudos, pela primeira vez definir uma relação entre tumor de COX-2 de indução, PGE
2 de produção e expressão de TREM-1 nos macrófagos no microambiente tumoral e sugere que TREM-1 pode ser um novo alvo para imunomodulação tumor.
Citation: Yuan Z, Mehta HJ, Mohammed K, Nasreen N, Roman R, Brantly M, et al. (2014) TREM-1 é induzida em tumor associado macrófagos por ciclo-oxigenase Pathway in Human Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (5): e94241. doi: 10.1371 /journal.pone.0094241
editor: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Itália |
Recebido: 04 de setembro de 2013; Aceito: 14 de março de 2014; Publicado em: 19 de maio de 2014
Direitos de autor: © 2014 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Department of Veterans Affairs (MR para RTS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pulmão é um dos cancros mais mortais em todo o mundo. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por mais de 80% de todos os cânceres de pulmão. Em média, a taxa de sobrevivência de 5 anos para NSCLC é de aproximadamente 15% [1]. Apesar de avanços significativos foram feitos com terapias convencionais, a baixa sobrevida global e mau prognóstico para pacientes com câncer de pulmão indica a necessidade de desenvolver novas opções de tratamento para esta doença devastadora [2]. Como resultado, não foi continuado busca para definir os possíveis caminhos que levam a tumorigênese no cancro do pulmão com uma esperança de desenvolver alternativas e /ou terapias farmacológicas para câncer de pulmão.
É cada vez mais reconhecido que o microambiente do tumor desempenha um papel crítico na iniciação e progressão do cancro do pulmão. o desenvolvimento do tumor depende de fatores no microambiente; interacções entre as células malignas, células de estroma, componentes da matriz extracelular, várias células inflamatórias, e uma variedade de mediadores solúveis contribuem para o desenvolvimento e progressão do tumor [3] [4] [5] [6]. Os macrófagos nos tumores são geralmente referidos como macrófagos associados a tumores (TAM) e a sua presença pode ser substancial (até 60% do estroma tumoral). Uma característica de macrófagos é a sua plasticidade, a capacidade de qualquer auxílio ou combater tumores, dependendo do ambiente do tumor, o que lhes deu a reputação de uma faca de dois gumes na biologia tumoral [7] [8] [9] [10] [ ,,,0],11] [12]. Existem evidências de que as células cancerosas podem recrutar e subverter os macrófagos para servir como colaboradores ativos em seu programa neoplásica. activação persistente de macrófagos causa inflamação crónica local, produção de citocinas e quimiocinas que promove a tumorigénese [3] [4] [6] [9] [13] [14]. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais os tumores activam macrófagos para promover o crescimento do tumor não são bem definidas.
proteínas TREM (desencadeando receptores expressos em células mielóides) são uma família de receptores de superfície celular de imunoglobulina expressos em células mielóides [15]. A família TREM de receptores de proteína consiste de TREM-1, TREM-2, TREM-3 (mouse), TREM-like transcrição (TLT) -1, e TLT-2. O aglomerado de genes TREM está localizado no cromossoma humano 6p21 e rato cromossoma 17C3 [16] [17]. TREM-1 foi o primeiro TREM identificados e estudos iniciais estabelecida TREM-1 como um amplificador da síndrome de resposta inflamatória sistémica e sepsia [18] [19] [17] [20]. O ligando preciso para TREM-1 é desconhecido no entanto, e outros mostraram que produtos bacterianos e virais [21] [19] induzir a expressão de TREM-1. Além disso, mostrámos que MyD88 vias dependentes e independentes activar TREM-1 em resposta a ligandos de TLR específicas [21]. As consequências funcionais de silenciamento TREM-1 gene em macrófagos incluem uma disponibilidade alterado de sinalização chave (CD14, IκBα, MyD88), e moléculas efectoras (MCP-1, IL-1, IL-6, IL-23) a jusante da activação de TLR [22]. Estudos recentes também mostraram que os mediadores lipídicos, tais como as prostaglandinas modulam a expressão de TREM-1. Em particular, a PGE
2 induz Considerando PGD
2 e PGJ
2 inibem a expressão de TREM-1 [23] [24]. Juntos, esses estudos têm sugerido um papel fundamental para o TREM-1 na amplificação de respostas induzidas TLR. No entanto, o papel de TREM-1 na inflamação do tumor associado e microambiente não foi estabelecida.
Estudos recentes têm mostrado que TREM-1 é altamente expresso no cólon, hepatocelular e tecido de carcinoma de pulmão [25] [26] [27] [5]. Além disso, TREM-1 expressão em doentes com NSCLC tem sido associada com recorrência do cancro e fraca sobrevivência dos pacientes, sugerindo que TREM-1 pode desempenhar um papel importante na progressão do cancro [27]. No entanto, o mecanismo pelo qual TREM-1 é induzida em tecido tumoral não foi definida.
Este trabalho foi realizado para determinar a expressão específica de célula de TREM-1 no cancro do pulmão de células não-pequenas de tecido humano (NSCLC) e para definir o mecanismo pelo qual as células de tumor induzir a expressão de TREM-1. Colocámos a hipótese de que a activação TREM-1 em macrófagos associados a tumores pode ser induzida por PGE
2 gerado por ciclo-oxigenase-2 a partir de células tumorais. Nós investigamos a hipótese de utilizar um sistema de co-cultura de células cancerosas humanas com monócitos /macrófagos humanos,
in vitro
.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
pulmão normal Humana e NSCLC foram obtidos tanto na forma congelada e, como blocos de células de instituto de pesquisa clínica e translacional (CTSI) na Universidade da Flórida, que fornece um banco de tecidos para fins de pesquisa. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes cujos tecidos foram bancados. consentimentos escritos foram arquivados por todos os participantes do estudo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e do Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Flórida. Número de homologação (# IRB201200392).
Reagentes
soro fetal bovino (FBS) (10%) foi obtida a partir Coleção AmericanType Cultura (ATCC, Manassas, VA). meio RPMI-1640 foi obtido a partir de Gibco (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), NS398 foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). EP1, EP2, EP4, antagonistas dos receptores (GW848687, AH6809, AH 23848) e PGE2 recombinante e PGD2 foram adquiridos de produtos químicos Cayman. EP1 antagonista (G-798-106) foi adquirido a Tocris Bioscience. agaonist AMPc (forscolina) foi adquirido a Sigma-Aldrich. COX-2 e anticorpos actina, voltados para os não-siRNA piscina (NS siARN) e siRNA segmentação de COX-2 foram obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA).
Cultura celular e experiências de co-cultura
a linha de células monocíticas U937 humano, o cancro do pulmão de células A549 de linha, H23 ou H838 foram adquiridas a partir da ATCC, e mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS. A549, células H23 ou H838 foram semeadas em placas de seis poços (1,5 a-2 × 10
6 células por poço) em meio de cultura. As células U937 foram tratadas com PMA (10 ng /ml) durante 48 h para diferenciá-las em macrófagos. As células U937 (2 a -2,5 x 10
6 células por pastilha), macrófagos humanos (10
6 células por pastilha) foram plaqueadas directamente sobre as inserções Transwell (0,4 um, BD Biosciences) em meio de cultura. Antes da co-cultura, as células de cancro do pulmão e os macrófagos foram lavados com RPMI contendo 0,1% de albumina de soro bovino (meio basal). Após a última lavagem, o meio basal apropriado foi adicionado às células e pastilhas contendo macrófagos de cancro do pulmão foram colocados em cada poço.
Preparação de macrófagos humanos periféricos de monócitos do sangue
monócitos do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas a partir de crostas inflamatórias de dadores normais ao longo de um Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) gradiente. PBMC foram diferenciadas para macrófagos por cultivo em meio RPMI-1640 suplementado com 10% FBS (Gibco) a uma densidade de 10
6 /ml durante sete dias. Para a maturação de macrófagos humanos, 50 ng /M-CSF humano mL (R D systems) foi completada em meio completo. Pureza de macrófagos eram controladas por citometria de fluxo ( 90% CD14
+)
Análise Imunohistoquímica
espécimes câncer de pulmão e tecido normal da área carcinoma Pará foram obtidos de três pacientes com. cancro do pulmão de células não-pequenas. As secções de parafina (4 mm) foram coradas com hematoxilina e eosina para avaliação histológica. coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando um método complexo de peroxidase avidina-biotina modificada. 4 uM secções de tecidos, embebidos em parafina e fixados em formalina foram montadas em lâminas de poli-L-lisina-revestidas e depois desparafinizadas. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio a 3% durante 15 min à temperatura ambiente. Após a recuperação de antigénios em HIER (pH 6,0) durante 4 minutos, as secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anti-TREM-1 de anticorpo (HPA005563, Sigma-Aldrich) ou anticorpo de controlo do mesmo isotipo no diluição de 1:500, então detectado usando EnVision ™ System-HRP (DAB) (Dako). A especificidade da imuno-histoquímica foi verificado através de um controlo de isotipo de anticorpo substituindo o anti-soro primário com uma concentração idêntica de ratinho não imunizado ou soro de coelho. As secções foram rastreados em × 100 ampliação para identificar as regiões de maiores números de células TREM-1-positivos. Imunocoramento TREM-1 foi analisada cegamente por dois patologistas placa certificada. As células foram contadas a uma densidade de 400 × ampliação em pelo menos três regiões com os maiores números de células TREM-1-positivo.
Imunofluorescência Indireta
As secções de fixado em formol e parafina-embedded tecidos de cancro do pulmão e tecido normal de tumor adjacente foram desparafinadas, em seguida, bloqueadas com soro de cavalo a 2% em tampão PBST durante 1 h à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as lâminas foram incubadas com anti-TREM-1 de anticorpo (HPA005563, Sigma) a uma diluição de 1:500 durante a noite a 4 ° C, após três lavagens em PBS frio, colocados a hibridar com anticorpo secundário (Alexa Fluor 594 de burro anti-coelho IgG, 1:500; Molecular Probes) durante 1 hora à temperatura ambiente. Para a coloração dupla, as lâminas foram lavadas novamente, com solução de bloqueio e incubadas com anticorpo anti-humano CD68 (clone KP1, 1:100; Abcam) e um outro anticorpo secundário conjugado com fluoro-(Alexa Fluor 488 de IgG de burro anti-ratinho, 1: 500; Molecular Probes). DAPI contendo meio de montagem (Molecular Probes) foi usada para coloração nuclear. Imagens em um nível única célula foram observadas e fotografadas utilizando um microscópio de fluorescência equipado com uma carga câmera Casal dispositivo (Leica SP5, Alemanha).
RNA Interferência
As células foram transfectadas com oligonucleótidos siRNA segmentação humana ARNm de COX-2, e um controlo não relacionada siRNA (Santa Cruz) através de reagentes específicos de transfecção Lonza (LONZA) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas com os complexos de siRNA durante 24 h-72 h, antes da análise.
Citometria de Fluxo
macrófagos humanos e macrófagos diferenciados-U937 foram examinadas para os níveis de expressão do receptor utilizando FACS com anticorpo anti-CD14 humano de APC /Cy7 (eBioscience) e anti-humana TREM-1 (R D systems). Os anticorpos monoclonais do mesmo isotipo (eBioscience) foram utilizados como controlos negativos. Os dados estão representados como percentagem em relação ao controlo.
Western Blotting
imunotransferência, para a detecção de COX-2 e actina como levado a cabo como descrito anteriormente [28].
transcrição reversa Reacção em Cadeia da polimerase (RT-PCR)
o ARN total a partir de lisados celulares foi isolado utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen). ARN (1 ug) foi transcrito de forma inversa utilizando o vírus da leucemia murina de transcriptase inversa e oligo d (T) 16 iniciador. Os iniciadores de PCR para a COX-2 humana eram para a frente, 5′-CCCTTGGGTGTCAAAGGTAA-3 ‘e inverso, 5′-GCCCTCGCTTATGATCTGTC-3’. Primers para TREM-1 humana foram para a frente, 5′- GGCCACACCAACCTT CTG – 3 ‘e reverter, 5′-AGTGCCTGCCTC AATGTCTCCA-3’. Os iniciadores para actina foram para a frente, 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3 ‘e inverso, 5′-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’. Para tempo real de reacção de PCR, humanos TREM-1 e iniciadores de actina, assim como Taqman Universal Master Mix II foram obtidos de Applied Biosystems, e todos análises PCR foram realizadas num ABI Prism 7900HT. Os níveis de ARN mensageiro (ARNm) foram normalizados para a actina. A expressão relativa foi determinada por CT análise (quantificação relativa).
ELISA
macrófagos diferenciados foram estimuladas com concentrações adequadas de estímulo para 12 horas. Os sobrenadantes de meio de cultura foram testados para a presença de PGE
2, utilizando um teste ELISA disponível comercialmente (R D Systems).
Análise estatística
t de Student foram efectuados para determinar estatisticamente diferenças significativas entre os grupos usando GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, EUA). Os níveis médios de TREM-1, COX-2 mRNA, PGE
2 concentração foram comparados utilizando análise de variância. P-value 0,05 foi considerado significativo
Resultados
TREM-1 é regulada no tumor associado macrófagos in Human não-pequenas células do cancro do pulmão
É estabelecido que TREM. -1 é regulada positivamente em tecidos inflamatórios e infecção. Desde inflamação crônica está intimamente ligada ao câncer Questionada se TREM-1 é expresso em tecido NSCLC. O primeiro realizada por RT-PCR e RT-qPCR a partir de tecido pulmonar de doentes com NSCLC. Fomos capazes de detectar um aumento na mensagem de TREM-1 a partir de tecido de adenocarcinoma do pulmão humano, enquanto a expressão não foi detectada em tecido de pulmão normal (Figura 1A e B). Uma vez que a expressão de TREM-1 é restrita às células mielóides que interrogadas que tipos de células expressam TREM-1 em tecido de cancro do pulmão. A fim de determinar os tipos específicos de células que expressam TREM-1 em microambiente do tumor foi realizada a análise imuno-histoquímica (utilizando o método modificado de avidina-biotina peroxidase complexo, anti TREM-1 de anticorpo de anticorpo primário e anticorpo de controlo de isotipo) a partir de amostras de cancro do pulmão humano a partir de doentes com adenocarcinoma do pulmão. A imuno-histoquímica e coloração immunoflorescent dos tumores pulmonares demonstraram que as células TREM-1-positivos são macrófagos associados a tumores (Figura 1C). TREM-1 células positivas são macrófagos foi confirmada por coloração usando CD68 um marcador específico de macrófagos, que confirmaram que as células são, de facto macrófagos (Figura 1D). Além disso, também determinado se as células do cancro do pulmão (células A549) expressa a proteína TREM-1. Nós não conseguimos detectar a expressão de TREM-1 ou mensagem de proteínas em células de tumor por si só (dados não mostrados). Colectivamente, estes dados sugerem que um TREM-expressão é regulada positivamente nos macrófagos associados a tumores no cancro do pulmão humano de células não pequenas.
A) RNA extraído de amostras de cancro do pulmão humano mostraram um aumento na TREM-1 mensagem. B) em tempo real de RT PCR confirmou o aumento da TREM-1 mensagem (n = 3, * P 0,05). imagem imunohistoquímica Representante demonstrando um aumento da expressão de TREM-1 proteína em macrófagos no estroma tumoral D) A microscopia confocal com CD68 C) um marcador de macrófagos específico e TREM-1 confirmou que células que expressam TREM são TAM.
TREM-1 é induzida em macrófagos humanos Co-cultivados com células do pulmão adenocarcinoma
uma vez que nossos dados demonstram que TREM-1 é expressa em macrófagos associados a tumores em adenocarcinoma de pulmão humano desenvolveu-se um
in vitro
modelo de co-cultura para determinar se a expressão de TREM-1 na TAM no tumor está relacionado especificamente para as células tumorais. experiências de co-cultura foram realizadas usando macrófagos humanos (monócitos humanos de sangue foram maturados a macrófagos, como descrito nos métodos) e A549, H23 e H838 células do cancro do pulmão humano. Para estas experiências as células tumorais ou células epiteliais normais (NL-20, ATCC) foram co-cultivados com macrófagos humanos com uma maturação de 48 horas. Expressão de TREM-1 foi determinada por análise FACS. Co-cultura de células de tumor com macrófagos conduziu a uma indução de TREM-1 como determinado a análise por FACS (Figura 2A). Por outro macrófagos mão que foram co-cultivados com células epiteliais normais não apresentaram um aumento na expressão de TREM-1 de proteína (Figura 2A e B), sugerindo que a expressão de TREM-1 na TAM é um efeito de células tumorais em macrófagos. Também realizamos experimentos adicionais para confirmar a expressão aumentada de TREM-1 mensagem. células epiteliais normais e células de cancro A549, células H23 e H838 foram co-cultivados com macrófagos humanos para 48 horas após o que o ARN foi extraído a partir de macrófagos. TREM-1 mensagem foi detectada por RT-PCR. De acordo com os nossos dados com macrófagos TREM-1 de expressão de proteínas que foram co-cultivados com células cancerosas mostrou um aumento na mensagem de TREM-1 que não foi detectada em macrófagos que foram cultivadas com as células epiteliais normais (Figura 2C). Em conjunto, estes dados confirmam que as células tumorais podem induzir a expressão de uma mensagem TREM-proteína e em macrófagos.
) A macrófagos foram co-cultivadas com as células epiteliais normais NL-20 () ou células do cancro do pulmão (A549, H23 ou H838) durante 48 horas. expressão TREM-1 foi aumentada em macrófagos que foram co-cultivados com células cancerosas, como demonstrado por análise FACS B) percentagem de células coradas que positivo para TREM-1, n = 3-4, * p 0,05) C) representativas RT- PCR a partir de macrófagos co-cultivados com células tumorais mostraram uma mostraram um aumento da expressão de mensagem de TREM-1.
indução de TREM-1 em tumor associado macrófagos é dependente de COX-2
a seguir, quis investigar o mecanismo pelo qual as células de tumor induzir a expressão de TREM-1 em macrófagos. (COX-2) elevada expressão cyclooygenase-2 foi frequentemente observada no cancro humano não-pequenas do pulmão de células [10], [29]. Nós e outros autores mostraram que as prostaglandinas modulam a expressão de TREM-1 em resposta a LPS, em particular a PGE2 induz Considerando PGD
2 e PGJ
2 inibem a expressão de TREM-1 [23] [24]. Por conseguinte, a hipótese de que a expressão de TREM-1 na TAM pode ser induzida por PGE
2 a partir de células tumorais através de via da ciclo-oxigenase. Em primeiro lugar, confirmou que o tecido de tumor e as células expressam a COX-2 (dados não mostrados). Os níveis de PGE
2 foram aumentados no tecido do tumor do pulmão (Figura 3A). Em seguida, tratada macrófagos derivados da medula óssea de ratinhos de tipo selvagem com PGE recombinante
2 e PGD
2 (10? Mol) e realizada RT-qPCR para determinar a expressão de TREM-1 mensagem. O tratamento com PGE
2 resultou na expressão de PGE
2 enquanto que as células tratadas com veículo e PGD
2 não mostraram indução de TREM-1 (Figura 3B).
A) de PGE
2 níveis medidos a partir do tecido do tumor de pulmão humano mostraram um aumento na PGE
2 a partir de tecido de cancro mensagem sem detecção significativa no pulmão normal (n = 3, p 0,05). macrófagos B) derivadas de medula óssea de ratinhos do tipo selvagem foram tratados com PGE recombinante
2 ou DGP
2 (10? mol) durante 12 horas e TREM-1 foi detectada expressão. BMDM tratados com PGE
2 mostraram um aumento na TREM 1-mensagem em resposta à PGE
2 de tratamento (n = 3-4, p 0,05), no entanto TREM-1 mensagem não foi detectado em células que foram tratadas com PGD
2.
a fim de confirmar o papel da COX-2 na indução de TREM-1 foram realizados experimentos em que co-cultivadas células de câncer de pulmão com monócitos /macrófagos durante 48 horas em a presença de inibidores de COX-2 ou do tratamento com veículo. macrófagos de controlo foram co-cultivadas com as células epiteliais normais NL-20. Expressão de TREM-1 foi determinada por análise FACS. Como mostrado na Fig 4A monócitos (U937) células que foram co-cultivados com células cancerosas (células A549) mostraram um aumento na expressão de TREM-1 de proteínas que não foi detectado quando as células U937 foram co-cultivadas com a NL-20 células epiteliais normais. O tratamento com inibidor de COX-2 (NS-398, 100 umol) resultou na revogação da indução de TREM-1 (Figura 4A e 4B). A fim de definir de forma conclusiva o papel de COX-2 de indução de TREM-1 que derrubado expressão de COX-2 em macrófagos, empregando siCOX-2. Os macrófagos foram transfectadas com siCOX-2 ou ARNsi de controlo durante 48 horas antes das co-cultura com as células cancerosas ou células epiteliais normais (NL20) e expressão da proteína TREM-1 foi detectada por análise FACS. Em primeiro lugar, confirmou que a expressão de COX-2 foi atenuada nas células knockdown da COX-2, tal como determinado por análise de Western blot para a COX-2 (Figura 5A). Tal como mostrado na figura 5B e C de proteína TREM-1 foi regulada positivamente em macrófagos que expressam ARNsi de controlo que foram co-cultivadas com células de cancro do pulmão (A549, H23 e H838 células), mas não em macrófagos que foram cultivadas com as células epiteliais normais. No entanto, a expressão de uma proteína-TREM foi revogada em macrófagos transfectadas com ARNsi de COX-2 que foram co-cultivadas com células de cancro A549 (H23, H838 ou células) (Figura 5B, 5C). Expressão de TREM-1 mensagem também foi revogada em macrófagos que foram tratados com siCOX-2 e co-cultivadas com células de tumor (Figura 5D). Em conjunto, estes dados mostram conclusivamente que a expressão de TREM-1 é COX-2 dependente e é mediada pela produção de PGE
2.
A) Imagem representativa de monócitos FACS análise-U937 foram co-ultured com NL-20 ou células A549 na presença de ausência de NS-398 (100 pmol) (específico inibidor de COX-2). A expressão de TREM-1 foi aumentada em células U937 co-cultivadas com células A549. O tratamento com o NS-398 inibiu este aumento de células de expressão B) Percentagem que manchavam positiva com TREM-1 (n = 4-5, p . 0,5)
A) análise de Western blot de macrófagos humanos com COX-2 siRNA confirmou derrubar de COX-2 de proteínas em células com siCOX-2 em comparação com o mock (controle) siRNA. B) imagens de FACS demonstrando TREM-1 expressão de macrófagos humanos expressando siRNA controle ou co-cultivados com células NL-20 ou células cancerosas (A549, H23 ou H 838 células) COX-2 siRNA. A expressão de TREM-1 foi aumentada em macrófagos que expressam ARNsi de controlo co-cultivadas com células cancerosas enquanto os macrófagos com siCOX-2 mostrou uma expressão atenuada de TREM-1. C) Percentagem de células que coradas positivas para coloração TREM-1 n = 3, p 0,05). D) Representante RT-PCR a partir de macrófagos com siCOX-2 mostram uma diminuição da mensagem de TREM-1 em comparação com macrófagos com controle de siRNA.
A seguir, queria definir o mecanismo pelo qual a PGE
2 medeia a expressão de TREM-1 em macrófagos associados a tumores. PGE comportamento das células
2 influências através da ligação das suas quatro receptores E-prostanóide acoplados à proteína G distinta, numerado EP1-4 [30], [31]. A fim de determinar os receptores através dos quais PGE
2 altera a expressão de TREM-1 foram realizadas experiências com a EP1 através de antagonistas de EP4. Os macrófagos foram tratados com o antagonista respectivo (10, 50 umol) antes da co-cultura com células A549. EP1 (GW848687) e antagonistas EP3 (L-978-106) não teve nenhum efeito significativo sobre a expressão de TREM-1 (dados não mostrados), no entanto as células que foram tratadas com EP2 (AH6809) e EP4 (AH23848) mostrou um antagonista reduzida expressão de TREM-1 proteína, tal como determinado por análise de FACS (Fig 6A e B). receptores EP2 e EP4 são potentes moléculas imunorregulatórios que compartilham a capacidade de aumentar as concentrações intracelulares de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) dentro de segundos a minutos de PGE
2 vinculativo. Assim, queríamos determinar se estes efeitos são mediados através de um aumento nos níveis de AMPc. Por isso, realizaram experiências com forscolina agonista de AMPc (10 umol) e de acordo com os nossos dados com bloqueio EP2 foi observado um aumento significativo na expressão de TREM-1 em resposta à forscolina (Figura 6A e 6B). Colectivamente estes dados mostram que a expressão de TREM-1 em macrófagos associados a tumores, que é induzida por PGE
2 é mediada através de receptores EP2 e EP4 e é accionado por um aumento no nível de cAMP.
A ) FACS imagens que demonstram que a expressão TREM-1 é atenuada em macrófagos que são co-cultivadas com células de tumor na presença de EP2 e EP4 antagonista (AH6809 e o AH23848), enquanto que é aumentada na presença de forscolina. células B) Percentagem que manchavam positiva com TREM-1 (n = 4-5, * p . 0,05)
Discussão
Nosso estudo mostra convincentemente que TREM-1 é expressa no tecido NSCLC humana e que a expressão é visto selectivamente nos macrófagos associados a tumores do estroma do cancro. Nós não conseguimos detectar a expressão de TREM-1 em tecido pulmonar normal ou em células tumorais isoladas. Além disso, mostramos que o tecido de tumor tem um aumento da expressão da COX-2 com PGE
2 de produção e que os macrófagos que são tratados com PGE
2 mostram um aumento da expressão de TREM-1. Além disso o tratamento com inibidores COX-2 e knockdown de COX-2 em macrófagos atenuou a expressão de TREM-1 num modelo de co-cultura de células do cancro do pulmão com macrófagos. Em conjunto, estes dados sugerem que TREM-1 pode ser um elo crítico no microambiente tumoral entre a ativação associado a tumor de macrófagos, resposta inflamatória, e progressão do câncer.
Cancro relacionados com a inflamação é agora reconhecida como uma marca de tumores e a ligação entre a carcinogénese do pulmão e a activação imunitária crónica está bem estabelecida [32] [33] [34] [35] [36]. O processo inflamatório presente no microambiente do tumor é caracterizado por infiltração de leucócitos, que inclui macrófagos associados a tumores mastócitos, células dendríticas, células natural killer, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos [37] [38] [32]. Também é cada vez mais reconhecido que a interacção das células cancerígenas, macrófagos, e resposta inflamatória no microambiente tumoral pode facilitar a invasão de células de cancro e metástase [39] [40] [41] [42] [43] [44]. Anteriormente, temos demonstrado que os macrófagos pulmonares residentes estão efetores cruciais de susceptibilidade para o crescimento do câncer de pulmão metastático [45]. Vários rato e estudos em seres humanos mostraram que a elevada densidade de TAM é geralmente associada com um mau prognóstico do paciente e de resistência às terapias em uma variedade de cancros, incluindo o cancro do pulmão não pequenas células [46] [47] [40] [41] [42] [ ,,,0],48] [44] [49]. Além disso, a depleção de monócitos /macrófagos nas configurações experimentais tem sido bem sucedida para limitar o crescimento de tumores e disseminação metastática e na obtenção de melhores respostas a quimioterapia convencional e terapia anti-angiogénico [50] [13]. Embora TAM contribuem significativamente para a produção de VEGF, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-23, IL-8, MMP que têm atributos pró-angiogénicos e crescimento, vias moleculares específicos em macrófagos que immunoedit crescimento do tumor não são bem definido [37]. Encontramos macrófagos abundantes no estroma do tecido tumoral, que mostrou tanto TREM-1 e CD68 expressões. CD68 é um marcador de macrófagos em macrófagos associados a tumores, que desempenha um papel importante na angiogénese e metástase. Aumento nos macrófagos CD68 positivas em nosso estudo suporta a hipótese de que os macrófagos inflamatórios expressar TREM-1 pode contribuir para a continuidade da produção de mediadores que podem promover o crescimento do tumor.
Disparo receptor expressa em células mielóides 1 (TREM-1) é um membro da super família de imunoglobulina expressos num grupo restrito de células mielóides principalmente monócitos /macrófagos. Expressão de TREM-1 tem sido associada a uma resposta inflamatória imune. Inflamação promove várias marcas de câncer, como o de sinalização proliferativa sustentada, resistência à morte celular e indução de angiogênese [51] [35] [36]. Estudos recentes sugerem que a expressão de TREM-1 em tumores pode prever a agressividade do cancro e de doenças resultados em cancro do fígado e do pulmão, implicando que a expressão de TREM-1 em macrófagos pode ser uma associada com o crescimento do tumor e progressão [25] [26] [27] . Demonstramos que as consequências funcionais de silenciamento TREM-1 gene em macrófagos incluem uma disponibilidade alterado de sinalização chave (CD14, IκBα, MyD88), e moléculas efectoras (MCP-1, IL-1, IL-6, IL-23) a jusante da activação de TLR [22] [21] [19]. Em particular, a produção de IL-6 e IL-23 é exagerado por uma activação TREM-[22], [52]. IL-6 e IL-23 foram mostrados para ser envolvidos na imuno-edição no microambiente de carcinoma e está associado com prognóstico pobre [53] [54] [55] [56]. Embora especulativa a produção exagerada destes mediadores por TREM-1 pode ser um mecanismo pelo qual TREM-1 na expressão do TAM pode promover o crescimento tumoral e progressão. Estudos em andamento e futuras irá estabelecer o papel de TREM-1 no crescimento do tumor e definir os mecanismos pelos quais TREM-1 modula o crescimento do tumor [27] [56].
Neste estudo também investigou o mecanismo pelo qual TREM-1 é expresso na TAM. Uma vez que a expressão de TREM-1 é modulada por mediadores lipídicos particularmente prostaglandina que investigaram o papel da via da ciclo-oxigenase. Mostra-se que a inibição da COX-2 conduziu à atenuação da expressão de TREM-1 em macrófagos. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que demonstra que a expressão de TAM TREM-1in no microambiente do tumor é dependente da via de sinalização da COX-2. Também mostram que o tecido do tumor do pulmão tem um aumento da produção de PGE
2 o que provavelmente contribui para a expressão de TREM-1 na TAM. Além disso, os nossos estudos com os antagonistas do receptor de EP mostram que os efeitos de PGE2 em tumores micro-ambiente são mediados por receptores EP2 e EP4 e são um resultado do aumento de cAMP.