Sumário

epitelial para mesenquimal (EMT) é um processo biológico de câncer metastático. No entanto, uma terapia anticancerosa eficaz que tem como alvo directamente o programa EMT ainda não foi descoberto. Estudos recentes indicaram que a transição epitelial mesenquimal (TEM), o fenómeno inverso do EMT, é observada em fibroblastos durante a geração de células estaminais pluripotentes induzidas. No presente estudo, investigamos os efeitos de fatores de reprogramação (RFS) em carcinoma de células escamosas células (SCC). células cancerosas RFS-introduzidas (RICS) demonstrou as características epiteliais aprimorados na morfologia com expressão alterada de mRNA e microRNAs. As atividades da motilidade e invasivos de RIC

in vitro

foram significativamente reduzidos. Além disso, os xenoenxertos de RIC exibiu nenhuma metástase linfática, ao passo que a metástase foi detectado em ratinhos inoculados SCC-parentais. Assim, concluímos que RIC recuperou propriedades epiteliais através do MET e mostraram redução da malignidade do câncer

in vitro

e

in vivo

. Portanto, o entendimento do processo de MET em células cancerosas através da introdução de FR podem levar à concepção de uma estratégia anti-cancerígeno romance

Citation:. Takaishi M, Tarutani M, Takeda J, Sano S (2016) mesenquimais para epitelial de Transição induzida por fatores de reprogramação Atenua a malignidade das células cancerosas. PLoS ONE 11 (6): e0156904. doi: 10.1371 /journal.pone.0156904

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 23 de dezembro de 2015; Aceito: 20 de maio de 2016; Publicação: 03 de junho de 2016

Direitos de autor: © 2016 Takaishi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. M. Takaishi foi apoiado pelo Ministério japonês da Educação, Ciência, Desporto e Cultura (https://www.jsps.go.jp/english /e-grants/index.html). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro representa uma condição de risco de vida, com o aumento da mortalidade quando se metástase. Embora os mecanismos de metástases do cancro não são ainda totalmente compreendidas, sabe-se que a aquisição de propriedades invasivas é accionado por epitelial para mesenquimal (EMT) [1, 2]. Cancro sob EMT é caracterizada por uma perda de adesões intercelulares, um ganho de motilidade celular, e o aumento da actividade invasiva. Uma das principais características de EMT é a perda funcional da proteína de junção de adesão, E-caderina (CDH1), através de vários mecanismos, incluindo a mutação do gene, a hipermetilação, e repressão do seu promotor [1, 3, 4].

fatores de transcrição repressivas para CDH1 incluir o (a) familiar Snail (SNAI1 e SNAI2) [5, 6], (b) a família twist (TWIST1 e TWIST2) [7, 8] e (c) a família ZEB (ZEB1 /dEF1 e ZEB2 /SIP1) [9-11]. Estes factores de transcrição podem interagir com o elemento E-box da

CDH1

promotor, que conduz à diminuição da regulação da sua expressão. A sobre-expressão destes genes indutores de EMT é frequentemente observada nas células de cancro metastáticas [1, 3, 4]. Pelo contrário, a infra-regulação da expressão do gene de indução de EMT restaura expressão

CDH1

e conduz à atenuação de malignidade do cancro através de um mecanismo conhecido como mesenquimais para epiteliais de transição (TEM), o programa inversa de EMT [1, 12-14].

os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes que regulam a expressão dos genes-alvo ao nível pós-transcricional e são conhecidos por desempenhar um papel essencial em diferentes tipos de câncer. Tem sido relatado que os factores de transcrição de indução de EMT, que suprimem a expressão

CDH1

, são regulados negativamente pelas miARNs (MIR 200 familiar, miR-203 e miR-205, etc.) [15 -17].

Durante a geração de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos de murino pela introdução de genes do factor de quatro reprogramação, OCT3 /4, Sox2, KLF4, e Myc, as células passaram por MET [ ,,,0],18, 19]. Enquanto iPSCs foram geradas a partir das células primárias, estudos recentes têm explorado as possibilidades de reprogramação de células malignas, incluindo leucemia, sarcoma, melanoma e outros tipos de células cancerosas para expor um estado iPSC-como

in vitro

[ ,,,0],20-25]. As células malignas reprogramadas mostrou um estado pluripotente-like com um programa de diferenciação alterado que levou à perda de tumorigenicidade. No entanto, era incerto se malignidade do câncer foi atenuada através do mecanismo MET-mediada com fatores de reprogramação.

Assim, o objetivo do presente estudo é demonstrar que as células SCC diminuir maligno potencial

in vitro

e

in vivo

através MET pela introdução de fatores de reprogramação sem o estado pluripotente-like. Estas descobertas são altamente relevantes para o desenvolvimento de novas e eficazes estratégias terapêuticas para o tratamento do câncer.

Materiais e Métodos

A geração de células iPS usando o sistema de transposon piggyBac

normais queratinócitos epidérmicos humanos ( NHEKs) isoladas a partir de prepúcios foram obtidos a partir de Kurabo (Osaka, Japão) e foram cultivadas em Epilife II (Invitrogen) suplementado com Humedia-KG (Kurabo). pCMVmPBase e os plasmídeos contendo o transposão piggyBac transportando os fatores de reprogramação (POU5F1 (OCT3 /4), SOX2, KLF4, cMyc, e LIN28) [26, 27] foram usados ​​para transfectar as NHEKs com sistema NÉON transfecção (Invitrogen). Os NHEKs transfectadas foram imediatamente inoculados em células de alimentação em Primata ES celular médio (ReproCell, Yokohama, Japão) suplementado com bFGF (4 ng /ml), Y-27632 (10 uM), CHIR99021 (3 fiM), PD0325901 (0,5 uM) e SB431542 (5 uM), todos os reagentes foram da Wako Puré Chemical Industries (Osaka, Japão). O meio foi mudado para meio fresco a cada dois dias. células ES como colónias apareceram nos dias 10-14, e foram escolhidas e expandiu ainda mais aproximadamente no dia 21. Para investigar se as células iPS derivadas de NHEKs tem ES-como fenótipo, as células foram coradas com kit de substrato de fosfatase alcalina (Vector Laboratories, Burlingame, CA), e com anticorpo anti-Nanog (Abcam, Cambridge, Reino Unido). As células iPS foram inoculadas em testículos de ratos SCID (Clea Japan, Tóquio, Japão), sob anestesia e os ratos foram sacrificados para excisar os testículos no dia 60 após o transplante de células. Os testículos foram fixadas com formalina e processados ​​para seção de parafina para exame histopatológico.

As linhas celulares

linhas de células SCC Humano, HOC313 e TSU [28, 29], foram dotados pelo Dr. Kamata, Institute of Biomedical Ciências da Saúde, Universidade de Hiroshima, Japão. As células OSC-19 e células NCCIT foram comprados da coleção japonesa de Investigação Bioresources Cell Bank (Ibaraki, Japão). Todas as linhas celulares foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e antibióticos

introdução de factores de reprogramação

o vector de transposão piggyBac e o vector de expressão de transposase-foram co-transfectados para as células SCC subconfluentes utilizando o reagente Fugene 6 (Roche, Basileia, Suíça). Dois dias após a transfecção, puromicina em concentrações finais de 1 ~ 5 ug /ml foi adicionado ao meio de cultura de células para a selecção. As células foram mantidas em DMEM suplementado com 10% FBS e antibióticos.

morfológica celular avaliação

As alterações na morfologia celular foram avaliados através do cálculo da razão entre comprimento e largura de cada uma das células sob um microscópio usando 20 células por grupo.

quantitativo em tempo real de RT-PCR

os ARNs totais foram extraídos utilizando um kit RNAeasy (Qiagen, Venlo, Países Baixos) e foram sujeitos a transcrição reversa usando hexâmeros aleatórios e Superscript III (Thermo Fisher Scientific). Cada cDNA foi submetido a PCR quantitativa, utilizando Poder SYBR Green Mix PCR Mestre em Sistemas de Detecção de Sequência 7300 (Thermo Fisher Scientific). a expressão de ARNm relativa foi normalizada para a expressão de transferase de hipoxantina-guanina-fosforibosil (HPRT). Os iniciadores utilizados neste estudo foram listados na Tabela S1.

Detecção de microRNAs

O total de RNAs foram preparados a partir de células cultivadas utilizando uma miRNeasy mini-kit (Qiagen). Em conformidade com as instruções do fabricante, cada molde de ADNc foi preparado utilizando um kit de miScript II RT (Qiagen) e a expressão de microRNAs foi testada usando um kit miScript SYBR Green PCR juntamente com o iniciador miScript Ensaio (Qiagen). Isto foi seguido pela normalização da miARN com SNORD61.

MTS ensaio

Um total de placas de 96 poços foram considerados para o estudo que continha 1000 células cada, que foram semeadas. Um e dois dias mais tarde, o reagente MTS (Promega, Madison, WI, EUA) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante duas horas. Subsequentemente, os valores de absorvância foram também determinadas a 490 nm utilizando um espectrofotómetro.

imunofluorescente coloração

Células cultivadas em lâminas de câmaras (Thermo Fisher Scientific) foram fixados, quer com paraformaldeído a 4% em solução de PBS a 4 ° C ou 100% de metanol a -20 ° C, e bloqueadas com solução de bloqueio isento de soro (Dako, Glostrup, Dinamarca). Os anticorpos primários foram incubados a 4 ° C durante a noite, seguido por lavagem em PBS e incubadas com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific). Os núcleos foram corados com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato (DAPI). Os anticorpos primários utilizados foram listados na Tabela S2. imagens de fluorescência foram capturadas usando um microscópio com um sistema de câmera charge-coupled device. (DP-71; Olympus, Tóquio, Japão)

Imunohistoquímica

As secções embebidas em parafina obtidos a partir dos xenotransplantes foram desparafinadas e incubou-se em 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) durante 10 min a 105 ° C. As secções foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, seguido por lavagem em PBS e incubação com os respectivos anticorpos secundários (Dako). Os sinais foram visualizados utilizando tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina. Os anticorpos primários utilizados neste estudo estão listados na Tabela S2.

citometria de fluxo

suspensão celular foi incubada com o anti-TRA-1-60 (Millipore), TRA-1-81 (Millipore ), ou IgM de ratinho (Bioledend) como controlo de isotipo para 30 min em gelo e seguido por incubação com 488 de anticorpo anti-ratinho conjugado com Alexa Fluor IgM. As células foram analisadas num citómetro de fluxo LSRFortessa (BD Biosciences) utilizando o software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR).

A microscopia electrónica

totalmente células confluentes em pratos de 35 mm foram fixadas com 2% glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,3) e com 1% de tetróxido de ósmio pós-fixados, seguido de 5% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M. O óxido de propileno foi utilizado para dissolver os pratos de cultura para obter as folhas de células. As secções ultra-finas foram observadas utilizando um microscópio Hitachi H-7100 de electrões (Hitachi High-Technologies, Tóquio, Japão).

análise Western blot

Os lisados ​​celulares foram preparados usando tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (tampão RIPA; Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, EUA) ou de solução de ureia (9 M de ureia, 2% de Triton-100, 5% de 2-mercaptoetanol), separadas em géis de gradiente de 4-15% (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA) e colocados a hibridar em difluoreto de polivinilo (PVDF) membranas (Bio-Rad). Um kit ECL Prime (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) foi utilizada para a detecção de sinal. Os anticorpos utilizados são listados na Tabela S2. ImageJ (NIH) foi utilizado para a quantificação dos sinais.

In vitro

cicatrização de feridas ensaio

células totalmente confluentes em seis bem-placas foram tratadas com mitomicina C (10 ug /ml) durante três horas, seguido por zero ferimento utilizando uma ponta de micropipeta amarelo e lavagem com um meio de pré-aquecido. Cicatrização de feridas por células que migram foi observada usando microscopia de contraste de fase e foi fotografada nos horários especificados. A distância de migração de células do outro lado da ferida foi medida ao longo do tempo.

invasão celular ensaio

In vitro

invasão celular foi avaliada utilizando câmaras de Boyden na presença de revestimento de Matrigel ( Corning, Corning, NY, EUA). Um total de 25 × 10

3 células foram inoculadas em câmaras superiores de placas de 24 poços e incubou-se durante 24 horas. As células ligadas à membrana entre as câmaras superiores e inferiores foram coradas com azul de toluidina e contadas sob um microscópio.

O xenotransplante de células SCC humana na nu camundongos /nu

Para o modelo ortotópico, os factores parentais em cultura ou a reprogramação introduzidas células OSC-19, que foram suspensas em PBS a uma densidade de 1,0 x 10

7 células /ml. Sob a anestesia de isoflurano, 2,0 × 10

5 células viáveis ​​foram inoculados na margem lingual de sete semanas de idade, ratinhos /c-nu /nu fêmea BALB (Japan SLC, Hamamatsu, Japan). O peso corporal dos ratos foi medida três vezes por semana para acompanhar a sua condição até ponto final experimental. As linguetas e os nódulos linfáticos de drenagem foram dissecados a partir de ratinhos sacrificados no dia 21. As linguetas foram fixadas com formalina e processados ​​para análise histológica. As áreas de tumores nos tecidos da língua foram calculados sob um microscópio usando o software de aplicação (DP2-BSW, Olympus). O ARN total foi extraído a partir dos nódulos linfáticos cervicais, e a expressão do gene de citoqueratina 18 humana foi avaliado através quantitativo em tempo real de RT-PCR. Para o modelo de metástase órgão distante, os pais células OSC-19 e os RIC foram suspender a uma densidade de 1,0 × 10

6 células /ml e 2,0 × 10

5 células foram transplantadas via veia da cauda do sexo feminino nu /nu ratos. Dia 47 após o transplante de células, os ratinhos foram sacrificados e seguido por necropsia. lobo cranial do pulmão direito foi utilizado para extracção de ARNm e seguido quantitativo em tempo real de RT-PCR para detectar a expressão do gene de citoqueratina 18. humano esquerdo do pulmão, fígado, rim e baço foram fixadas com formalina e processados ​​para análise histológica. assegurou-se que todas as experiências envolvendo ratos rigorosamente respeitadas as diretrizes institucionais estabelecidas para minimizar sofrimento aos animais. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Faculdade de Medicina Kochi.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada com o software Prism (GraphPad, CA, EUA), utilizando um Student não pareado

t

e teste exato de Fisher.

resultados

a introdução de fatores de reprogramação (FR) em células SCC Restaura epitelial Morfologia, mas não fornece a pluripotência

Para introduzir FR, foi utilizado o vector piggyBac transposon, em que

POU5F1

(

OCT3 /4

),

SOX2

,

KLF4

,

cMyc

, e

LIN28

foram incluídos [26, 27]. Usando isso, poderíamos com sucesso gerar células iPS (Fig 1B) de queratinócitos epidérmicos humanos normais (Fig 1A). As células iPS expressa fosfatase alcalina (Figura 1C) e NANOG (Figura 1D), o que indica a stemness. Eles desenvolveram teratomas

in vivo

e mostrou três elementos germinais, ou seja, epitélio (Fig 1F), epitélio neural (Fig 1G) e da cartilagem (Fig 1H). Para investigar o impacto da FR em células de câncer

in vitro

, usamos três linhas SCC humanos: HOC313, TSU e células OSC-19. Entre eles, as duas linhas celulares, HOC313 e TSU, tinha uma forma de fuso do tipo fibroblastos com o aumento e diminuição da Snail1 E-caderina expressão, o que indicou que as células SCC foram submetidos EMT [30]. Usando este sistema de vector de transposão, as linhas SCC foram introduzidos os FR, que foi avaliada por Western blotting (Figura 2C). Surpreendentemente, as células cancerosas introduziu-RF (RICS) de todas as linhas de CCS apresentaram uma mudança morfológica drástica a partir do eixo à forma poligonal (Fig 2A). Avaliação do comprimento da célula /largura entre CCEs parental e RIC revelaram redução específica no último (fig 2B), o que sugere que o TEM também foi induzida em CCEs como mostrado na fibroblasto durante a indução de PISQ por RF [18, 19]. Deve notar-se que ambas as linhas de RIC cancerosas não expressaram TRA-1-60 e TRA-1-81, os marcadores de superfície de células pluripotentes, ao passo que uma linha de teratoma NCCIT expressa-los por Western blotting (Figura 2D) e citometria de fluxo (Fig 2E e 2F). Este resultado sugeriu que RIC não adquirir a pluripotência mesmo após a introdução com FR. Para estudar o impacto da MET induzida pela RFS foram utilizadas as células HOC313 e OSC-19 células para uma investigação mais aprofundada.

(A, B) imagem de contraste de fase de queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEK) (A) e iPS as células geradas a partir de NHEK por introdução dos vectores piggyBac transposões (B). Bares, 200 M em A B. (C, D) As células iPS tem actividade de fosfatase alcalina (C) e expressar NANOG (D), sugerindo stemnss das células iPS queratinócitos humanos derivados. Bares, 100 um de C D. (E) teratomas foram desenvolvidos quando as células iPS foram inoculados nos testículos dos camundongos SCID. Bar, a 400 uM. (M-H). Os teratomas abrigar três elementos camada germinativa, epitélio (F), epitélio neural (G) e da cartilagem (H), indicando pluripotência das células iPS. Bares, 100 mm em F, G e H.

células SCC humanos dos Pais (esquerda) de HOC313 e TSU show de fibroblasto-como morfologia (A); No entanto, as células introduzidas fatores de reprogramação (RIC, painéis direitos), exibem morfologia poligonal, epitelial semelhante. Os RIC de células OSC-19 mostrar mais colónia de células antros do que as células parentais. (Barra de escala, 100 um) (B) a morfologia celular é quantificada pela razão entre comprimento e largura de cada célula a partir de pelo menos 20 células cada um a partir de células parentais de CCS (círculos abertos) e RIC (círculos fechados). A proporção de aproxima-se de um RIC, indicando-los como epiteliais, células de forma poligonal. **

P Art 0,01 por Student

t

-teste. (C) Os factores de reprogramação introduzidas foram avaliados por análise de Western blot. P, as células dos Pais. R, RIC. β-Actina (ACTB) foi utilizado como controlo de carga. (D-F) Expressão de TRA-1-60 e TRA-81 foi estudada por Western blotting (D) e citometria de fluxo (E, F). Os dados representativos e média ± DP de três experiências independentes de citometria de fluxo foram mostradas em E e F, respectivamente. Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT) foi utilizado como controlo de carga de (D). As linhas azuis; os anticorpos específicos, linhas vermelhas; rato de controlo de isotipo IgM em (E). NCCIT, uma linha celular humana teratoma, foi usado como um controle na (DF).

mesenquimais-epitelial transição ocorre no RIC

A seguir, explorou as mudanças na expressão de células epiteliais e genes de assinatura mesenquimais em RIC de HOC313 e células OSC-19 utilizando qRT-PCR. genes assinatura epiteliais, incluindo

CDH1

,

DSC 2

,

DSP

,

TGM1

, e

JUP

foram significativamente regulada em ambos os RIC em comparação com as respectivas células parentais (Figuras 3A e 4A). Regulação positiva de

ITGA6

e

ITGB4

no RIC de

HOC313

células e

também foi observado KRT14

no RIC a partir de células OSC-19. No entanto, a expressão de um factor de transcrição específico do epitélio, como proteína grainyhead-2 homólogo (GRHL2) não foi alterada entre as células parentais e RIC de ambas as linhas de SCC.

(A, B) alteração da expressão do gene perfil em RIC HOC313 de células, os genes marcadores epiteliais (a) e genes marcadores mesenquimais (B). A expressão de ARNm foi normalizada com HPRT, e a quantidade relativa de cada gene foi mostrado. barras azuis, células parentais. As barras vermelhas, RIC. Barras representam a média ± DP a partir de pelo menos três experiências independentes. **

P Art 0,01. Estudante

t

-teste. (C) análise de transferência de Western. P, as células dos Pais. R, RIC. (D) Os sinais da análise de Western foram quantificadas utilizando o ImageJ. Os sinais foram normalizados com HPRT. Dobre mudança na RIC de células parentais foram representados, a média ± SD e proporção de três experimentos independentes dizer. (E) imunofluorescência coloração de células HOC313 parentais e os RIC com anti-pankeratin (KRTs) e anticorpos β-catenina (CTNNB1). micrografias (F) Electron. As setas indicam estruturas desmosome-like. Barra de escala, de 0,2 um. (G) A expressão de miRNAs no RIC (barras vermelhas) em comparação com células HOC313 parentais (barras azuis). miRNA foi normalizada com SNORD61. Barras representam a média ± DP a partir de pelo menos três experiências independentes. **

P Art 0,01 por Student

t

-teste.

(A, B) Alteração do perfil de expressão gênica em RIC a partir de células OSC-19, genes marcadores epiteliais (A) e genes marcadores mesenquimais (B). A expressão de ARNm foi normalizada com HPRT, e a quantidade relativa de cada gene foi mostrado. barras azuis, células parentais. As barras vermelhas, RIC. Barras representam a média ± DP a partir de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. Estudante

t

-teste. (C) análise de transferência de Western. P, as células dos Pais. R, RIC. (D) Os sinais da análise de Western foram quantificadas utilizando o ImageJ. Sinais normalizados com HPRT. Dobre mudança na RIC de células parentais foram representados, a média ± SD e proporção de três experimentos independentes dizer. (E) imunofluorescente coloração de células OSC-19 parentais e os RIC com anti-pankeratin (KRTs), anti-caderina-E (CDH1), e anticorpos anti-desmocollin2 (DSC2). micrografias (F) Electron. As setas indicam estruturas desmosome ou desmosome-like. Barra de escala, de 0,2 um. (G) Comprimento do desmosomes ou estruturas desmosome-like sobre as micrografias eletrônicas. A média ± DP dos 30 objectos. **

P Art 0,01 por Student

t

-teste. (H) Os desmosomes ou desmosome-como a estrutura com tonofilamentos foram contados entre os 30 objetos. (I) A expressão de miRNAs no RIC (barras vermelhas) em comparação com parentais OSC-19 células (barras azuis). miRNA foi normalizada com SNORD61. Barras representam a média ± DP a partir de pelo menos três experiências independentes. **

P Art 0,01 por Student

t

-teste.

Por outro lado, RIC de HOC313 células mostraram uma expressão significativamente reduzido de genes assinatura mesenquimais (Fig 3B), incluindo

TGFB1

,

TGFBR2

,

SNAI1

,

SNAI2

e

ZEB2

. OSC-19 RIC mostrou a expressão do gene reduzido de C

DH2

,

TGFB2

,

TGFBR2

,

VIM

e

COL1A2

( Fig 4B). Entre os genes marcadores mesenquimais,

TGFBR2

era comumente reprimidos nas RIC partir de duas linhas. análise de Western blot detectado um aumento dos níveis de CDH1, JUP (γ-catenina), DSC2 e KRTs no RIC, que foram associados com o fenótipo epitelial (Figuras 3C e 3D e 4C e 4D). Como conformidade com Q-RT-PCR, a perda de ganho e de SNAI2 KRT14 também foram observados por Western blot em HOC313 RIC e OSC-19 RIC, respectivamente. Correspondentemente, o processo de imunocoloração revelou que OSC-19 RIC tinha um aumento acentuado de queratinas, CDH1 e DSC2 (Figura 4E). A expressão aumentada de queratinas também foi observada em HOC313 RIC (Figura 3E). localização alterada de CTNNB1 sugeriu reforçada célula para a adesão celular em HOC313 RIC (Fig 3E). Além disso, microscopia eletrônica mostrou amadurecido desmosome com tonofilamentos em HOC313 RIC, enquanto as células parentais apresentaram estruturas desomosome-like incompletas, onde a área de alta densidade de elétrons foi visto em frente para duas membranas celulares (Fig 3F). Em OSC-19 RIC, os desmosomes eram maiores do que os das células parentais ea maioria deles exibiu tonofilamentos maduros, enquanto que as células parentais mostrou desmosome imatura sem tonofilamentos (Fig 4F e 4h). Coletivamente, os RIC mostrou reaparecimento de junções desmossômicas, que são a principal característica das células epiteliais bem organizados, sugerindo TEM.

A seguir, examinou microRNAs (miRNAs), que supostamente direcionadas as moléculas indutoras de EMT. Os HOC313 RIC apresentaram níveis aumentados de membros miR-200 familiares (miR-200a, -200b, -200C, -141 e -429), miR-203 e miR-205 (Fig 3G), que poderia regular negativamente a famílias Snai e Zeb [15-17]. As OSC-19 RIC apresentaram níveis aumentados de miR-203 e miR-205, embora os membros da família de miR-200, não foram alterados (Figura 4I). Isto sugere que a introdução de FR conduziu a expressão de alguns miARNs com diferentes perfis de entre as células SCC EMT-supressora. Conclusivamente, os FR induzidas MET nas linhas de células humanas SCC nos níveis de transcrição e pós-transcricional.

fatores de reprogramação afectar a mobilidade celular da SCC

in vitro

altamente expresso FR nas RIC (Fig 2C) poderia ter afetado a proliferação celular [31], pois o

in vitro

proliferação de células de RIC foi acessado. O ensaio MTS revelou nenhuma diferença significativa na proliferação de células entre as células parentais e RIC (Fig 5A e 5E). As células cancerosas sob EMT adquiriu aumento da motilidade celular que levou à invasão e metástase. Para avaliar se os FR reverter a motilidade celular da SCC, foi utilizado um

in vitro

ensaio de cicatrização de feridas. A migração de células de RIC de HOC313 e OSC-19 foi marcadamente atenuada em comparação com as células parentais (Fig 5B, 5C, 5F e 5G). Em comparação com as células parentais, a capacidade de migração de RIC foi reduzida para 25% e 40% em HOC313 RIC e OSC-19 RIC, respectivamente. capacidade de invasão das células

in vitro

foi avaliada utilizando Boyden câmaras na presença de revestimento de matrigel. O número de RIC, que migraram através da membrana, foi significativamente menor do que o das células parentais (Figura 5D e 5H). Estes resultados indicam que tanto a motilidade celular e invasão

in vitro

foram prejudicadas notavelmente nos RIC.

HOC313 células parentais e os RIC (AD), OSC-19 células parentais e RICS (EH ). (A, E) A proliferação celular foi estudada pelo ensaio de MTS. número de células proliferaram Relativa durante 24 horas foi mostrado. A média ± DP de três experiências independentes. NS, não houve diferença significativa. (B, F)

In vitro

ferida ensaio curando revelou que a migração celular foi marcadamente prejudicada em RIC, em comparação com as células parentais. (Barra de escala, 500 um). Os dados representativos são apresentados a partir de três experiências independentes. Os tempos de avaliação são indicados. (C, G) Migrando distância de RIC (barra vermelha) é significativamente reduzida em comparação com as células parentais (barra azul). Os valores mostram média ± SD.

n

= 3. **

P Art 0,01 por Student

t

-teste. (D, H) actividade invasiva celular foi reduzida em RIC (barras vermelhas), em comparação com as células parentais (barras azuis) utilizando câmaras de Boyden revestidas com Matrigel. Os valores mostram média ± SD.

n

= 3. **

P Art 0,01 por Student

t

-teste.

Redução

in vivo

malignidade em RIC

Para estudar o impacto da MET induzida pela RFS na a atenuação de SCC malignidade, foram utilizadas as células OSC-19, uma vez que eles eram conhecidos para metastizar para os nódulos linfáticos cervicais quando implantado no margem lingual dos ratinhos nus [32]. Conforme demonstrado no estudo realizado por Maekawa

et al

. [32], 2.0 × 10

5 de células parentais ou RIC foram transplantadas para as línguas dos ratos nus para verificar se o RIC mostrou alterou o

in vivo comportamento maligno

. Subsequentemente, a formação de tumores nas linguetas e as metástases para os nódulos linfáticos drenantes foram avaliados no dia 21. Os tumores derivados das RIC expressa LIN28, uma das FR (Fig 6A). Eles também mostraram maior expressão de DSC2 do que as células parentais (Fig 6A), o que indica que RIC preservou as características epiteliais melhoradas inicialmente observadas

In vitro

(Fig 4A e 4C). O tamanho dos tumores formados por RIC (

N

= 15) foi significativamente menor do que a formada pelas células parentais (

N

= 15), indicando a atenuação de

in vivo

crescimento dos RIC (Fig 6A e 6B). As metástases dos parentais OSC-19 células para os nódulos linfáticos cervicais foram detectadas pela presença de expressão keratin18 humano utilizando RT-PCR e encontrado em 6 das 15 células parentais ratinhos inoculados, ao passo que sem metástases foram encontradas no grupo inoculado-RIC ( Fig 6C,

P Art 0,01 pelo teste exato de Fisher). Notavelmente, em ratinhos que foram inoculados com células SCC parentais, os tamanhos das massas tumorais correlacionada com a probabilidade de metástases (círculos a cheio na Fig 6B). De fato, as áreas de tumor nas línguas de camundongos portadores de câncer metastático e sem metástases foram 4,83 ± 1,65 milímetros

2 e 1,90 ± 1,85 mm

2, respectivamente (

P Art 0,01 por t de Student -teste). Em contraste, os tumores derivados de RIC não metastatizam até mesmo quando cresceram tão grande como tumores de células parentais metastizados (Fig 6B). Além disso, para investigar a capacidade metastática das células para órgãos distantes, as células parentais OSC-19 e os RIC foram transplantadas em ratinhos nude via veia da cauda (2 × 10

5 células /ratinho). A célula transplantado ratinhos nus viveu sem qualquer sintoma, até o ponto final experimental, dia 47 após o transplante de células. Nenhum crescimento do tumor foi observada em órgãos torácicos ou abdominais macroscopicamente. Além disso, não foi observada nenhuma evidência de crescimento de tumores no pulmão, fígado, baço e rim (dados não mostrados). No entanto, a expressão de citoqueratina 18, embora fosse muito baixo nível, foi detectada a partir dos tecidos pulmonares em 2 de 4 amostras de OSC 19 ratinhos células inoculadas parentais, enquanto que nenhum sinal foi detectado em todas as amostras de RIC-inoculados os ratinhos (Figura 6D). Isto sugere a presença de micrometástases pulmonares de OSC-19 células parentais. Assim, o potencial da exposição RIC menos malignos do que as células parentais

in vivo

(A) Imagens representativas de histologia (H E). E coloração imuno-histoquímica para LIN28 e DSC2 em massas tumorais de as linguetas 21 dias após a inoculação de células parentais e RIC OSC-19. A área do tumor em um tecido língua foi cercado com uma linha pontilhada (painéis de H E coloração). As barras de escala, 500 um e 100 um em H E de coloração e 100 ^ M em imunocoloração. (B) O crescimento do tumor em as linguetas de ratinhos nu /nu no dia 21 após a inoculação das células parentais (círculos) e RIC (quadrados). símbolos fechados referem ratos que exibem metástases para linfonodos. As barras mostram área média do tumor (mm

2).

n

= 15 (resultados cumulativos de três experimentos independentes.

n

= 5, cada grupo). *

P Art 0,05 por Student

t

-teste. (C) Detecção de queratina humana 18 ARNm a partir de nódulos linfáticos de ratinhos inoculados com células parentais mas não a partir de murganhos inoculados-RIC. Expressão de keratin18 humana nos nódulos linfáticos foi detectada utilizando qRT-PCR e foi normalizada com HPRT rato exceto para os controlos positivos, que são normalizados com HPRT humano. metástases linfáticas, ocorreu em seis dos 15 camundongos inoculados com células SCC parentais nos línguas, em nítido contraste com nenhuma metástase em ratos RIC-inoculadas. C; controlar os nódulos linfáticos sem xenotransplante, P; parentais OSC-19 células, R; RIC de OSC-19. O nível de expressão da queratina 18 humana foi quase o mesmo para as duas linhas celulares. (D) Detecção de queratina humana 18 mRNA a partir de pulmão de ratos nu nu /.