Abstract

A activação da via /β-catenina Wnt foi observada em pelo menos 1 /3 de carcinoma hepatocelular (HCC), e um número significativo destes possuem mutações no gene β-catenina. Portanto, a inibição eficaz desta via pode proporcionar um novo método para o tratamento de carcinoma hepatocelular. O propósito deste estudo foi determinar se FH535, que foi mostrado anteriormente para bloquear a via β-catenina, poderia inibir a ativação β-catenina de genes-alvo e inibir a proliferação de cancro do fígado Stem Cells (LCSC) e linhas de células de carcinoma hepatocelular. Usando β-catenina genes repórter sensível, os nossos dados indicam que FH535 pode inibir a activação do gene alvo endógeno e exógeno por expressa β-catenina, incluindo a forma constitutivamente activa de β-catenina que contém uma mutação Serine37Alanine. Os nossos dados também indicam que a proliferação de linhas LCSC e HCC é inibida por FH535 de uma forma dependente da dose, e que esta está correlacionada com uma diminuição na percentagem de células em fase S. Finalmente, também mostram que a expressão de dois alvos bem caracterizados de β-catenina, ciclina D1 e Survivina, é reduzida por FH535. Tomados em conjunto, estes dados indicam que FH535 tem valor terapêutico potencial no tratamento do cancro do fígado. É importante ressaltar que estes resultados sugerem que esta terapia pode ser eficaz em vários níveis de segmentação tanto HCC e LCSC

Citation:. Gedaly R, Galuppo R, Daily MF, Shah M, Maynard E, Chen C, et al. (2014) Segmentação do Wnt /β-catenina via de sinalização em células-tronco do cancro do fígado e linhas celulares carcinoma hepatocelular com FH535. PLoS ONE 9 (6): e99272. doi: 10.1371 /journal.pone.0099272

editor: Zhiyuan Gong, Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 30 de outubro de 2013; Aceite: 12 de maio de 2014; Publicação: 18 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gedaly et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta publicação foi apoiado pelo número de concessão UL1RR033173 [TL1 RR033172, KL2 RR033171] a partir do Centro Nacional de investigação Recursos (NCRR), DK074816 (BTS) financiado pelo Escritório do Diretor, National Institutes of Health (NIH), e apoiado pelo NIH Roteiro para a investigação médica. Esta pesquisa também foi apoiado pela citometria de fluxo e separação de células de recursos partilhados, da Universidade de Kentucky Markey Cancer Center (P30CA177558). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NCRR e NIH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC), o câncer de fígado mais comum, é o quinto câncer mais comum ea terceira maior causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1] – [2]. O aumento alarmante na incidência de HCC na Europa e na América do Norte nos últimos anos está relacionada, principalmente, à infecção pelo vírus da hepatite C, embora outros fatores, como o consumo excessivo de álcool e obesidade também contribuem para este aumento [3]. A etiologia do HCC é complexo e envolve numerosas alterações genéticas e epi e a perturbação de diversas vias de sinalização, incluindo o /β-catenina Wnt, Ras /Raf /MAPK, PI3K /AKT /mTOR, HGF /c-met, IGF, VEGF e vias de PDGF. Entre estes, a via /β-catenina Wnt é considerado um dos mais difíceis de inibir a [4]. Actualmente, alguns agentes químicos de segmentação da via Wnt /β-catenina ou estão disponíveis sob investigação [5].

A activação da via /β-catenina canónica Wnt envolve a ligação de proteínas Wnt aos receptores celulares de superfície e Frizzled Lrp5 /6 co-receptores. Na ausência de proteínas Wnt, a maior parte do β-catenina celular está ligada a E-caderina sobre a membrana celular. Citosólica β-catenina é constitutivamente fosforilada em resíduos de serina específicos por um complexo enzimático que inclui polipose coli adenomatosa (APC), Axin, e as quinases glicogénio-sintase-quinase-3β (GSK-3β) e a caseína cinase I, marcando-o para ubiquitina-mediada proteólise. Sob estas condições, o TCF /LEF factores de transcrição estão ligados aos seus elementos de reconhecimento de ADN cognatos, juntamente com membros da família de Groucho co-repressores, assegurando o silenciamento transcricional de genes alvo β-catenina. Acoplamento de proteínas Wnt com o receptor Frizzled activa a proteína Dishevelled, resultando na dissociação do complexo destrutiva citosólica e a inibição de GSK-3β. Isto conduz à estabilização e acumulação de citoplasmática β-catenina, que, em seguida, entra no núcleo, se liga a proteínas de TCF /LEF e leva à dissociação subsequente de groucho co-repressores, recrutamento do p300 coactivador e a activação de genes alvo β-catenina [ ,,,0],6] – [9]. Muitos dos alvos β-catenina, incluindo ciclina D1, c-myc e Survivina, promover a progressão do ciclo celular e inibir a apoptose [10] – [12]. Consistente com estes dados, a activação da via /β-catenina Wnt é visto numa variedade de cancros, incluindo carcinoma hepatocelular. activação aberrante da via /β-catenina Wnt tem sido observada em, pelo menos, 1/3 do HCC, e cerca de 20% de HCC apresentam mutações no gene β-catenina. Mais de 50% dos tumores HCC exibir acumulação nuclear de β-catenina indicando que outros factores podem estar envolvidos, como a metilação aberrante da APC supressores de tumor e E-caderina, inactivação de caseína-quinase e de GSK-3β, ou aumento da secreção de ligantes Wnt [4] – [5].

tem havido um crescente interesse no papel das células-tronco de câncer de fígado (LCSC) na tumorigênese, progressão tumoral, invasão e metástases. A teoria de células estaminais cancro sugere que o tumor é composta por uma população heterogénea de células que formam uma hierarquia celulares distintas. Estudos recentes têm fornecido evidências convincentes de que as células que existem em tumores sólidos de muitos tipos, incluindo, cérebro, mama, colo-rectal, fígado, pâncreas e próstata. Em 2006, dois grupos diferentes isolou uma subpopulação CD133 + de linhas de células de carcinoma hepatocelular e descritas superior proliferativa e potencial tumorigénico, de acordo com as propriedades da célula-tronco. CD44 também foi encontrado como um importante marcador utilizado em combinação com outros marcadores de células estaminais para melhor definir o fenótipo da superfície da LCSC. Tem sido demonstrado que as células CD133 + e CD90 + que co-expressam CD44 + são mais agressivos do que os que expressam CD133 ou CD90 sozinho [13] – [14]

Os agentes químicos utilizados para direccionar Wnt- via /β-catenina. estão nos níveis do fator de membrana, citoplasma e transcrição [5]. O agente molecular pequeno FH535 é um inibidor duplo de PPAR (PPAR) e β-catenina /TCF /LEF. FH535 foi demonstrado inibir a proliferação de linhas de células CHC e hepatoblastoma e a sua especificidade na inibição de actividade β-catenina /TCF /LEF foi ilustrado na linha celular de hepatoblastoma HepG2 [15].

O objectivo deste estudo foi para determinar se FH535 pode inibir a ativação de genes β-catenina-regulado por β-catenina endógeno e ectopicamente expressa nas linhas celulares de carcinoma hepatocelular Huh7, Hep3B e PLC e células-tronco do câncer de fígado (LCSC). A especificidade de FH535 na inibição da β-catenina através da activação TCF /LEF foi ensaiada em repórter duplo de luciferase transfectados em LCSC e em células de carcinoma hepatocelular. Proliferação, ciclo celular, e outros alvo genes e proteínas foram analisadas.

Materiais e Métodos

2.1 celular cultura

A linha de células de carcinoma hepatocelular Huh7 [16] foi um presente de Dr. Guangxiang Luo (University of Alabama – Birmingham). As linhas celulares de carcinoma hepatocelular Hep3B e PLC foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). Hep3B e PLC ambos expressam o antígeno de superfície HBV, e Huh7 expressam antígeno da hepatite delta. O Hep3B é p53 negativo, o PLC reduziu a expressão da p53, e Huh7 aumentou o nível de proteína p53 [17] – [18]. Estas linhas de células foram cultivadas em Eagles de Dulbecco modificado (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina e penicilina /estreptomicina. As células-tronco de câncer de fígado (LCSC; Catalog # 36116-43, CelProgen, San Pedro, CA, EUA) foram expandidas até e utilizados nas primeiras 4 passagens em CelProgen meio de crescimento completo com 10% FBS na matriz extra-celular (ECM ) frascos revestidos (CelProgen). A citometria de fluxo e tumorigenicidade perfil do LCSC são mostrados nas Figuras S1 e S2. Outras linhas de células foram cultivadas em mercadorias plásticos padrão sem revestimento de ECM. As células foram cultivadas em incubadora NuAire (Plymouth, MI, EUA) a 37 ° C com 5% de CO

2.

2.2 Chemicals

FH535, XAV939 e LiCl foram adquiridos da Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Metil-

3H-timidina (2 Ci /mM) foi de MP Biomedicals (Costa Mesa, CA, EUA). Os X-Treme Gene 9 e Turbofect reagentes de transfecção foram de Roche (Indianapolis, IN, EUA) e Thermo Scientific (Waltham, MA, EUA), respectivamente. O kit de análise à base de iodeto de propídio ciclo celular foi de GenScript (Piscataway, NJ, EUA). Todos os outros produtos químicos eram da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

2,3 plasmídeos

O gene repórter de luciferase TOPFlash, que contem 3 cópias de um site /ABL ligação TCF , e repórter de luciferase FOPFlash, idêntico ao TOPFlash excepto os locais TCF /LEF ter sido mutada, foram adquiridos a Addgene (Cambridge, MA, EUA) [19]. A luciferase de Renilla vector pRL foi da Promega (Madison, WI, EUA). Os vectores de expressão para o tipo selvagem β-catenina e βCatS37A foram fornecidos por S. Byers [20] e E3-pGL3, contendo rato alfa-fetoproteína potenciador E3 fundido com pGL3-promotor, foi descrito anteriormente [21].

2,4

3H-timidina ensaio de incorporação

Este ensaio foi realizado como descrito anteriormente pelo nosso método publicado e por outros investigadores [22] – [24]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a 1,000-5000 células /poço em 0,2 mL de DMEM + FBS a 10% e tratou-se em duplicado com concentrações diferentes de FH535 durante 72 h. As células foram pulsadas com

3H-timidina a 1 uCi /poço, durante 4 h. Alternativamente, as células foram cultivadas a 2500 células /poço em 0,1 ml de meio durante 24 h, seguido da adição simultânea de FH535 (0-15 uM) e

3H-timidina (1 uCi /cavidade) a um volume final de 0,2 ml /poço., seguido por incubação durante mais 18 horas. Em ambas as situações, no final da incubação, as células foram lavadas e fixadas em 0,3 ml de ácido tricloroacético a 10% (TCA) durante 12 min. Após a aspiração de TCA, as células foram lisadas em NaOH 0,2 M /SDS a 0,2% durante 40 min.

incorporação de 3H-timidina foi medida por contagem de cintilação num Packard de cintilação Analyzer (Covina, CA, EUA). Não realizamos ensaio de MTT para a proliferação celular para comparar com

3H-timidina, porque não é a reação de cor entre FH535 e do reagente de ensaio MTT (azul de tiazolilo brometo de tetrazólio). A concentração de FH535 para causar uma inibição de 50% das células cultivadas (IC

50) foi determinada pelo método seguinte. N-droga de dados foi utilizado como 100% no eixo Y, e a partir desta foi determinada uma inibição de 50% no eixo Y. A partir do ponto de valor de 50%, que desenhar uma linha paralela ao eixo X (o eixo de concentração de fármaco) para identificar o ponto de cruzamento na curva de concentração. Do ponto cruz, desenhar uma linha paralela ao eixo Y, e encontrar o ponto de cruz no eixo-X. Este ponto cruz no eixo X é o IC

50 pontos. Todos os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes.

2.5 transitórios Transfec�es e dual luciferase Ensaios

Para transfecções, Huh7, PLC e LCSC foram semeadas a 3 × 10

5 células /poço em 1 ml de meio de cultura em placas de 12 poços; Após 24 horas, as células foram co-transfectadas com vectores de TOPFlash /PRL (proporção ADN 10:1) ou vectores FOPFlash /PRL (proporção ADN 10:1) utilizando Gene X-treme 9 (Roche, Indianapolis, IN, EUA) de reagente de transfecção seguindo as instruções do fabricante. Após 6 h, o meio foi aspirado e as células foram adicionadas com 1 ml de meio de cultura contendo diferentes concentrações de FH535, apenas DMSO (veículo), e /ou de LiCl 10 mM. Em todos os casos, a concentração final de DMSO foi de 0,08%. A quantidade de veículo de DMSO foi mantida constante em tratamentos com medicamentos e a concentração final de DMSO em cada tratamento era a mesma e foi concebido para menos do que 0,1%. Depois de 36 h, os ensaios de luciferase dupla foram realizadas com o Sistema de Ensaio de Luciferase Duplo Promega (Madison, WI, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. A actividade de luciferase foi medida no Lumat LB 9507 luminómetro (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, EUA). Resumidamente, as células foram lavadas uma vez com PBS estéril, e lisadas em 1 × tampão de lise (Promega) (0,25 ml /poço) durante 15 min à temperatura ambiente. Dez ul de lisado celular em bruto (preparada de acordo com Promega Protocol) foi adicionado a 50 ul de substrato larii ensaio de luciferase num tubo de poliestireno de 12 x 75 mm (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) para medir a actividade da luciferase do pirilampo, seguido pela adição de 50 ul de substrato Stop and Glow para medir a actividade da luciferase de Renilla. A actividade da luciferase Renilla medida foi utilizada para normalizar a actividade da luciferase do pirilampo medido.

Para a co-transfecções com vectores de expressão β-catenina, as células foram plaqueadas a 1 x 10

5 células /cavidade em 24 cavidades pratos. As células foram transfectadas com 340 ng de luciferase do plasmídeo repórter, 170 ng β-catenina plasmídeo de expressão, e 10 ng de pRL /poço usando o reagente de transfecção Turbofect (Pittsburg, PA, EUA). Após 5-6 h, adicionou-FH535 (ou controlo de veículo de DMSO). Após um adicional de 36 h, foram preparados extractos celulares (preparados de acordo com o protocolo da Promega) e utilizadas imediatamente ou armazenadas a -80 ° C. Todas as transfecções foram realizadas em duplicata e repetido pelo menos duas vezes. Os ensaios de luciferase foram realizadas com extractos de células utilizando o ensaio de luciferase Dual System (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. A actividade de luciferase foi medida em duplicado.

ciclo

2,6 celular análise

células Huh7 foram cultivadas em DMEM + 10% FBS durante 24 h. As células foram lavadas com DMEM isento de soro, em seguida, 3 vezes, cultivadas em DMEM + FBS a 0,1% durante 24 h para a sincronização das células. As células foram então cultivadas em DMEM + 10% de FBS com diferentes concentrações de FH535 durante 24 h. As células foram colhidas e coradas com iodeto de propídio (PI) e analisadas por citometria de fluxo de acordo com o protocolo GenScript. LCSC foram cultivadas em meio de crescimento completo CelProgen e tratada da mesma forma como indicado acima.

2.7 RT-PCR e análise de Western

RT-PCR.

As células foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS em pratos de cultura de tecido de 100 mm até ~ 70% de confluência e, em seguida, tratada com DMSO por si só ou concentrações crescentes de FH535 em DMSO durante 38 h. Para a análise de ARN, as células foram colhidas e o ADNc foi preparado tal como descrito [21]. Quantitative PCR foi realizada com SYBR Green usando o termociclador Bio-Rad MyiQ térmica com os seguintes iniciadores: Survivina (BIRC5, CAAGGAGCTGGAAGGCTGG e GTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCC), ciclina D1 (CCND1: GGATGCTGGAGGTCTGCGA e TAGAGGCCACGAACATGCAAGT), e β2-microglobulina (B2M: GACTTTGTCACAGCCCAAGATAG e TCCAATCCAAATGCGGCATCTTC ).

Western Blot.

células Huh7 (5 × 10

5) foram cultivados em DMEM + 10% de FBS em pratos de cultura de tecido de 100 mm durante 72 h. Após mudança com meio fresco, as células foram tratadas com 0, 2,5, 5, e 10 uM de FH535 por 38 h. DMSO ( 0,1%) foram utilizadas como controlo do veículo. As concentrações de proteína dos extractos celulares foram ensaiados com o kit de micro-ensaio da proteína BCA de acordo com o protocolo do fornecedor (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, EUA). Os anticorpos específicos foram obtidas a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Western Blot densidade da banda foi analisada com o software ImageJ NIH (Bethesda, Maryland, EUA), e normalizada por β-actina. Todos os outros procedimentos foram realizados como descrito anteriormente [25].

2.8 estatística A análise

Todas as análises foram realizadas utilizando o software SPSS versão 20 (International Business Machines Corporation, Endicott, Nova Iorque, EUA) . Os dados são apresentados como média ± SE. One-way ANOVA seguido pela correção de Tukey foi utilizado para comparar as médias. O nível de significância estatística foi estabelecido em

p

. 0,05

Resultados

3.1 FH535 inibe a activação da transcrição mediada pelo tipo selvagem e β-catenina constitutivamente activa

FH535 foi mostrado para bloquear a sinalização através endógena β-catenina em várias linhas de células, incluindo a linha celular HepG2 do hepatoblastoma [15]. Para explorar ainda mais este regulamento e para testar se FH535 poderia bloquear ectópica β-catenina, co-transfecções com vectores de expressão de β-catenina e o vector repórter luciferase dependente de TCF4 TOPFlash foram realizados nas linhas de células de carcinoma hepatocelular humano Huh7 e Hep3B (Fig. 1 ). Em ambas as linhas celulares, de tipo selvagem, vector de expressão β-catenina co-transfectadas aumentou a actividade de luciferase a partir de TOPFlash quase 15 vezes comparado a células co-transfectadas com o vector de controlo vazio (E.V.). Este aumento β-dependente-catenina foi inibida por FH535 de uma forma dependente da dose. β-catenina é frequentemente mutado em vários cancros, incluindo o HCC. Uma mutação natural muda a serina na posição 37; esta forma alterada de β-catenina é resistente à degradação pela APC do complexo e, portanto, tem uma estabilidade mais elevada. Para testar se esta forma de forma activada de β-catenina também pode ser bloqueada por FH535, um vector de expressão para βCatS37A, em que a serina na posição 37 foi alterado para uma alanina, foi co-transfectada com TOPFlash. Como esperado, a transactivação mediada por βCatS37A de TOPFlash foi significativamente mais elevada do que a transactivação de tipo selvagem por β-catenina. No entanto, em ambas as linhas celulares, a transactivação mediada por βCatS37A foi significativamente inibida por FH535. Como controlos, as células foram também co-transfectadas com FOPFlash, que é idêntico ao TOPFlash excepto que os locais de TCF4 ter sido mutado e, por conseguinte, não responsivo a p-catenina; FOPFlash não foi activado pelo do tipo selvagem β-catenina ou βCatS37A como mostrado na Figura 1.

Huh7 (Painel A) e células Hep3B (Painel B) de carcinoma hepatocelular foram transfectadas com os genes repórter de luciferase TOPFlash (painéis esquerdos) , que contém três locais de ligação TCF, ou E3-pGL3 (painéis da direita), que contém o AFP elemento potenciador E3 que possui um local de TCF altamente conservada. As células foram adicionalmente co-transf ectadas com um vector de expressão que continha sem inserto (controlo de vector vazio, E.V.), do tipo selvagem β-catenina (β-catenina), ou de uma forma constitutivamente activa de β-catenina (βcatS37A). Luciferase de Renilla foi usada para controlar as variações de eficiência de transfecção. Seis horas após a adição do ADN, as células foram tratadas com DMSO por si só (sem tratamento) ou de quantidades crescentes de FH535. Após 48 horas, foram determinados níveis de luciferase; Firefly luciferase foi normalizada para Renilla. Em ambas as linhas celulares, a activação FH535 inibida β-catenina-dependente de genes alvo. *

P Art 0,05. O experimento foi feito duas vezes com resultados semelhantes.

TOPFlash contém três motivos de ligação consenso TCF4 que conferem capacidade de resposta aos beta-catenina. Para testar se FH535 também poderia bloquear transactivação β-catenina-mediada de um motivo TCF4 no contexto de uma região reguladora natural, co-transfecções foram realizadas com pGL3-E3. E3 é um fragmento ~340 pb que contém alfa-fetoproteína (AFP) E3 elemento potenciador, um dos três intensificadores que controlam a expressão hepática do gene da AFP do rato. E3 contém sítios de ligação para vários fatores, incluindo Foxa /HNF6, C /EBP, receptores nucleares órfãos e TCF4 [26] – [27]. Recentemente, mostrou que este intensificador é regulada por p-catenina em células de ratinhos transgénicos e [21]. E3-pGL3 foi transactivado por β-catenina e a uma maior extensão por βCatS37A (Fig. 1). No entanto, este transactivação por tanto de tipo selvagem e as formas de S37A β-catenina foi bloqueada por FH535 de uma forma dependente da dose.

3,2 FH535 inibe β-catenina mediada por activação de transcrição em LCSC

estudos anteriores demonstraram que a sinalização β-catenina é elevada em células positivas EpCAM com propriedades LCSC [28]. Nós anteriormente descrito que CD133 +, CD44 +, CD24 + LCSC formar agressivamente tumores quando pequenos números destas células são injectados em ratinhos nus [29]. Para testar a capacidade de FH535 para inibir β-catenina nestes LCSCs, transfecções transientes foram realizadas com TOPFlash. Como controlos, TOPFlash também foi transfectado para as linhas celulares de carcinoma hepatocelular Huh7 e PLC (Fig. 2). Em todas as três populações, células não tratadas exibiram níveis baixos de luciferase. Quando tratado com o inibidor de GSK-3β LiCl, o que leva a activação β-catenina endógeno [30], actividade TOPFlash aumentou dramaticamente. FH535 bloqueou eficazmente a activação mediada por LiCl da TOPFlash de uma forma dependente da dose. Curiosamente, esta inibição foi mais robusta em LCSC do que em qualquer das linhas de células CHC. Como um controlo, também transfecções foram realizadas com FOPFlash, que já não é responsiva a p-catenina. Como esperado, a actividade da luciferase em células transfectadas foi FOPFlash nem aumentou nem inibiu LiCl por FH535.

LCSC células (painel da esquerda), Huh7 (painel do meio) e HPLC (painel direito) foram co-transfectadas com TOPFlash ou FOPFlash genes repórter de luciferase, juntamente com luciferase de Renilla. Após 6 horas, as células foram deixadas sem tratamento (sem tratamento) ou tratados com LiCl sozinho ou LiCl com quantidades crescentes de FH535. LiCl é um activador conhecido de β-catenina. Após um período adicional de 36 horas, as células foram colhidas e os níveis de luciferase foram determinadas; Firefly luciferase foi normalizada para Renilla. TOPFlash actividade foi altamente induzida em todas as três populações de células; esta activação foi inibida por FH535. O FOPFlash controle negativo apresentou resposta mínima para LiCl ou FH535. inibição TOPFlash por FH535 era mais robusto em LCSC do que em qualquer linha de células de carcinoma hepatocelular. *

P Art 0,003, # P 0,001. A experiência foi realizada duas vezes com resultados semelhantes.

3,3 FH535 inibe a proliferação de linhas celulares de carcinoma hepatocelular e LCSC

Numerosos estudos demonstraram que β-catenina desempenha um papel importante na proliferação durante a operação normal desenvolvimento e na transformação celular em muitos tecidos, incluindo o fígado. desenvolvimento do fígado é diminuída, na ausência de β-catenina, e mutações que activam a via β-catenina encontram-se em cerca de 1/3 do HCC [4] – [5]. Além disso, o crescimento de células do fígado de adulto tronco progenitoras (células ovais) pode ser inibida através do bloqueio da via de β-catenina. Desde que os nossos dados indicam que FH535 pode bloquear a activação da transcrição β-catenina-mediada, nós também testou se a proliferação de linhas de células LCSC e HCC foi afetada por este composto. LCSC foram cultivadas na presença de 10% ou 1% de soro e com entre 5 uM e 30 uM FH535 durante 72 horas, e a proliferação das células foi monitorizada por

incorporação de 3H-timidina (Figs. 3A e 3B, respectivamente). Proliferação diminuiu com quantidades crescentes de FH535, com uma redução mais dramática observada em células cultivadas na presença de soro inferior; a concentração de FH535 para causar uma inibição de 50% das células cultivadas (IC

50) foi de 13,8 uM para células crescidas em soro a 10% e 5,1 uM para células cultivadas em soro de 1%. Esta inibição foi mais potente do que a observada com XAV939 (IC

50 = 55? M), que inibe tankyrase, estabilizando assim axina e promovendo a degradação β-catenina (Fig. 3C) [31]. FH535 também bloqueou a proliferação de células de carcinoma hepatocelular, em concentrações que foram semelhantes ao observado com LCSC (IC

50 de 10,9 uM, 9,25 uM e 6,6 uM para Huh7, PLC e Hep3B, respectivamente; Fig.3D). Para confirmar que FH535 de facto a proliferação das células inibidas e não conduzir a um aumento da morte celular, e FH535

3H-timidina foram adicionados simultaneamente às células Huh7, que foram em seguida cultivadas durante 18 h. Neste cenário, observou-se uma inibição significativa da proliferação de 2,5, 5, 10 e 15 uM de tratamento FH535, em comparação com o controlo (p 0,05, n = 6), com FH535 a 15 uM causando uma inibição de 41% (Figura S3 ). Estes dados indicam que FH535 é a inibição da proliferação de células em vez de aumentar a morte celular.

As células foram semeadas em placas de 96 poços em 0,2 ml de meio, como descrito abaixo, durante 72 horas, seguido pela adição de

3H -timidina a 1 ^ Ci /cavidade durante 4 horas. A incorporação de

3H-timidina foi determinada por contagem de cintilação. Nos painéis A, B e D, a concentração final de DMSO em cada cavidade foi de 0,05%; o painel C, a concentração final de DMSO em cada cavidade foi de 0,1%. (

a

LCSCs) foram plaqueadas a 1000 células /poço em DMEM com 10% de FBS sozinho, juntamente com DMSO ou com quantidades crescentes de FH535. (

B

). LCSCs foram plaqueadas a 5000 células /poço em DMEM com FBS a 1% com DMSO por si só ou com concentrações crescentes de FH535. (

C

). LCSCs foram plaqueadas em DMEM com FBS a 10% a 1000 células /poço com DMSO por si só ou concentrações crescentes de XAV939. (

D

). células Huh7, Hep3B e PLC foram plaqueadas em DMEM com FBS a 10% a 1000, 2500, e 5000 células /poço, respectivamente, apenas com DMSO ou concentrações crescentes de FH535.

valores P Quais são para todas as três linhas de células tratadas com FH535 são comparados aos controles. O experimento foi feito duas vezes com resultados semelhantes.

3.4 FH535 induz a paragem do ciclo celular na linhagem celular HCC Huh7 e LCSC

A capacidade de FH535 para inibir a proliferação celular nos levou a investigar a distribuição do ciclo celular a seguir ao tratamento. células Huh7 foram sincronizadas por crescimento em 0,1% de FBS durante 24 horas e, em seguida, cultivadas na presença de FBS a 10% e com nenhuma ou FH535 FH535 a 7,5 uM e 15 uM. Após 24 horas, as células foram colhidas e o teor de ADN foi analisado por coloração com iodeto de propídio. Na presença de FH535, houve um aumento estatisticamente significativo no número de células em G0 /G1 e uma correspondente diminuição da percentagem de células na fase S em comparação com células que cresceram na ausência de FH535 (Fig. 4A). O número de células em G2 não foi significativamente alterada pela FH535. Além disso, não houve pico sub-G1 detectada por citometria de fluxo, o que indica que não foi FH535 promovendo apoptose nas concentrações de ser utilizado (ver Figura S4). Nós também fizemos a análise do ciclo celular em LCSC após o tratamento FH535 e encontrou FH535 em 15 mM causados ​​significativamente prisão fase G1 em LCSC (P = 0,012). FH535 também reduziu significativamente a fase G2 /M no LCSC após 24 h de 7,5 uM e 15 uM tratamento FH535 (P = 0,038 e P 0,001, respectivamente), não se observou nenhuma inibição significativa da fase S em LCSC (p = 0,446) (Fig. 4B.). Nossos dados são semelhantes aos resultados publicados anteriormente e reflete regulação β-catenina de ciclo celular é diferente em diferentes tipos de células [32] – [33]. reguladores do ciclo celular (ciclinas, CDK e reguladores) pode variar em diferentes tipos de células, o que pode levar a diferentes respostas após tratamento FH535. Isto pode vale a pena explorar em nosso estudo futuro.

A. células Huh7 foram cultivadas em DMEM + 10% FBS durante 24 h. As células foram lavadas com DMEM isento de soro, em seguida, 3 vezes, cultivadas em DMEM + FBS a 0,1% durante 24 h para sincronização celular. As células foram então cultivadas em DMEM + FBS a 10%, juntamente com diferentes concentrações de FH535 durante 24 h. As células foram colhidas e coradas com iodeto de propídio (PI) e analisadas por citometria de fluxo de acordo com o protocolo GenScript (Piscataway, NJ, EUA). O tratamento com FH535 aumentou a percentagem de células em G1 e diminuiu a percentagem de células em fase S. A experiência foi realizada duas vezes com resultados semelhantes. células B. LCSC foram cultivadas em meio de cultura completo LCSC CelProgen durante 24 h. As células foram então lavadas com meio isento de soro CelProgen 3 vezes e cultivadas em CelProgen Médio + 0,1% de FBS durante 24 h para a sincronização das células. As células foram, em seguida, voltou a CelProgen Meio Completo + 10% de FBS com diferentes concentrações de FH535 durante 24 h. ciclo celular foi ensaiada como descrito acima por Huh7.

3.5 Expressão de genes alvo β-catenina de ciclina D1 e Survivina é inibida por FH535

controlos

p-catenina proliferação e sobrevivência celular pela regulando a expressão de numerosos genes alvos. Dois alvos bem estabelecidas são os genes que codificam survivina (Birc5) e ciclina D1 (CCND1). Survivina é uma proteína anti-apoptótica que também regula a progressão através da mitose [34]; Ciclina D1 controla a proliferação ativando o G1 quinases cdk4 e cdk6 [35]. Survivina e ciclina D1 transcrição são regulados através de elementos TCF em suas regiões promotoras [36]. Para testar se FH535 inibe a expressão destes dois genes alvo β-catenina, em tempo real de RT-PCR foi realizada com células de carcinoma hepatocelular LCSC e que foram tratadas com quantidades crescentes de FH535. níveis de ciclina D1 e ARNm de survivina foram reduzidos por FH535 em todas as três populações de células de um modo dependente da dose (Fig. 5). Para confirmar que esta redução nos níveis de mRNA conduziu também a níveis mais baixos de proteína, análise de Western foi realizada usando extractos de células inteiras a partir de células Huh7. Ambos os níveis de proteína ciclina D1 e survivina foram reduzidos de uma forma dose-dependente, com a maior redução observada na presença de 10 uM FH535 (Fig. 6). A análise densitométrica indicou que FH535 aos 5 e 10 uM inibido Ciclina D1 28% e 64%, respectivamente; FH535 aos 5 e 10 uM inibiu a sobrevivência de 24% e 48%, respectivamente (Fig. 6).

LCSCs, as células Huh7 e Hep3B foram tratadas apenas com DMSO ou concentrações crescentes de FH535 para 38-PCR em tempo para a expressão de A ciclina D1 (painel A) ou Survivina (Painel B). Em ambos os casos, os níveis de ARNm foram representados graficamente em relação ao p

2-microglobulina. A experiência foi realizada duas vezes com resultados semelhantes.

células Huh7 foram tratadas apenas com DMSO ou uma quantidade crescente de FH535 para 38-PAGE e transferidas para análise de Western com anticorpos contra ciclina D1, Survivina, e β actina. A parte superior da mostra a imagem western blot; o gráfico inferior mostra a análise densitométrica dos dados ocidentais. Esta análise densitométrica indicou que FH535 a 5 e 10 uM inibiu os níveis de proteínas Ciclina D1 28% e 64%, respectivamente; FH535 aos 5 e 10 uM inibiu os níveis de proteínas survivina 24% e 48%, respectivamente. O experimento foi feito duas vezes com resultados semelhantes.

Discussão

Nos últimos anos, inúmeras vias de sinalização têm sido implicados na carcinogênese hepática. A via β-catenina é essencial em células-tronco para a auto-renovação e manutenção das propriedades da célula-tronco. Perturbação desse equilíbrio resulta em ambas as alterações genéticas e epigenéticas, encontrado em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de cólon e HCC [4]. Neste estudo, utilizou-FH535 como um inibidor da via β-catenina. Este composto foi usado anteriormente para inibir a expressão β-catenina em células de cólon e pulmão, bem como em células de hepatoblastoma e HCC [15]. Neste relatório, os autores concluíram que FH535 era tóxico para um número de linhas de células, incluindo Huh7.