Humana

Abstract

The Hedgehog (HH) via de sinalização é fundamental para o desenvolvimento embrionário normal, padrões de tecido e diferenciação celular. sinalização de Hh aberrante está envolvido em vários cancros humanos. sinalização de Hh envolve uma cascata de multi-proteína de activação as proteínas GLI que regulam a transcrição de genes alvo HH. Descrevemos previamente que a sinalização de Hh é essencial para a sobrevivência de células de cancro do cólon humano e a inibição deste sinal induz danos no ADN e morte celular extensa. Aqui mostramos que o eixo HH /GLI regula telomerase humana transcriptase reversa (hTERT), que determina o potencial de replicação de células cancerosas. Supressão das funções de GLI1 /Gli2 por um mutante C-terminal truncado Gli3 repressor (GLI3R), ou por GANT61, um inibidor farmacológico de GLI1 /Gli2, reduziu a expressão da proteína hTERT em cancro do cólon humano, o cancro da próstata e glioblastoma multiforme linhas celulares (GBM) . Expressão de uma N-terminal suprimido mutante constitutivamente activa de Gli2 (GLI2ΔN) aumentou mRNA hTERT e expressão da proteína e promotor hTERT impulsionado a actividade de luciferase em células cancerígenas do cólon humano, enquanto GANT61 inibiu a expressão do mRNA hTERT e da atividade luciferase promotor hTERT conduzido. cromatina imunoprecipitação com anticorpos GLI1 ou Gli2 precipitado fragmentos do promotor hTERT nas células cancerígenas do cólon humano, que foi reduzido após a exposição a GANT61. Em contraste, a expressão de GLI1 ou GLI2ΔN em células 293T não malignas não conseguiu alterar os níveis de ARNm da hTERT e a proteína, ou actividade de luciferase dirigido do promotor hTERT. Além disso, a expressão de GLI2ΔN aumentou a actividade da enzima telomerase, que foi reduzido pela administração GANT61 no cancro humano do cólon, cancro da próstata, e células GBM. Estes resultados identificam hTERT como um alvo directo da via de sinalização de Hh, e revelam um papel anteriormente desconhecido do eixo HH /GLI na regulação do potencial de replicação de células cancerosas. Estas descobertas são de importância na compreensão dos mecanismos reguladores importantes que determinam as funções de HH de sinalização /GLI em células cancerosas

Citation:. Mazumdar T, Sandhu R, Qadan M, Devecchio J, Magloire V, Agyeman A, et ai. (2013) Hedgehog sinalização Regula telomerase transcriptase reversa em células cancerosas humanas. PLoS ONE 8 (9): e75253. doi: 10.1371 /journal.pone.0075253

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de março de 2013; Aceito: 13 de agosto de 2013; Publicação: 25 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mazumdar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores gostaria de agradecer o apoio financeiro da concessão do NCI SR1 CA 87952 (JAH), e da Cleveland Clinic. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sinalização HH Classical inicia quando os ligantes HH solúveis, sonic (SHH), Desert (DHH) ou indiano (IHH) HH ligar o seu receptor transmembranar Patched (Ptch), libertando assim a proteína transmembranar, a Smoothened (Smo) a partir da inibição Ptch-mediada. Smo subsequentemente ativa a família GLI de fatores de transcrição que regulam genes alvo HH. A família GLI de fatores de transcrição inclui GLI1, Gli2 e Gli3. Em virtude de um activador do C-terminal e domínios repressores N-terminais, Gli2 e Gli3 tem activador dependente do contexto ou a actividade do repressor. GLI1 não possui o domínio repressor e funções predominantemente como um activador [1], [2]. Gli2 tem um activador do C-terminal e domínios repressores de terminal-N [3]. Gli2 é relatado para ser o mediador inicial de HH sinalização eventos, que, em seguida, induz a expressão GLI1, o que aumenta ainda mais a expressão do gene alvo HH [4]. Quando a via de sinalização de Hh é activo, as proteínas citoplasmáticas GLI latentes translocar para o núcleo, onde se ligam os elementos GACCACCCA-no como os promotores dos genes de HH-alvo [5], [6]. sinalização de Hh regula a eventos celulares através da modulação de genes alvo específicos. Durante o desenvolvimento embrionário normal, actividade de sinalização HH é essencial, sendo regulados espacialmente e temporalmente resultando em padrões de tecido normal e diferenciação. sinalização de Hh Coordenado também está envolvida na proliferação celular e sobrevivência, manutenção de stemness e determinação do destino das células [6]. Aberrante sinalização HH activado está envolvido em vários cancros humanos e regula a proliferação do câncer celular, sobrevivência, as funções das células-tronco do câncer, epitelial para mesenquimal e metástase [6]. Nós relataram que a sinalização HH é crítica para a sobrevivência de células de cancro do cólon humano, enquanto que o bloqueio desses sinais induz danos no ADN rápida, culminando em grande citotoxicidade [7], [8], [9], [10]. potencial de reprodução ilimitada de células cancerosas está intimamente associada com a sobrevivência das células do câncer, no entanto, o papel de HH sinalização no potencial de replicação das células cancerosas não é conhecido.

potencial de replicação de células somáticas humanas é limitada por estruturas heterocromáticas especiais conhecido como telómeros nas extremidades dos cromossomas lineares [11]. telómeros de mamíferos são constituídos por repetições em série de sequências TTAGGG que são submetidas a redução com cada ciclo de replicação de ADN [12]. As polimerases de ADN convencionais não são capazes de replicar completamente as extremidades das moléculas lineares de ADN; Assim, é esperado ADN telomérico para encurtar com cada ciclo de replicação de ADN. telomeres criticamente encurtados não conseguem proteger as extremidades cromossômicas, resultando em parada de crescimento irreversível e longevidade celular limitada. Assim, a homeostase dos telómeros é crítico para a proliferação e sobrevivência celular. A telomerase, uma ribonucleoproteína composta por um componente de ARN (RT) e uma subunidade catalítica da transcriptase reversa (TERT), repõe as repetições telómeros e, consequentemente, regula celular potencial replicativo [13]. Na maioria das células adultas, TR é constitutivamente presente, mas a expressão TERT é reprimida, resultando na proliferação limitado potencial e celular tempo de vida [14], [15]. Em células, tais como células estaminais e as células cancerosas proliferam activamente, TERT expressão é regulada positivamente, resultando em potencial replicativo ilimitado e imortalidade destas células [16]. TERT humana expressão e atividade (hTERT) foi evidenciada em 75% das células de câncer colorretal humanos, mas apenas 3-15% da mucosa normal e que cercam as células não-cancerosas [17]. Em conjunto com a sua importância para a sobrevivência da célula cancerosa, hTERT é rigorosamente regulamentada com vários ativadores e repressores, dos quais vários foram identificados.

Aqui demonstramos pela primeira vez que HH sinalização regula positivamente trancriptionally hTERT. Supressão de GLI1 /Gli2 reduziu os níveis de proteína hTERT nas células do cólon, próstata e câncer de cérebro humano. A sobre-expressão de GLI2ΔN aumentou os níveis de ARNm da hTERT, proteína e hTERT-driven promotor de luciferase (luc) actividade em células cancerígenas do cólon. Bloqueio GLI1 2 /atividade reduzida expressão de mRNA hTERT e da interação direta entre GLI1 proteínas /Gli2 e do promotor hTERT nas células cancerígenas do cólon humano. Em contraste, a expressão GLI1 /GLI2ΔN em células 293T não cancerosas não alterou os níveis de ARNm da hTERT, a actividade do promotor-Luc ou proteína hTERT. Revoga a sinalização de Hh em células cancerosas diminuiu a actividade de telomerase, que foi aumentada pela expressão GLI2ΔN. Estes resultados demonstram hTERT ser um alvo transcricional da via de sinalização de Hh e identificar um papel anteriormente desconhecido do eixo HH /GLI na regulação do potencial de replicação de células cancerosas. Estes resultados revelam uma nova função de sinalização de Hh em aumentar a capacidade replicativa das células cancerosas. De interesse, sinalização de Hh regula hTERT de um modo dependente do contexto em células cancerosas humanas, em contraste com células não-malignas, o que pode ter implicações na terapêutica do cancro.

Materiais e Métodos

celular cultura e Reagentes

HT29, SW480, células HCT-116 e 293T foram obtidas da American Type Culture Collection. C4-2, DU145 e PC3 células foram presentes amáveis ​​do Dr. Alexandru Almasan (Cleveland Clinic, OH). células U87 foram um presente tipo de Dr. Candece Gladson (Cleveland Clinic, OH). As células foram rotineiramente verificados por análise microscópica da morfologia celular, características de crescimento, e resposta a agentes citotóxicos [anexina V /iodeto de propídio (PI) a coloração]. perfis de genes de cDNA microarray também eram característicos e as células foram verificados duas vezes por ano para ser livre de micoplasma. HT29, HCT116, SW480, C4-2, DU145 e PC3 células foram mantidas em meio RPMI 10% FBS suplementado, enquanto as células U87 e 293T foram mantidas em 10% de DMEM suplementado com FBS. As células foram tripsinizadas e contadas utilizando um contador de partículas Coulter Z2 e analisador de tamanho (Beckman Coulter). Para análise de Western, de anticorpos contra HSP90α /β foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology; Os anticorpos anti-anti-hTERT GLI1 e eram de Novus Biologicals, e anticorpo anti-Gli2 foi de Cell Signaling Technology. Anti-c-myc o anticorpo (9E10) foi obtido a partir do hibridoma Core, Lerner Research Institute. GANT61 foi comprada a Calbiochem. Dr. Graham W. Neill (Queen Mary University of London, UK) gentilmente cedido o GLI1 e plasmídeos GLI2ΔN em pBabe-Puro (PBP) vector de expressão de mamífero. Full-length hTERT-PBP plasmídeo foi um presente do Dr. Robert Weinberg (Addgene plasmídeo # 1771).

Análise Western Blot

Total de lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão de lise RIPA (Cell Signaling Technology ). A proteína (60 ug) foi resolvido em 10% ou 5% de gel de SDS-PAGE. As proteínas separadas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno e, subsequentemente, bloqueadas em tampão de bloqueio [5% de leite desnatado seco em 1X tampão de Tris salina com 0,1% de Tween 20 (TBS-T)] durante 1 hora. As membranas foram lavadas em 1X TBS-T, incubaram-se com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, lavadas e incubadas com anticorpo secundário durante 1 hora, e, finalmente, desenvolveu usando substrato Super Signal Pico de Pierce Biotechnology.

Isolamento de ARN e Análise ARNm

o ARN total foi isolado utilizando o Qiagen RNeasy Mini kit de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total foi convertido em ADNc utilizando iniciadores aleatórios (estojo de síntese de ADNc iScript Select; BIO-RAD), e utilizados para análise de expressão de ARNm em tempo real, utilizando 40 ciclos de instrumentação e software Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Os iniciadores foram concebidos utilizando o NCBI /Primer-BLAST e usadas para gerar os produtos de PCR. Os GLI1, Gli2 e GAPDH iniciadores foram previamente descritos [9]

hTERT iniciador directo:. 5′-CCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3 ‘.

hTERT iniciador inverso: 5′-CAGCCTTGAAGCCGCGGTTGA-3′.

GLI3R e

O etiquetado-myc C-terminal suprimido GLI3R construção transitórios transfec�es

(oferta do Dr. Ariel Ruiz i Altaba, Universidade de Genebra Medical School, Genebra, Suíça) foi previamente descrita (3). células HT29 foram transitoriamente transfectadas utilizando Lipofectamine 2000.

(Invitrogen) com GLI3R ou o vazio vector pCS2-MT (oferecida por Dr. David Turner, em The Molecular Behavioral Neuroscience Institute, da Universidade de Michigan, Ann Arbor , MI). As células foram utilizadas para as experiências 24 horas, 48 ​​horas ou 72 horas após transfecção.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) Análise

As células tratadas com GANT61 (20 mM), durante 24 horas foram reticulado em formaldeído a 1% /PBS, 10 min, 37 ° C, que foi arquivado em glicina, 5 min. As células foram lavadas em PBS e extractos nucleares preparados. Os núcleos foram sonicadas para gerar fragmentos de cromatina (≈ 500 a 800 pb). A cromatina foi pré-aclarados com uma mistura de proteína-Sepharose e proteinG-sefarose que foi bloqueado com albumina do soro bovino (1 mg /ml) e ADN de esperma de salmão (1 mg /ml). 10% da cromatina pré-aclarados foi utilizado como controlo de entrada. Quantidades iguais dos fragmentos de cromatina pré-aclarados foram imunoprecipitadas com anticorpos específicos para GLI1 (Novus Biologicals, CO), Gli2 (Cell Signaling Technology (MA), IgG (Abcam, MA; controlo negativo), ou histona H3 (Abcam, MA; controlo positivo ). Métodos foram realizados como descrito anteriormente (3, 4). os produtos imunoprecipitados foram lavadas extensivamente e eluída. 30 ul dos produtos eluídos foram tratados com ARNase a e proteinase K seguido de iniciadores específicos inversa de reticulação e o DNA isolado. Gene quantificadas as quantidades de hTERT e ADN promotor BCL-2 nas fracções imunoprecipitadas. os produtos de PCR foram resolvidos num gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV.

os iniciadores utilizados para a análise ChIP são os seguintes:

promotor hTERT frente: 5′-TGATGGGGACCGTTCCTTCCATC-3 ‘

promotor hTERT reversa:. 5′-ACACGGCCCACCCAGGGTTTA-3′.

BCL2-promotor frente : 5′-CCGGACGCGC CCTCCC-3 ‘

BCL-2 promotor reversa: 5′-GGTGCCTGTCCTCTTACTTCATTCTC-3.’.

luciferase Assay

O promotor hTERT de comprimento total (-3337 /+ 438), e eliminação montante mutantes (-1226 /+ 438 e -233 /+ 438) construções repórter -driven luciferase foram gentilmente cedidas pelo Dr. Ralf Janknecht, Universidade de Oklahoma Health Sciences Center, OK [18] . células HT29 ou 293T foram transitoriamente transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) com 4 mg do repórter luciferase e 0,4 mg pRLTK (luciferase Renilla conduzido pelo promotor TK). 24 h após a transfecção, as células foram analisadas utilizando o kit de luciferase duplo (Promega Corporation) de acordo com o protocolo do fabricante. A actividade de luciferase foi detectada utilizando Victor2 multilabel contador, e normalizada para Renilla actividade de luciferase como um controlo para a eficiência da transfecção.

A telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Ensaio

As células foram lisadas em tampão de lise 1X CHAPS e 0,25 ug de os lisados ​​foram utilizados para realizar ensaio TRAP. 1 ug de TS iniciador foi fim-rotulados com 3 ul de γ

P32ATP (Perkin Elmer) utilizando 1 mL de PNK (NEB) numa reacção de 20 uL a 37 ° C durante 45 min e purificou-se através de uma coluna de Sephadex G-25 coluna. Em cada reacção, 2 pmol de extremidade γ-32P rotulados TS iniciadores, e iniciadores para amplificação de PCR reversa foram misturados com 0,05 mM de dNTP, 20 mM de Tris • Cl pH 8,3, MgCl 1,5 mM

2, KCl 63 mM, 0,05 % de Tween 20, e 1 mM de EGTA. 20 ng de RNase A foi adicionada com o lisado celular em reacções tratados com RNase. extensão do primer mediada pela telomerase foi levada a cabo a 30 ° C durante 30 minutos, seguido de amplificação por PCR utilizando o TS e primers reversa. Produtos de ensaios TRAP foram analisados ​​em 12,5% PAGE não-desnaturante. Os ficheiros TIFF das imagens digitalizadas de gel foram quantificadas por densitometria utilizando o software Image J. e a actividade da telomerase foi determinada usando a fórmula mencionada no protocolo do fabricante para o kit de detecção de TRAPÉZIO telomerase (Chemicon International, Inc., MA).

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

resultados

HH Sinalização aumenta a expressão hTERT nas células cancerosas humanas

sinalização desregulada HH é conhecido para promover a proliferação celular, a progressão do ciclo celular e sobrevivência celular em células cancerosas humanas, por conseguinte, foi considerado que a via HH activado pode também desempenhar um papel no potencial de replicação de células cancerosas. A telomerase, um regulador chave da replicação potencial e estreitamente ligada com a proliferação celular e sobrevivência, por conseguinte, é um forte candidato para a regulação por sinalização de Hh activado em células cancerosas. Para testar esta hipótese, a relação entre o HH /GLI sinalização eixo e da telomerase expressão foi examinada em várias linhas celulares de cancro humano. Nós revogada eixo sinalização HH /GLI em várias linhas de células cancerosas humanas com inibidores farmacológicos e expressão da telomerase medida. células cancerígenas do cólon humano HT29 e SW480, expostos a GANT61 (20 mM), uma pequena molécula inibidora de GLI1 e Gli2 [9], durante 72 horas demonstrou reduzidos níveis de estado estacionário de GLI1, Gli2 e proteínas hTERT (Fig. 1A). Da mesma forma, o bloqueio HH sinalização /GLI nas células cancerosas da próstata C4-2, DU145 e PC3 também demonstraram diminuição GLI1, Gli2 e expressão da proteína hTERT (Fig. 1A). A administração de GANT61 (20 uM) para a linha celular U87 GBM ao longo de um período de 72 h resultou numa redução GLI1, expressão de proteínas Gli2 e hTERT (Fig. 1B). Nós validado ainda mais os efeitos da via de sinalização HH na expressão hTERT por modificar geneticamente a via de sinalização /GLI HH. Nós empregamos um C-terminal suprimido mutante de Gli3 (GLI3R, myc-tagged GLI3C’DCla1 [3]), que reprime a atividade GLI1 e Gli2 [8]. Após a transfecção transiente de GLI3R em HT29 (. Quantificação densitométrica na Fig 2A) e HCT116 (Fig. 2B) linhas celulares de cancro do cólon, GLI1, Gli2 e os níveis de proteína de hTERT foram diminuiu ao longo de um período de 48 h – 72 h. Por outro lado, a expressão estável de qualquer GLI1 ou GLI2ΔN, um N-terminal suprimido mutante de Gli2, com função de ativador constitutiva em células HT29 por 10 passagens demonstraram aumento da expressão da proteína hTERT (Fig. 2C).

A :

HT29, SW480 (células de carcinoma do cólon), C4-2, DU145 e PC3 (células de cancro da próstata) foram tratadas durante 72 h com DMSO (controlo de veículo) ou GANT61 (20 uM).

B:

U87 (células GBM) foram tratados com GANT61 (20 uM) durante 0-72 h. níveis estáveis ​​de GLI1, proteína Gli2 e hTERT foram determinados por análise de Western. HSP90α /β foi utilizado como controle de carga

A:.

HT29,

B: células HCT116

foram transitoriamente transfectadas com GLI3R (marcado-myc) para 48 hr ou 72 hr, respectivamente. níveis estáveis ​​de GLI1, Gli2 e hTERT foram determinados por análise de Western representada como densitometria das manchas em

A

com um blot hTERT representante (no detalhe). Expressão de GLI3R foi determinada utilizando o anticorpo anti-myc.

C:

PBP vector vazio (V) ou comprimento total GLI1 cDNA no PBP (GLI1) ou GLI2ΔN no PBP (GLI2ΔN) foi expressa de forma estável em células HT29, e as células foram cultivadas por 10 passagens. níveis estáveis ​​de GLI1, Gli2 e hTERT foram medidos por Western blot. HSP90α /β foi utilizado como um controlo de carga. * P . 0,0001

GLI Transcrição fatores interagem com o hTERT Promotor em células cancerosas humanas

Em seguida, investigaram o mecanismo pelo qual os sinais HH regulam a expressão de hTERT no câncer humano células. A regulação transcricional da expressão de hTERT é um mecanismo comum de hTERT regulação positiva em células cancerosas [19]. Uma vez que as proteínas GLI são fatores de transcrição, a hipótese de que GLI1 e Gli2 transcrição regular a expressão hTERT nas células cancerosas. a expressão de ARNm da hTERT foi elevada em ambos GLI1- e células HT29-overexpressing Gli2 (Fig. 3a). Quando as células HT29 foram expostas a GANT61 (20 uM), os níveis de ARNm da hTERT foram significativamente diminuída dentro de 24 horas e permaneceram suprimidos através de 72 horas (Fig. 3B). células DU145 demonstraram diminuição dos níveis de ARNm da hTERT Gli2 e quando exposta a GANT61 (20 uM), enquanto a expressão GLI1 transcrição permaneceu inalterado em 48 horas pós-tratamento (Fig. 3C). Após a exposição a GANT61 (20 uM), as células U87 demonstraram reduções em GLI1, Gli2 e ARNm da hTERT dentro de 24 horas (Fig. 3D). Estes resultados confirmaram a regulação da transcrição de expressão hTERT por via de sinalização HH em células cancerosas humanas

A:.

HT29 células que expressam de forma estável vector vazio (V), GLI1 (GLI1) ou GLI2ΔN (GLI2ΔN) foram analisados ​​para hTERT, GLI1 e a expressão de ARNm Gli2 determinada por PCR em Tempo real.

B:

A exposição de células HT29 a GANT61 (20 uM; 0-72 h) redução da expressão do ARNm da hTERT, determinada por PCR em Tempo Real.

C:

DU145,

D: células U87

foram expostas a GANT61 (20? M; 48 h ou 24 h, respectivamente) e GLI1, Gli2 e ARNm da hTERT foi medida por PCR em tempo real. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 determinações. * P . 0,05

Para dissecar o mecanismo de regulação transcricional da expressão hTERT por via de sinalização HH, nós monitorados os efeitos da sinalização HH sobre a actividade do promotor hTERT nas células HT29. O repórter de luciferase da hTERT de comprimento completo promotor-driven (FL prom hTERT-luc) e pRL-TK foi transientemente co-transf ectados para linhas celulares estáveis ​​derivados HT29-sobre-expressar ou GLI1 Gli2 ou hTERT. Ambos os GLI1 e GLI2ΔN células que expressam demonstraram um aumento de 4 vezes na actividade do promotor hTERT dentro de 24 horas de transfecção (fig. 4A). Para identificar o comprimento promotor mínimo necessário para os efeitos HH-dependentes sobre a actividade do promotor hTERT, o promotor hTERT FL (-3337 /+ 438), e mutantes de eliminação a montante (-1226 /+ 438 e -233 /+ 438) -driven luciferase repórteres foram co-transfectados em células HT29, seguido de exposição a qualquer um de controlo com veículo ou GANT61 (20 uM) durante 24 h. Os dados demonstram que a região -1226 /+ 438 é o requisito mínimo para a activação do promotor hTERT HH-dependente embora, os efeitos são menos do que a do promotor hTERT FL (Fig. 4B). A actividade do promotor hTERT FL foi significativamente reduzido mediante bloqueio da actividade GLI com GANT61 (20 pM) (Fig. 4B). A seguir, foi investigado se os factores de transcrição GLI directamente interagiu com o promotor de hTERT nas células cancerosas.

In silico

análise do promotor hTERT revelado 7 sítios de ligação putativos para a família GLI de fatores de transcrição. Ambos os anticorpos e GLI1 Gli2 precipitado fragmentos do promotor de hTERT nas análises chip (Fig. 4C). A amplificação por PCR dos fragmentos de cromatina utilizando iniciadores específicos para as regiões do promotor hTERT resultou em produtos de amplificação que continham pelo menos o núcleo promotor hTERT (-226 /+ 360) verificada por sequenciação de produtos de amplificação de PCR. A ligação de GLI1 Gli2 e ao promotor de hTERT foi reduzida na presença de GANT61 (20 uM) no prazo de 24 horas (Fig. 4D). BCL-2, previamente classificado como um alvo de ambos GLI1 e Gli2, foi utilizado como controlo positivo (Figura 4C e 4D.)

A:.

Derivados estáveis ​​de células HT29 (descritos em a Fig. 2C) foram co-transfectadas com uma luciferase do promotor de hTERT de comprimento completo conduzido (-3337 /+ 438) e repórter de luciferase de Renilla (pRL-TK) constrói durante 24 h. Os lisados ​​foram preparados, e a actividade da luciferase determinada como descrito em Materiais e Métodos. a actividade do promotor de hTERT de luciferase foi normalizada contra a actividade de luciferase Renilla e apresenta-se como média ± DP, n = 3.

B:

HT29 células foram co-transfectadas quer com o comprimento completo (-3337 /+ 438) ou a montante mutantes deletados (-1226 /+ 438 ou -233 /+ 438) de hTERT repórteres baile-luc e pRL-TK seguido por exposição a GANT61 (20 mM, 24 horas) e determinação da atividade da luciferase. a actividade do promotor de hTERT de luciferase foi normalizada contra a actividade de luciferase Renilla e apresenta-se como média ± DP, n = 3.

C:

HT29 foram utilizadas células para análise ChIP utilizando anticorpos específicos para GLI1, Gli2, ou histona H3 (positiva de controlo, utilizado para normalização).

D:

HT29 células tratadas com GANT61 (20 �, 24 h) foram avaliadas de forma semelhante por meio de análise de chip. Subsequente PCR em tempo real usada iniciadores que flanqueavam as regiões do promotor de hTERT ou o gene alvo a GLI, a BCL-2 (controlo positivo). * P . 0,05

HH /não GLI Signaling não regulam a expressão hTERT nas células 293T não-malignas

Nós investigou também se HH sinalização transcrição regula hTERT nas células não-malignas. As células 293T são experimentalmente transformado, mas não têm a capacidade para formar prontamente tumores em ratinhos nus [20] e demonstram uma indutíveis HH /GLI eixo de sinalização [21]. Nós transitoriamente transfectadas células 293T com, quer GLI1 ou expressão GLI2ΔN plasmídeos, e mediu a expressão da hTERT por análise ocidental. Embora expressões proteína e GLI1 Gli2 foram significativamente elevados em células 293T transfectadas, a expressão da proteína hTERT permaneceu inalterado em 48 h e 72 h (Fig. 5A). hTERT que sobre-expressam as células HT29 foram utilizadas como um controlo positivo para a análise de proteínas de hTERT (Fig. 5A). Medimos hTERT transcrição a seguir à transfecção transitória de células 293T em GLI2ΔN. Dentro de 48 horas de transfecção, as células 293T demonstrou aumento robusto em mRNA Gli2 e 5 vezes maior nos níveis de mRNA GLI1, mas sem elevação significativa no nível de mRNA hTERT (Fig 5B.). Além disso, a co-transfecção transitória do repórter Prom-Luc hTERT FL e os plasmídeos de expressão, quer GLI2ΔN GLI1 ou não aumentou a actividade de luciferase em células 293T (Fig. 5C). Estes resultados sublinham as funções dependentes do contexto da via de sinalização de Hh, que regula positivamente a expressão de hTERT selectivamente em células malignas em contraste com células não malignas

A:. Células 293T

não foram tratados (UT), transientemente transfectadas com vector vazio (V) ou GLI1 GFP (GLI1) ou GFP-tagged GLI2ΔN (GLI2ΔN). Expressão de GLI1, Gli2 e hTERT foi determinada para 48 e 72 horas por análise de Western. HSP90α /β foi utilizado como controlo de carga e GFP foi usado para marcar as proteínas GFP marcadas com GLI exogenamente expressas. lisado celular total a partir de células HT29, que expressam de forma estável hTERT (HT29 + hTERT) serviu como controlo positivo.

B:

células 293T transitoriamente transfectadas com vector ou Gli2 (como descrito na Figura 5a) foram analisados ​​para GLI1, Gli2 e a expressão de ARNm da hTERT por qPCR. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 determinações.

C: células 293T

transientemente co-transfectadas com FL-prom hTERT-luc, repórteres Renilla luceferase e vector, ou GLI1 Gli2 (como descrito na Figura 5A). 24 horas após a transfecção as células foram analisadas quanto à actividade de luciferase. atividade de luciferase conduzida pelo promotor hTERT foi normalizado contra a atividade Renilla luciferase e é representado como média ± SD, n = 3. * p . 0,05

HH /GLI Sinalização Regula hTERT Actividade Enzimática em células cancerosas humanas

upregulation aberrante de expressão hTERT está associada ao aumento da telomerase reverse transcriptase atividade da enzima em células cancerosas. Assim, testou-se o significado funcional do eixo /GLI /hTERT HH medindo a actividade da enzima telomerase em células cancerosas. ensaio TRAP foi usada para determinar a actividade de hTERT em cima, que altera a cascata de sinalização de Hh /GLI. GANT61 (20 uM) a administração conduziu a actividade da telomerase reduzida por 48 h, a qual foi mantida durante até 72 horas em células HT29 (Fig. 6A, quantificada na Fig. S1). Por outro lado, derivados estáveis ​​de células HT29 expressam GLI2ΔN revelou um aumento da actividade da telomerase, em comparação com o controlo do vector, enquanto que sobre-expressam GLI1 células teve um modesto aumento na actividade da telomerase (Fig. 6B, quantificada na Fig. S1). hTERT sobre-expressando células com actividade de telomerase elevada serviu como um controlo positivo (Fig. 6B). a actividade de telomerase foi reduzida em células DU145 expostos a GANT61 (0-30 uM) durante 48 h (Fig. 6C). as células U87 também demonstraram reduções na actividade da telomerase dentro de 48 horas de exposição a GANT61 (20 uM), que foi mantido até 72 h (Fig. 6D). Estas observações demonstram que a sinalização de Hh regula positivamente tanto a expressão de hTERT e a actividade da telomerase em células cancerosas humanas

A:.

HT29 células foram tratadas com GANT61 (20 uM) durante 0-72 h, e Os lisados ​​foram extraídos em intervalos para análise da TRAP. 100 escada de DNA pb foi utilizado como um marcador molecular (M).

B:

HT29 células que expressam de forma estável vector (V), ou GLI1 Gli2 (GLI2ΔN) (descrito na Figura 3A) foram avaliados quanto à actividade da telomerase por ensaio TRAP. hTERT que sobre-expressam as células foram usadas como controlo positivo.

C:

U87 e

D:. Células DU145

foram tratados com GANT61 (0-30 mM; 0-72 hr) e atividade da telomerase foi analisada pelo ensaio TRAP

Discussão

HH é essencial para o desenvolvimento embrionário normal, onde regula a diferenciação celular e a formação de órgãos de uma forma dependente do gradiente [22]. sinalização de Hh regula a proliferação celular por genes transcricionalmente moduladores que controlam a progressão do ciclo celular tal como a ciclina D, ciclina E e, também por sequestro de Ptch-mediada de ciclina B no cyctoplasm [23], [24], [25]. Na fase adulta, sinalização de Hh activo persiste num pequeno subconjunto de células que conferem potencial regenerativo para os órgãos maduras [26]. A desregulação da sinalização de Hh tem sido relatada em vários cancros humanos, incluindo o carcinoma das células basais [27], [28], meduloblastoma [1], [29], rabdomiossarcoma [30], glioma [1], adenocarcinoma pancreático [31], [ ,,,0],32], [33], o cancro da próstata [34] e do carcinoma do cólon [7], [8], [9], [10]. Em células de cancro, os mecanismos independente de ligandos ligando-dependentes e impulsionada por oncogenes autócrinos manter uma cascata de sinalização de Hh activo. HH actividade aberrante dirige a formação do tumor e a manutenção do tumor, induzindo sinais pró-sobrevivência e bloqueando os sinais apoptóticos em células cancerosas [9], [35]. Outra marca de câncer é o potencial de proliferação ilimitada de células cancerígenas, resultando em imortalidade, no entanto, um link para desregulado de sinalização HH não era conhecido.

Os telómeros são estruturas especializadas nucleoproteína nas extremidades cromossômicas que são importantes para a estabilidade cromossômica e imortalidade células. células somáticas normais encontrar uma deterioração progressiva do comprimento dos telômeros a cada ciclo de replicação do DNA limitando assim a vida útil celular. células-tronco normais e células cancerosas escapar esta verificação e reabastecer seus comprimentos dos telômeros pelo aumento da atividade da telomerase. A telomerase é uma ribonucleoproteína composto de telomerase humana enzima transcriptase reversa, hTERT e de ARN de telomerase, hTR [36], [37]. Em células cancerosas, expressão hTERT é aberrante restaurado levando ao aumento da atividade da telomerase, que mantém o comprimento dos telômeros e confere potencial de reprodução ilimitado. expressão hTERT e da atividade da telomerase tem uma estreita associação [33] com cancros humanos [17], [38]. A transformação de células normais de telomerase-negativas in vitro requer a expressão da hTERT [39], delineando a expressão da hTERT como um passo limitante da taxa na homeostasia do comprimento de telómeros e transformação celular. A regulação da expressão de hTERT tem sido extensivamente estudada e numerosos reguladores positivos e negativos foram identificados [40], [41].

Neste estudo, mostraram pela primeira vez que a via de sinalização de Hh assegura ilimitada potencial de replicação das células cancerosas, regulando a expressão da hTERT e atividade. Em várias linhas de células de cancro humano incluindo os do cólon, da próstata e do cérebro, e a supressão da expressão GLI1 Gli2 usando GANT61, um inibidor de molécula pequena resultou em expressão reduzida de ARNm da hTERT, proteína e actividade enzimática. Esta constatação indicou um eixo regulamentar entre HH de sinalização e hTERT nas células cancerosas humanas. Usando uma abordagem genética para suprimir GLI1 e Gli2 usando GLI3R, expressão hTERT também pode ser inibida em células de câncer de cólon. A expressão forçada de GLI1 ou um mutante constitutivamente activa de expressão Gli2 aumentou hTERT mRNA e proteína em células cancerígenas do cólon humano demonstrando regulação HH /GLI-mediada de expressão hTERT.