Abstract

Quase todos os cancros da próstata responder ao tratamento de privação de androgénios mas muitos se repitam. Nós postulamos que o risco de -Frequência hormona fuga e Atrasos são influenciados por modalidades de terapia hormonal. Mais, terapias hormonais induzir mudanças biológicas cruciais envolvendo receptores de andrógenos; alguns podem ser alvos para a prevenção de fuga. Foi investigada a relação entre o tratamento de privação de androgénio e o risco de recorrência utilizando ratinhos nus portadores do alto grau, dependentes de hormona humana de xenoenxerto de cancro da próstata PAC120. ratinhos portadores de tumor foram tratados por Luteinizing Hormone Releasing Hormone-antagonista (LHRH) sozinho, regime contínuo ou intermitente, ou em combinação com antagonistas do receptor de androgénio (AR) (bicalutamida ou flutamida). O crescimento do tumor foi monitorado. mudanças biológicas foram estudados quanto a alterações genômicas, mutações AR e expressão da proteína em uma grande série de tumores recorrentes de acordo com modalidades de terapia hormonal. Terapias dirigidas Her-2 ou AKT foram testados em combinação com a castração. Todos os testes estatísticos foram bilaterais. O crescimento tumoral foi inibido pela administração contínua do degarelix antagonista de LH-RH (castração), mas 40% dos tumores de recorrência. castração intermitente ou bloqueio completo induzido por degarrelix e Antiandrogénios combinação, inibiu o crescimento tumoral, mas aumentou o risco de recorrência (RR), em comparação com a castração contínua (RR

intermitente: 14,5, RR

bloqueio total: 6,5 e 1,35). Todos os tumores recorrentes exibidos

novas alterações genéticas quantitativos Comprar e AR mutações, quaisquer que sejam as modalidades de tratamento. amplificação AR foi encontrado após o bloqueio completo. O aumento da expressão de HER-2 /neu com a activação de ERK /AKT frequente foi detectada em todas as variantes. Combinação de castração com um inibidor de Her-2 /neu diminuição do risco de recorrência (0,17) e combinação com um inibidor de mTOR impedido. tratamentos de hormônio anti influenciar o risco de recorrência, embora a inibição do crescimento do tumor foi inicialmente similar. tumores recorrentes exibido instabilidade genética, mutações AR, e alterações de vias de fosforilação. Nós postulamos que HER-2 /vias AKT permitido resgate de células tumorais sob a castração e demonstramos que sua inibição impedido recorrência do tumor em nosso modelo

Citation:. Guyader C, Céraline J, Gravier E, Morin A, Michel S, Erdmann E, et al. (2012) Risco de hormona de escape em um modelo de cancro da próstata humana depende de Terapia Modalidades e pode ser reduzido pela tirosina-quinase inibidores. PLoS ONE 7 (8): e42252. doi: 10.1371 /journal.pone.0042252

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 16 Janeiro, 2012; Aceito: 05 de julho de 2012; Publicação: 06 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Guyader et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela ARC eo contre le cancer Ligue (Paris, França). Esses financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. ARTIC financiou a edição Inglês

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Um autor é empregado por bioMérieux. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

receptor de andrógeno (AR) controla a proliferação celular e sobrevivência nos carcinomas da próstata e da próstata normais (PCA). Assim, a privação de andrógeno é o tratamento de primeira linha de CaP. A terapia hormonal inclui castração farmacologicamente alcançado com hormona luteinizante-hormônio liberador agonistas ou antagonistas (LH-RH), antagonistas de AR como flutamida ou bicalutamida ou novas modalidades de tratamento, tais como inibidor de 17-20 liase (acetato de abiraterona, TAK700) ou MDV3100 [1] . Os tratamentos são dados de forma contínua ou intermitente, por monoterapia com inibidores da LH-RH, a monoterapia anti-andrógeno ou combinados, tal como referido completar bloqueio androgênico.

Seja qual for a terapia hormonal, a maioria dos tumores respondem, em seguida, adquirir a independência de androgénio e se repetem [2], [ ,,,0],3]. Vários mecanismos têm sido propostos [4], [5].

i.

Alterações genômicas ocorrer durante a progressão do tumor, mas seu papel ainda não está claro, embora anormalidades cromossômicas clonais foram encontrados em CaP [6], [7].

ii.

Alteração da expressão do AR é freqüente devido à amplificação do gene [8], o aumento da transcrição, ou a estabilização da proteína AR via fosforilação de resíduos AR específicas [9], [10], as mutações AR que ampliar o espectro de ligando [8], alterações na coativadores receptores nucleares, e independente do ligando de ligação de AR para o DNA [2], [11]. A prevalência ea influência das alterações AR na progressão da doença não são conhecidos devido à variabilidade em regimes de tratamento, acesso limitado ao material de pacientes e, assim, poucos estudos de sequenciamento abrangentes.

iii.

Ativação de vias de sobrevivência está envolvido em hormona de fuga [12], como Her-2 /neu (a quinase crescimento da tirosina do receptor do factor), mTOR /AKT (alvo da rapamicina /AKT), ou ERK1 , 2 (extracelular sinal-quinase regulada), todos implicados na fosforilação AR [5], [10]. Her-2 expressão /neu é geralmente baixa em CaP. No entanto, altos níveis de Her-2 /neu foram encontrados associados com o tempo de sobrevida encurtada em um subconjunto de pacientes CaP [13], [14]. Mais, Craft

et al.

Mostrou que forçou Her-2 expressão /neu modula a sinalização AR e leva a independência de andrógeno [15]. Uma via AKT alterada foi associada com a progressão da APC e o surgimento de tumores IA [16]. Além disso, Graff

et ai.

Mostrou que a sobre-expressão forçada de AKT na linha celular LNCaP acelerou o crescimento tumoral [17]. AKT pode ser uma forma alternativa pela qual Her-2 /neu leva para proibir a ativação AR [18].

Uma questão-chave em clínicas é se modalidades de tratamento hormonal diferente afetar o risco de fuga. Para responder a esta questão crítica, foi utilizado um modelo experimental de um hormônio dependente do cancro da próstata humana (PAC120), derivada diretamente de um paciente e em crescimento em ratinhos imunodeficientes. Foram avaliados os efeitos de diferentes modalidades de tratamento hormonal sobre a resposta imediata e sobre o risco de recorrência; as mudanças biológicas associadas a diferentes tratamentos, como alterações do genoma,

AR

mutações e expressão do fator de crescimento /activação foram estudados. O envolvimento de vias de fosforilação na hormona de fuga nos levou a testar combinação de inibidores da tirosina quinase com a castração farmacológica para reduzir o risco de recorrência do tumor.

Métodos

xenoenxertos próstata tumor

PAC120, um ser humano in-rato-CaP xenotransplante hormono-dependente [19], mantido por transplante de série para a almofada de gordura interescapular de camundongos nu masculino suíço (Crl: nU (Ico) -Foxn

LNU) a partir de Charles River (L ‘Arbresle, França) foi usado entre as passagens 47 e 51. pedaços de tumor de 20 milímetros

3 ± 5 (± 20. 10

6 células), onde transplantado. Todos os protocolos seguiram as diretrizes institucionais que propõe a Comissão de Ética francês.

Tratamentos

degarrelix (Firmagon® conhecido como FE 200486 durante o seu desenvolvimento, Ferring Research Institute Inc., San Diego, CA) [20] injectados por via subcutânea mensal a 10 mg /kg de [19], bicalutamida (Casodex®, Astra Zeneca, França) e flutamida (Eulexine®, Schering-Plough, Kenilworth, NJ), dado a 50 mg /kg, per os, 5 dias por semana. Trastuzumab (Herceptin, Roche, France) injectados semanalmente a 10 mg /Kg por via intraperitoneal. Everolimus (Afinitor®, Novartis Pharma AG, Suíça) dado por via oral em 2 mg /kg, 3 vezes por semana. Nós definimos a castração contínuo, como injeção de degarrelix sozinho uma vez por mês. Os ratinhos foram mantidos sob tratamento até a recidiva do tumor (tumor tinha para alcançar uma 1.500 milímetros

3). castração intermitente consistiu de 2 injecções de degarelix no dia 0 e 28 (um ciclo), em seguida, parou o tratamento até que o tumor atingir costas 2 vezes o volume inicial. O bloqueio completo de androgénio é a associação de mensal degarelix em combinação com o inibidor do receptor de anti-androgénio (quer bicalutamida ou flutamida). Figura S1 representa um diagrama esquemático das modalidades de tratamentos.

Avaliação Tumor Crescimento

Siga-up do crescimento do tumor foi feito de acordo com Marangoni et al. [21]. A recidiva foi definido como o tempo em dias necessários para os tumores para conseguir um aumento de 5 vezes a partir do volume inicial.

fragmentos de tumor xenoenxerto foram implantados PAC120 aleatoriamente em 204 ratinhos macho. Assim que os tumores atingiram um volume médio de 63-250 mm

3, os ratinhos foram atribuídos ao tratamento (

N

indicado na Tabela S1). Depois de novo crescimento tumoral, tumores AI foram transplantadas em ratinhos machos castrados e farmacologicamente caracterizado em passagens precoces (1 a 4).

Análise de RT-PCR de ARNm

O ARN total foi extraído como publicado anteriormente [21 ]. Sequências de iniciadores são indicados nos métodos S1.

Funcional AR detecção de mutações por ADE2 Reporter Assay

Foi utilizado um ensaio funcional na cepa de levedura EJ250 para detectar mutações AR [22].

receptor de andrógeno (AR) ensaio da atividade baseada em leveduras.

Um ensaio de atividade AR realizada na cepa de levedura EJ250 recombinante (MATa ade2-101 HIS3-D200 LEU2-D1 lys2-801 trp1-D1 ura3 -52 URA3: ARE-ADE2 [pRS /AREAde2]) foi utilizada para as amostras de tumor para o ecrã mutações AR como descrito anteriormente [22], [23]. Neste EJ250 estirpe de levedura, a expressão do gene repórter ADE2, necessário para a biossíntese de adenina, foi colocado sob o controlo apertado de um promotor dependente de androgénio [22]. Consequentemente, o crescimento da levedura EJ250 baseia-se na actividade de transcrição de um receptor de androgénio activados por ligandos. Depois da transformação com um plasmídeo de expressão de AR, como descrito anteriormente [22], de levedura foram plaqueados em meio selectivo esgotado de adenina e contendo ou di-hidrotestosterona (DHT), dehydroepiandrostenedione, β-estradiol, progesterona, 17a-hidroxiprogesterona, flutamida ou acetato de ciproterona (Sigma Aldrich , St Quentin Fallavier, França), na concentração indicada. Um controlo negativo (veículo) e um controlo positivo (suplementado com adenina) também foram incluídos. Quando aplicado a amostras de tumor, as variantes de AR mutantes podem ser distinguidas das do tipo selvagem AR de acordo com a sua resposta ao esteróide ou não esteróide adicionado molécula no meio.

Detecção de receptor de androgénio (AR) mutações em amostras de tumor.

Resumidamente, o ARN total foi preparado a partir de amostras de tumores (RNeasy Midi Kit, Qiagen, Courtaboeuf, França). A transcrição reversa foi realizada com o kit de transcrição inversa Omniscript (Qiagen) a partir de 1 ug de ARN total. Os fragmentos de ADNc foram amplificados com AR a frente (5′-TGCGGCGGCGCAGTGCCGCTAT-3 ‘) (nucleótidos 2310-2339) e (5′-3-GGTGCCATGGGAGGGTTAGATAGGGAG inverter’) (nucleótidos 4075-4101) iniciadores que flanqueiam os exões 1-8 (GenBank NM_000044. 2, os nucleótidos 2310-4101). Em seguida, com 100 ng de fragmentos AR ADNc foram inseridos numa expressão de levedura “reparação lacuna” plasmídeo por recombinação homóloga, e após o plaqueamento e a incubação a 30 ° C durante 72 horas, as colónias de leveduras foram contadas [22]. O AR de tipo selvagem foi ensaiado em paralelo como controlo experimental. O crescimento de levedura dependente do receptor de androgénio em resposta ao esteróide ou antiandrogénio adicionado ao meio foi avaliada por colónias de pontuação. Os dados são apresentados como histogramas correspondentes à razão entre o número de colónias de levedura marcados com o número de colónias obtidas na presença de 100 nM de DHT. Para mutações AR caracterização, o plasmídeo de expressão AR foi resgatado a partir de células de levedura para a sequenciação. Resumidamente, as leveduras foram lisadas com 150 a 212 ^ m pérolas de vidro lavado com ácido (Sigma Aldrich) e o ADN plasmídico foi extraído com o kit de plasmídeo NucleoSpin (Macherey-Nagel, Hoerdt, França) e processadas para sequenciação (GATC Biotech AG, Konstanz, Alemanha ).

Protein Expression Analisando por Western Blotting

AKT, fosfo-AKT (S473), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology, Ozyme, Saint Quentin en Yveline, França) e PSA ( Dako) foram usadas em 1:1000. Her-2 /neu (Cell Signaling), AR (Upstate, Millipore, Saint Quentin en Yveline), e P-ERK1 /2 (sistemas RND, Lille, França) foram usadas em 1:500. Anti-beta-actina foi utilizada no 1:5000 (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, França). Protocolos são detalhados em Métodos S1.

Hibridização Genômica Comparativa Arrays

O procedimento foi publicado anteriormente [24]. Foram realizadas co-hibridação entre o ADN extraído a partir de variantes da GA e aqueles a partir de PAC120p47. alterações mínimas comuns foram identificados [25]. agrupamento hierárquico foi realizada em perfis com base em regiões mínimos. distância Euclidiana foi utilizado como a medida de similaridade e o algoritmo de Ward como o método de aglomeração. Separação em grupos foi proposto com base na estrutura do dendrograma.

Histologia

microscópio de luz estudos histológicos tumores residuais PAC120 formalina 4 mícrons de espessura secções embebidas em parafina fixos de PAC120, usados e AI variantes corados com hematoxilina e eosina Safran.

Análise estatística

Foi utilizado o teste de Mann-Whitney, parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier, testes de log rank-e teste exato de Fisher, de acordo às respectivas experiências conforme detalhado em Métodos S1.

resultados

In vivo

resposta ao hormônio Regimes de Tratamento

castração contínua por degarrelix prendeu o crescimento de todos tumores PAC120. As recorrências foram observadas em 8/20 ratos, um atraso médio de 274 dias de intervalo [211-323] (Figura 1A). castração intermitente foi testado de acordo com o protocolo seguinte: a primeira administração de degarelix reduziu o volume tumoral em todos os animais (14/14, 100%). A segunda administração foi administrado uma vez regrew tumor de duas vezes em volume, de um atraso médio de 119 dias. Seis tumores tais tratados não respondeu (6/14, 43%) e 8 apresentaram baixa resposta ou estabilização. Kaplan Meier análise mostrou um aumento do risco relativo de recorrência de 14,5 (IC 95%: 2,98-70,9,

p Art 0,001, teste log-rank) (Figura 1A e na Tabela S2). Portanto, a privação de andrógeno intermitente aumentou o risco de recorrência e reduziu o tempo de progressão, em comparação com a castração contínua.

A) análise de Kaplan-Meier de sobrevida livre de fuga hormonal após (quadrado branco contínua, linha completa), intermitente (quadrado branco, linha pontilhada) degarrelix, bicalutamide além de degarrelix (triângulo preto, linha completa) ou flutamida além de degarrelix (triângulo preto, linha pontilhada). B) as curvas de crescimento do tumor em função do tempo em controle (Cercle branco, linha completa), bicalutamida (triângulo branco, linha completa), flutamida (triângulo branco, linha pontilhada), degarrelix (quadrado branco, linha completa), bicalutamide além de degarrelix (triângulo preto, linha completa) e flutamida além de degarrelix (triângulo preto, linha pontilhada); C i) PAC120 xenoenxerto [X200], tumor PAC120 residual (300 dias) II) [X100], iii) [x 400], AI variantes com características adenóides (IV) [X100], características amphicrine (V) [X200], e características mucosecretant (vi) [x200]

crescimento do tumor significativamente atrasada flutamida ou bicalutamida (

p = 0,03

, e

p Art 0,001, respectivamente). (Figura 1B). bloqueio androgênico completo (degarrelix mais bicalutamida) prendeu o crescimento do tumor em 30 casos tratados, mas 24 tumores retornou. Recidivas ocorreu mais cedo do que após a castração sozinho (Tabela S2), com aumento do risco relativo de recorrência (risco relativo de 6,55; IC 95%: 2,41-17,8,

p Art 0,001, teste log-rank) (Figura 1A e Tabela S2). bloqueio androgênico completo com degarrelix mais flutamida levou a 8/11 tumores recorrentes e um tempo médio de hormona de escape de 253 dias [intervalo de 43-337] (Tabela S2); aumento do risco de recorrência não foi estatisticamente significativa quando comparado apenas com degarrelix (

p = 0,561

, teste log-rank).

histológica e molecular alterações associadas com andrógeno Independência

tumores PAC120 residuais sob a castração mostrou áreas de necrose, mitoses numerosas e há corpos apoptóticos (Figura 1C

ii iii

). Andrógeno independente (AI) variantes apresentadas alterações histológicas, tais como características de diferenciação adenóide mucinoso, neuroendócrino-like, ou (Figura 1C iv-vi). Todas as variantes AI exibido padrões mistos, dominados pela diferenciação mucinoso e /ou diferenciação apócrina e numerosas células multinucleadas. Nenhum feições eram específicas para qualquer tratamento hormonal particular.

A estabilidade cromossômica dos tumores PAC120 através do tempo e passagens foi demonstrado anteriormente [24]. Nós co-hibridizado DNA AI com o DNA PAC120 parental para revelar as novas alterações. Trinta e cinco regiões mínimos foram alterados de, pelo menos, 5 (20%) do 26 AI variantes estudadas. Surpreendentemente, nenhuma das alterações eram comuns a todas as variantes IA. ganhos de cópias do gene e perdas são detalhados na Tabela S3. As variantes 26 AI foram agrupados por regiões alterados em cinco grupos distintos utilizando uma análise hierárquica de grupos (Figura 2). No entanto, não encontramos qualquer padrão específico do tratamento das alterações associadas a recidivas (teste exato de Fisher e Benjamini e Hochberg correção para ajustar para testes de múltipla). Estes resultados mostram que a privação de androgénio gerada uma diversidade aleatória de novas alterações genéticas mas nenhum padrão específico poderia ser atribuído ao tipo de regime de tratamento. Estas alterações foram adquiridas de forma estável (dados não mostrados).

Não houve relação entre as alterações no número de cópias do gene e do tipo de tratamento hormonal. A coluna da esquerda indica numerada AI variantes de tratamento onde

de

denota degarrelix,

de-um

degarrelix além de anti-andrógeno (bicalutamida ou flutamida),

de-t

degarrelix mais trastuzumab. cores verdes e vermelhas correspondem a perdas e ganhos de número de cópias do gene, respectivamente. Amarelo corresponde ausência de diferença em termos de número de cópias do gene entre as variantes AI e DNA PAC120 parental.

AR

amplificação do gene foi observada em 15% (4/26) de AI variantes e ocorreu somente no AI derivado após o bloqueio completo (aide-a) grupo (Tabela S3). Frequência de amplificação do gene após o bloqueio androgênico completo foi significativamente maior do que após sozinho castração (

p =

0,01, teste exato de Fisher). Nestes casos AR os níveis de mRNA foram aumentados de 10 a 20 vezes, como foram os níveis de ARNm de PSA intratumoral (Figura S2).

AR

mutações foram detectadas utilizando um ensaio baseado em leveduras como funcional descrito previamente [22]. Sem funcionais

AR

mutações foram encontradas no tumor PAC120 mas apareceu em 28% (10/36) de tumores variante IA. Um exemplo do perfil que obtivemos para aide-A4 é mostrado na Figura S3. As mutações ocorreram em 46%, 17% e 25% após o bloqueio completo, antiandrogénios e degarrelix, respectivamente (Tabela S4). ADNc AR sequenciação revelou 30 diferente

AR

mutações (Figura 3, Tabela 1), dos quais 70% foram localizadas na região de charneira (RH) ou no domínio de ligação ao ligando (LBD), 27% levou a uma AR proteína truncada. Alguns AI variantes apresentadas várias mutações. Apenas Q693X era comum a todos os diferentes tratamentos hormonais. A mutação Q693X, bem como os outros codões de paragem prematura na Tabela 1, conduz a uma variante AR truncada sem o domínio de ligação ao ligando e FA-2. A variante Q693X AR também tem sido detectada em tumores de cancro da próstata humano (dados não publicados). AR variantes truncadas demonstrar actividades transcricionais constitutivos como descrito anteriormente [23]. Eles têm sido associados com a castração-resistência como eles podem promover o crescimento de células de cancro da próstata em culturas de células in vitro e modelos de tumores animais, na ausência de androgénios (Figura S4). A maioria das mutações eram novos.

completa sublinha mostram mutações encontradas em mais de um tumor tratado com o mesmo agente. As mutações descritas com um fundo azul, verde ou vermelho foram previamente descritos na PAIS, CAIS e PCA, respectivamente.

O nível de proteína AR (normalizada pela actina) foi aumentada em todos AI variantes (Figura 4). Estes dados sugerem que as alterações Ar são eventos chave na recorrência do tumor após a privação de androgénio, necessárias para a sobrevivência de células de cancro da próstata.

actina foi utilizado como um controlo para a proteína de carregamento. B) Os histogramas representam a quantificação de AR, Her-2 /neu e os rácios de pAKT /AKT e pERK /ERK normalizada para a actina e a média de PAC120 provenientes de várias passagens (expressa em unidades arbitrárias). AR (barras pretas) foi expressa em PAC120 e todas as variantes IA e de Her-2 /neu (barras cinzentas pontilhadas) foi sobre-expresso em todas as variantes IA. De qualquer p-AKT /AKT (barras cinza com a linha completa) ou pERK /ERK (barras brancas) foram ativadas no AI variantes. Abreviaturas utilizadas para identificar variantes são explicados na legenda da Figura 2.

proteína HER-2 /neu foi sobre-expresso em todos os AI variantes (

n =

17) testada em comparação com PAC120 (Figura 4). Além disso, AKT ou ERK1,2 ou ambas as vias foram activados na maior parte dos variantes de IA, que mostra que uma tal activação está associada com a hormona de escape privação, e participa mecanismos compensatórios da activação de AR. O papel fundamental destas vias de fosforilação foi indiretamente demonstrado pelo forte efeito de sua inibição.

Efeitos de Combinação Castração com tirosina-quinase Inibidores

Degarrelix combinado com trastuzumab significativamente e reduziu drasticamente o risco relativo de recorrência de 0,17 (IC 95%: 0,04-0,67,

p = 0,005

, teste log-rank) (Figura 5A), e prolongou o tempo mediano até à hormona de escape de 274 para 351 dias (Tabela S2) versus castração apenas com degarrelix. A recorrência do tumor foi observada em apenas 17% (4/24) dos animais que receberam o tratamento de combinação. Trastuzumab como um agente único não teve efeito sobre o crescimento do tumor.

B curvas de crescimento do tumor) como uma função de tempo no grupo de controlo (Cercle branco, linha cheia) e nos grupos que receberam everolimus 2 mg /kg, três vezes por semana (forma de diamante branco, linha pontilhada), degarrelix 10 mg /kg mensal (quadrado branco, linha completa), trastuzumab acrescido de degarrelix (cruz, linha completa) ou everolimus mais degarrelix (preto em forma de diamante, linha completa).

Degarrelix combinado com everolimus completamente evitada hormona fuga dos 17 tumores tratados. Como o crescimento do tumor atrasada single-agente de everolimus e os TGI

36 dias foi de 59% (

p = 0,001

, Mann-Whitney) (Figura 5B).

Estes resultados demonstram um superior efeito da castração quando combinado com HER-2 /neu anticorpos ou inibidor de mTOR alvo.

Discussão

Foi realizado um

in vivo

estudo experimental do efeito de diferentes tratamentos hormonais sobre o risco de hormona de fuga. Nós estabelecemos uma grande série de AI variantes para estudar a diversidade de eventos genéticos e moleculares que ocorrem após a hormona fuga. Nós usamos um xenotransplante hormono-dependente humano PCA (PAC120) [19]. PAC120 derivada directamente a partir de um tumor primário de um paciente. PAC120 mostrou surpreendente estabilidade do cariótipo, mantida a dependência estável hormonal [24] e da falta de

AR

mutações, após várias passagens [19].

O crescimento contínuo do tumor farmacológicos prisões castração, escapes ocorrem em 40% dos casos. Antiandrogénio monoterapia abrandou o crescimento do tumor. Isto reflecte as observações clínicas. No nosso modelo, o bloqueio completo de androgénio aumentou o risco de hormona de escape, em comparação com a castração sozinho. Parece que o bloqueio completo de androgénio exerce uma grande pressão sobre a via de sinalização de AR, conduzindo à activação de vários percursos de sobrevivência. Grandes estudos randomizados e meta-análises mostraram que o bloqueio completo não prolongou o tempo de progressão na maioria dos pacientes [26]. Fase II e III estudos comparando intermitente contra a castração contínua no cancro da próstata foram associados com um risco maior de hormona de fuga em caso de castração intermitente, mas a sobrevida global não foi encurtado após a privação de andrógeno intermitente em comparação com um horário contínuo com uma melhor qualidade de vida e menos custo [27], [28]. A discrepância com os nossos dados poderia ser explicado pela agressividade do PAC120 (Gleason 9), enquanto que os estudos clínicos incluíram uma grande diversidade de tumores na próstata de baixo e alto grau. Mais, o tempo escolhido para reiniciar o tratamento baseou-se um parâmetro unic, isto é, o volume do tumor, enquanto em clínica vários parâmetros são considerados (testosteronemia, PSA). A terapia intermitente pode não ser apropriado para todos os casos de câncer de próstata. mudanças biológicas

AI variantes apresentadas. Histologia dos tumores sob a castração mostrou numerosos mitose e áreas de necrose, o que sugere um equilíbrio entre a mitose /sobrevivência celular /morte e descartando qualquer estado dormente de resíduo tumoral. AI variantes apresentadas padrões mistos, mucinoso ou /e diferenciação apócrina semelhantes ao tumor parental e nenhum apresenta específicos para a modalidade de tratamento hormonal.

Nós verificado que o cariótipo profundamente alterado de PAC120 permaneceu bastante estável através de transplante e do tempo [24 ], e mostrámos que a castração resultou em uma onda de novas alterações genômicas. Mais, estas alterações adquiridas são estáveis ​​(dados não mostrados), talvez explicando por que a independência hormonal foi irreversivelmente adquirido. Surpreendentemente nenhuma das novas alterações foram comuns aos 26 variantes de IA. Instabilidade genética é conhecida para ser ligada a progressão do cancro, a nossa observação sugere um tal mecanismo de progressão [29], [30]. Em seguida, procurou alterações envolvendo expressão AR, amplificação do gene ou mutações genéticas.

amplificações de genes

AR, foram detectadas após o bloqueio completo de androgénio como encontrado em pacientes [31].

AR

mutações que contribuem para a hormona de escape, fornecendo uma maior receptividade de AR para outros ligandos de [8], afectar vários processos AR-dependentes [2], [32]. Steinkamp

et al.

Informou que amostras de tumores CaP hormonais-naïve tinha muito poucos

AR

mutações, sugerindo que estas mutações ofereceu pouca vantagem de crescimento e foram, de facto, mutações aleatórias “passageiro” [33]. O ensaio foi utilizado especificamente para selecciona

AR

mutações que afectam a função do receptor [22]. Observou-se uma enorme diversidade de privação de andrógeno induzida por terapia

AR

mutações, embora muito poucos eram comuns a todas as variantes AI e uma maioria não foram descritos [34]. Ao todo, as variantes AI ilustra a diversidade putativa de eventos biológicos associados com a hormona de fuga e sublinhou que uma regulação em função da AR permanece central em cancros da próstata. abordagens terapêuticas inovadoras orientadas para as vias AR inibindo tanto a liase de 17-20 ou a translocação do receptor para o núcleo sublinhou este ponto essencial [1]. Nosso último conjunto de dados é outra alternativa de bloquear as vias AR que poderiam ser abordadas em clínicas.

Foram examinados Her-2 /neu e expressão p-AKT no PAC120 AI variantes para determinar se quinase e fosforilação vias estavam envolvidos na fuga hormona, como mostrado por outros [15], [18]. Em amostras clínicas, Her-2 expressão /neu em tumores foi elevada de AI [14], [35] e classificado como um evento precoce na dependência de androgénio ao interruptor de independência [36]. O mecanismo proposto para o papel de Her-2 /neu em hormona de escape é que esta cinase activa a fosforilação AR (através da via MAPK ou Akt) [18], [37], que por sua vez mantém a integridade de AR e, assim, a sua função na ausência de testosterona. Lin HK et al., Mostraram que a PI (3) K /Akt, mas não PI (3) K /p70S6K via de sinalização pode modular a transactivação AR. Ao usar Herceptin, nós bloquear a PI (3) K via a montante que poderia explicar a redução de fuga tumor [38].

Outras alterações podem contribuir para a activação independente do ligando de AR. A perda de PTEN, mutação de PI3K, AKT1 e AKT2 amplificação pode activar Akt quinase. Aumento dos níveis de fosfo-AKT foi detectado em CaP tratados com bicatulamide [39]. Nas nossas variantes IA, Her-2 /neu e p-AKT expressão /activação foi aumentado e o efeito preventivo do trastuzumab- ou everolimus- degarelix tratamentos combinados em hormona de escape demonstra o seu papel fundamental. Os HER-2 /AKT e vias mTOR são alvos acessíveis a novos inibidores; trastuzumab demonstrou a sua eficácia em Her-2 /cancro da mama amplificado-neu [40]. Wang et ai demonstraram na linha celular de cancro da próstata que a inibição da mTORC1 e Ar vias por uma combinação de rapamicina e bicatulamide levou a apoptose e pode ser um valor terapêutico no tratamento do cancro da próstata [41]. Um estudo recente mostrou em LnCaP e uma experiência de curta duração a vantagem de o bloqueio da sinalização de AR em combinação com os percursos de mTOR [42]. Relatamos que esses agentes em combinação com a castração grandemente reduzida independência de androgénio, a co-administração a ser exigido. Além disso, um forte apoio vêm de um estudo onde everolimus combinada com um aumento da sobrevivência livre de progressão inibidor da aromatase em pacientes com cancro da mama avançado hormônio-receptor-positivo previamente tratados com inibidores da aromatase não esteroidais [43].

Nossos dados confirmar que AR continua a ser um actor central na sobrevivência das células APC, e nossos dados sugerem que o receptor de andrógeno pode ser ativado por vias alternativas que resultam em independência de androgénio. Finalmente, que mostrou que o tratamento de combinação com castração terapia alvo molecular reduziu significativamente o risco de fuga da hormona. Este estudo pode ter grande implicação no tratamento de câncer de próstata dependente de androgénio e inibição dupla vale a pena explorar a situação clínica.

Informações de Apoio

Figura S1.

Representação esquemática dos

In vivo

regimes de tratamento.

doi: 10.1371 /journal.pone.0042252.s001

(TIF)

Figura S2.

expressão de ARNm relativa do receptor de androgénio (AR) (barras pretas) e intratumoral antigénio específico da próstata (PSA) (barras brancas) em androgénio independente (AI) variantes. * Indica variantes com amplificada

AR

número de cópias do gene. Abreviaturas utilizadas para identificar variantes são explicados na legenda da Figura 2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0042252.s002

(TIF)

Figura S3.

perfil de resposta hormonal no tumor resistente à castração aide-a4. A capacidade de resposta do AR no tumor resistente à castração aide-a4 foi avaliada usando o ensaio funcional baseado em levedura e em comparação com a do tipo selvagem AR, tal como descrito em Material e Métodos. Histogramas representam respostas aberrantes obtidos com 100 nM β-estradiol (E2) e 1 de acetato de ciproterona? M (CPA), quando comparado com o tipo selvagem AR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0042252.s003

(TIF )

Figura S4.

atividade constitutiva da Q693X variante do receptor andrógeno.