Abstract

Nós já demonstrou que gonadotrofina coriônica humana β (hCGβ) induziu a migração e invasão em células cancerosas humanas da próstata. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos não são claras. Aqui, estabelecemos uma linha de células de cancro da próstata estável superexpressão hCGβ e testado hCGβ-desencadeada vias, causando migração e invasão celular sinalização. ELISA mostrou que a quantidade hCGβ secretada para o meio de cultura aumentou com o tempo após as células hCGβ-transfectadas foram incubadas por 3, 6, 9, 12 e 24 h. Mais, as normas hCGβ promovido MAPK (/2 ERK1) e a fosforilação aumentada de MMP-2 de expressão e actividade em ambos os modos da dose e dependente do tempo da hCGβ células não transf ectadas. Além disso, hCGβ promovido ERK1 2 fosforilação /e aumento da expressão de MMP-2 e actividade significativamente em hCGβ transfectadas células DU145. Considerando que a ERK1 /2 PD98059 bloqueador (25 uM) regulada negativamente de forma significativa ERK1 /2 e a MMP-2. Particularmente, hCGβ promovido a migração celular e invasão, mas o PD98059 diminuiu a motilidade celular induzida pelo hCGβ sob essas condições. Estes resultados indicaram que hCGβ motilidade celular induzida através de promover ERK1 fosforilação 2 /MMP-2 e sobre-regulação em células DU145 de cancro da próstata humanas

citação: Li Z, Li C, Du G, Zhou Y, W Wu (2013. ) gonadotrofina coriônica humana β Migração Induz e Invasion via Ativando ERK1 /2 e MMP-2 em células cancerosas da próstata humana DU145. PLoS ONE 8 (2): e54592. doi: 10.1371 /journal.pone.0054592

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de junho de 2012; Aceito: 14 de dezembro de 2012; Publicação: 12 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Plano de Desenvolvimento da Comissão de Educação Pequim (número de concessão: KM200910025008) Ciência e e National Natural Science Foundation da China (número de concessão: 81272843). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos cânceres mais comumente diagnosticados e a sexta maior causa de morte nos homens no mundo [1]. Actualmente, os principais métodos para o tratamento do cancro da próstata são a prostatectomia radical, terapia de radiação com feixe externo, braquiterapia, terapia de privação de androgénio e a quimioterapia sistémica, etc. [2] – [6]. Mas a eficácia terapêutica é insatisfatória. O desenvolvimento de novas terapias, tais como terapia molecular é necessária para o tratamento do cancro da próstata. Mas a caracterização dos mecanismos moleculares que causam o cancro da próstata é a base para o estabelecimento de uma nova terapia. Se determinar os alvos moleculares terapêuticos que contribuíram para o câncer de próstata em primeiro lugar, então podemos tratar pacientes através de direcionamento desses marcadores tumorais para inibir o câncer de próstata, melhorar ainda mais o prognóstico e menor a mortalidade.

gonadotrofinas coriónica humana (hCGs) são glicoproteínas heterodiméricas secretadas por células trofoblásticas na gravidez normal. HCGs tem algumas isoformas contendo hCG intacta, hCGα, hCGβ, hiperglicosilados (hCGh), cortes (hCGn) e do núcleo fragmento do hCGβ (hCGβcf) [7]. HCGβ é uma molécula com função independente. Tem sido demonstrado que hCGβ livre é um marcador tumoral potencial produzido por uma variedade de tumores [8] – [10]. Nós relatado anteriormente que hCGβ diminuição da expressão da caderina-E levando a migração e invasão em células de câncer de próstata [11]. No entanto, os mecanismos envolvidos inteiras não são claras.

kinase1 /2 (/2 ERK1) activação regulada por sinal extracelular tem sido implicado na carcinogênese e progressão do câncer. O aumento da actividade de ERK1 /2 promove a proliferação de células cancerosas e metástases em várias linhas celulares de cancro [12] – [15]. ERK1 /2 bloqueador, PD98059 resultou numa redução do crescimento celular e capacidade invasiva no cancro da próstata. Em células de Leydig MA-10, hCG desencadeada transiente ERK1 2 activação /via de proteína cinase a montante A (PKA) [12]. Além disso, a hCG também induz a fosforilação de ERK1 2 /de um modo independente em PKA-endométrio e está envolvido na carcinogénese [13], [14]. Além disso, há evidências de que as metaloproteinases da matriz expressão (MMP) foi regulado por ERK1 /2 em carcinomas invasivos. Estudos mostraram que a ERK1 activado /2 regulada a actividade das MMPs que conduzem à matriz extracelular (ECM) e a degradação da motilidade celular [13] – [15]. Muitos MMPs são considerados como proteases essenciais na degradação e remodelação de ECM [16]. Relatório mostrou que a hCG estimulou a secreção de MMP-2 e MMP-9 de um modo dependente da dose em células citotrofoblástica [17]. Além disso, a hCG upregulated actividade de MMP-2 e promoveu a motilidade celular em SGHPL-5 linhas de células [18]. No cancro da próstata humano, actividade aumentada de MMP-2 e MMP-9 contribuiu para a invasão tumoral e metástase [19] – [21]. Estudos mostraram que a vitamina D e vitamina D analógico ZK191784 downregulated MMPs para inibir a invasão no cancro da próstata [22] – [24]. Sem dúvida, as MMPs são os alvos importantes anti-invasão. Por isso, propomos que hCGβ pode aumentar ERK1 2 fosforilação /e mais upregulate MMPs para promover a motilidade celular.

Por isso, aqui vamos investigar hCGβ-desencadeada caminhos e a ligação entre a expressão hCGβ e motilidade celular sinalização. Através deste estudo, esperamos que vamos encontrar novas pistas na terapia molecular para tratar câncer de próstata.

(A) Análise quantitativa do mRNA hCGβ e transcrição de mRNA β-actina em DV e células DH por PCR em tempo real . celular DU145 transfectadas com vector vazio;: DV DH: células DU145 transfectadas com cDNA hCGβ construir. Note-se que hCGβ ARNm foi altamente expresso em relação ao controlo. (B) Análise de expressão de proteína hCGβ por Western blot. β-actina foi utilizada para o carregamento igual e normalização. Os resultados indicaram que hCGβ foi altamente expressa em células de DH. *, Indica

P 0,05

contra células controle DV. Os dados foram apresentados como médias ± SEM de três testes separados.

Materiais e Métodos

Materiais

HCGβ normas foram adquiridos da Abcam (Hong Kong). A construção pVSneo-hCGβ contendo ADNc hCGβ foi adquirido a Stratagene (La Jolla, CA). As enzimas de restrição Sall, Xhol, EcoRI, BamHI, HindIII e ADN-ligase de T4, células competentes são os produtos da Invitrogen (Carlsbad, CA). G418 e violeta de cristal foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). cancro da próstata humano DU145 e PC3 (para ser um backup) células eram os produtos da cultura na Colecção Americana de típica (Rockville, MD). As células foram cultivadas em meio DMEM (Hyclone), complementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen), 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C, 95% de ar e 5% de CO

2. placas Transwell com inserções de interiores ou membranas basais artificiais foram comprados de BD Biosciences (Bedford, MA). Anti-hCGβ foi de BioDesign International (Saco, ME); anti-ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 e anti-MMP-2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc (Xangai, China).

A transfecção

Via transfecção, nós linha de células estável estabelecida superexpressão hCGβ em células DU145. O controlo do vector pVSneo-vector foi feita cortando ADNc hCGβ por enzimas de restrição e, em seguida, primeiro autoligation como descrito anteriormente [11]. As células foram semeadas em placas de seis poços com DMEM meio de crescimento. Quando as células vir a 90% de confluência, as construções contendo o pVSneo-hCGβ ou pVSneo vector foram transfectados em células DU145 seguinte reagente de transfecção HD FuGene (Roche, EUA) e as instruções do fabricante. Depois as células foram incubadas a 37 ° C durante 48 horas, as células foram digeridos por tripsina-EDTA e cultivadas no meio de seleco contendo G418 (1,2 mg /mL). Além disso, as células foram incubadas durante mais duas semanas. As células sem integração de gene hCGβ estavam mortos e flutuando no meio e as colónias individuais que expressam de forma estável hCGβ foram recolhidos. As células foram cultivadas triadas em meio de selecção (600 ug /ml de G418) para mais de duas semanas até que não há células mortas foram encontrados. As células seleccionadas foram mantidas em meio contendo 600 ug /ml de G418 para outro ensaio. Nós conseguiu estabelecer linhas celulares estáveis ​​no trabalho anterior [11]; aqui utilizou-se um novo reagente de transfecção para reforçar a eficiência da transfecção.

-PCR em tempo real

As células foram cultivadas como os procedimentos de rotina no meio de cultura. Em seguida, o RNA total foi isolado utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen, EUA). HCGβ ADNc foi feita utilizando Transcriptase Reversa kit (Takara, China) com 1,5 ug de ARN total seguindo as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizada num instrumento Stratagene Mx3000P. Para os ciclos térmicos em tempo real, aliquotas em triplicado de ADNc foram utilizados numa mistura de reacção contendo 250 nM de cada iniciador num volume reaccional de 25 ul por o kit de reagentes PrimeScriptTM RT (Takara, China). O programa de ciclos de PCR foi realizada com um passo predenaturation inicial a 94 ° C durante 60 s, em seguida, com um ciclo 40 de passos de amplificação, a 94 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 20 s. Os iniciadores foram os seguintes:

hCGβ (para a frente): 5′-TCTGTGCCGGCTACTGCCCC-3 ‘;

hCGβ (reverso): 5′-TTGGGACCCCCGCAGTCAGT-3′;

β-actina (para a frente): 5′-AACTCCATCATGAAGTGTGACG -3 ‘; . Β

β-actina (reverso): 5′-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3 ‘

Os dados foram coletados e analisados ​​seguindo as instruções do manual do fabricante

ELISA

..

HCGβ é uma proteína secretada, que pode interagir com alguns receptores, tais como o receptor da hormona luteinizante, etc, para desempenhar um papel no desencadear as vias de sinalização. Portanto, precisamos ter certeza de que expresso hCGβ foi secretada no meio celular. Após as células DU145 estáveis ​​foram cultivadas até 70% de con fl uency no meio de cultura, as células foram lavadas por três vezes com meio DMEM isento de soro. Em seguida, as células foram cultivadas em meio DMEM isento de soro a 3, 6, 9, 12 e 24 h. O meio foi recolhido nos pontos de tempo indicados e o ELISA foi realizado para testar secretado hCGβ através de um kit de β-hCG ELISA (DRG Diagnostics, New Jersey, EUA) seguindo as instruções do fabricante. No estudo anterior, conseguimos detectar a secreção hCGβ em células hCGβ transfectadas através de um Kit de detecção hCGβ, F-hCGβ ccubind ELISA, de Monobind (Costa Mesa, CA) [11]. A fim de reproduzir e confirmar estes resultados, foi utilizado um kit β-hCG ELISA para determinar a secreção hCGβ.

Immunoblotting

Depois que as células DU145 foram cultivados durante o tempo necessário, as células foram recolhidas e lisadas com tampão de lise (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, inibidores de 0,1% de SDS, 1% de desoxicolato de sódio e de protease, Thermo Scientific, EUA). O lisado celular foi centrifugado a 18000 g durante 20 min. concentrações de proteína total foram testados pelo kit de ensaio de proteína BCA (Invitrogen). Oitenta por micrograma de proteína foi carregada em 10% de gel SDS-PAGE e correr para o tempo necessário, dependendo do peso molecular, em seguida, transferidos para membranas de nitrocelulose através de transferência semi-seca. As membranas foram bloqueadas em BSA a 1,5% em tampão de TBS-T durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave, em seguida, foram incubadas com anticorpos primários separadamente, a 4 ° C, durante a noite. Depois de se lavar com TBST 3 × 10 minutos cada, as membranas foram sondadas com o anticorpo secundário marcado com fluorescência (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE) durante 1 h à temperatura ambiente. Após três lavagens, as membranas foram verificados nos canais 700 ou 800, utilizando o infravermelho Imaging System Odyssey (LI-COR Bioscience, Lincoln, NB, EUA). β-actina foi utilizada para o carregamento igual e normalização. Os anticorpos foram diluídos apropriadamente.

Gelatina zimografia

Após a PD98059 ERK1 /2 bloqueador (25 uM) foi aplicada para o tratamento de células DU145, durante 2 h, que mudou o meio DMEM soro bovino fetal a 10% em meio isento de soro, e cultivadas durante 24 horas. Meio com hCGβ segregada foi colhido a partir de um número igual de células e misturado com uma quantidade igual de tampão de amostra não reduzida. Os volumes iguais de meio foram sujeitas a electroforese em géis de 10% SDS-poliacrilamida contendo 1 mg /ml de gelatina como um substrato de protease. O gel foi lavado em 2,5% de Triton solução X-100 à temperatura ambiente com agitação suave e foi embebido em tampão (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,2 M, CaCl 5 mM de

2 · 2 H

2O, e 0,02% de Brij-35, pH 7,6) a 37 ° C durante 42 horas. Após a incubação, o gel foi corado durante 30 min com solução de coloração (0,5% de Azul Brilhante de Coomassie, 25% de isopropanol e 10% de ácido acético). Em seguida, o gel corado foi descorado com uma solução adequada de Coomassie R-250 de descoloração (50% de metanol, 10% de ácido acético). Na área com metaloproteinases da matriz, bandas claras contra um fundo azul escuro vai aparecer. Para mostrar o carregamento igual, um gel SDS paralela foi executado para testar MMP-2 e β-actina via Western blot.

celular Motilidade Ensaios

migração de células de câncer de próstata foi feito de 24 poços placa com câmara interna; o fundo da câmara tem 8 mm poros. Total 1 × 10

5 células foram semeadas na câmara superior com meio isento de soro de 500 ul, e 1 ml de meio DMEM com soro bovino fetal a 10% foi adicionado na câmara inferior. Depois que as células foram cultivadas durante 6 horas, as células na câmara superior foram removidas com um cotonete. As células migradas (ou pseudopodia) na parte inferior da câmara foram fixadas com metanol a 100% durante 10 min a -20 ° C, e depois coradas com solução de violeta cristal a 0,5% à temperatura ambiente durante 10 min. Depois de se afastar a solução de violeta de cristal, as células foram enxaguadas com água destilada até que não haja excesso de corante foi visualizada. As células migraram ou pseudópodos foram fotografadas e contadas a partir de 5 áreas seleccionadas aleatoriamente; as imagens foram fotografadas com a câmera com um microscópio Leica DM IRB no × 200 ampliação. ensaio de invasão foi realizada pela invasão do sistema (8 de poro, BD BioCoat) tumor. A parte inferior da inserção de cultura de células foi revestido com membrana basal artificial revestido com matrigel. membrana basal é células epiteliais subjacentes matriz extracelular finas. Matrigel é um produto comercial extraído a partir de um sarcoma de rato rico em proteínas da matriz extracelular. O principal componente é a laminina, seguido de proteoglicanos e colagénio IV de sulfato de heparina. Os outros procedimentos são os mesmos que no ensaio de migração.

Análise estatística

Os dados foram submetidos a uma análise de variância com o pós-teste para comparação entre os grupos específicos. Os dados foram expressos como média ± SEM e analisadas para significância estatística pela análise de variância (ANOVA). foram usadas as correcções de Bonferroni para comparações múltiplas contra um único grupo.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. O número mínimo de experiências repetitivas era 3.

Resultados

HCGβ Expressão

Primeiro construímos um vetor de controle, como descrito anteriormente; em seguida, as células DU145 foram transfectadas com as construções quer com ou sem cDNA hCGβ. Após o estabelecimento de linhas celulares estáveis, as células foram mantidas em meio contendo 600 ug /ml de G418 para estudos posteriores. Para testar hCGβ expressão em células DU145 transfectadas, quer PCR em tempo real e Western blot foram usadas para determinar o ARNm e a expressão da proteína após as células foram incubadas durante 24 horas, respectivamente (Figura 1A, Figura 1B). Estes resultados mostraram que hCGβ foi altamente expressa tanto em ARNm e os níveis de proteína em comparação com células transfectadas (DV) DU145 vazio do vector. Ou hCGβ mRNA ou a quantidade de proteína era pequena nas células de controle, nas condições experimentais

HCG Secreção

ELISA mostrou que hCGβ foi secretada no meio tremendamente em 24 horas.; a quantidade era de até 150 ng /ml (Figura 2). A quantidade de secreção hCGβ foi aumentada por tempo de incubação. Note que nós estabelecemos uma linha celular estável superexpressão hCGβ. HCGβ pode desempenhar um papel importante na sinalização entre as comunicações extracelulares e intracelulares.

Os dados mostraram que não foi hCGβ secretada para o meio celular. Além disso, o nível de hCGβ secretada para o meio aumentou com o tempo após as células hCGβ transfectadas foram incubadas por 3, 6, 9, 12 e 24 h.

HCGβ Activado ERK1 /2

padrões HCGβ foi aplicado para o tratamento de células DU145 não-transfectadas em doses de 25, 50, 100 e 200 ng /ml durante 24 h, Western blot mostrou que a ERK1 /2 foi aumentada após uma tendência dependente da dose, e ERK1 /2 fosforilação veio para o pico com um tratamento de 200 ng /ml hCGβ (Figura 3A). Consequentemente, nós células tratadas, a 0 (CON, controlo), 5, 15, 30 e 60 minutos para determinar a fosforilação de ERK1 2 /. Os resultados mostraram que a ERK1 /2 fosforilação seguiu uma forma dependente do tempo e veio de pico aos 30 min de tratamento com 200 ng /ml hCGβ (Figura 3B). Além disso, a ERK1 /2 fosforilação foi significativamente maior no hCGβ transfectadas células DU145 (DH) em relação às células de controlo. No entanto, PD98059 (25? M), um bloqueador específico, impediu a fosforilação de ERK1 2 /significativamente contra células não tratadas (Figura 3C). Note-se que a activação de ERK1 hCGβ causada /2 seguinte maneiras dose e dependente do tempo.

(a) temos demonstrado que a concentração de 200 ng /ml padrões hCGβ induzida invasão de células [11]. Assim, aqui tratamos células não transfectadas DU145 com diferentes doses de 0, 25, 50, 100, e 200 ng /ml hCGβ durante 1 h. Western blot mostrou que as normas hCGβ fosforilada ERK1 /2 em uma tendência dependente da dose. Na concentração de 200 ng /ml, a ERK1 /2 de activação atingido o pico. células DU145 (B) não transfectadas em meio isento de soro foram tratadas com 200 ng /ml hCGβ durante 0, 5, 15, 30 e 60 min. Western blot mostrou que hCGβ activada de ERK1 /2 de uma forma dependente do tempo. No ponto de tempo de 30 min, ERK1 /2 fosforilação atingiu o pico e depois caiu. (C) As células foram pré-tratadas com PD98059 (25 uM) de 30 min e, em seguida, incubadas durante 24 h em meio isento de soro, de Western blot mostrou que hCGβ activada de ERK1 /2, PD98059, mas diminuiu 2 activação /ERK1. *, Indica

P 0,05

contra DV. Os dados foram apresentados como médias ± SEM de três testes separados.

HCGβ Induzida por MMP-2 Expressão através da activação de ERK1 /2

MMP-2 foi demonstrado estar envolvida na célula cancerosa migração e invasão. Aqui nós investigamos induzida hCGβ expressão de MMP-2 nas células DU145 hCGβ não-transfectadas. normas HCGβ foi adicionado para o meio isento de soro, com as doses de 0 (CON, controlo), 25, 50, 100 e 200 ng /ml. Western blot mostrou que hCGβ aumentada de MMP-2 de expressão de uma forma dependente da dose, a MMP-2 foi aumentada para atingir o pico quando tratados com 200 ng /ml hCGβ (Figura 4A). Além disso, as células tratadas com PD98059 (25 uM), os resultados mostraram que a MMP-2 em células DH expressão foi notavelmente regulados negativamente (Figura 4B), indicando que a MMP-2 resultou regulação positiva de ERK1 2 fosforilação /.

(a) Foram tratados células não transfectadas DU145 com 0, 25, 50, 100, e 200 ng /ml hCGβ durante 1 h, Western blot indicou que os padrões hCGβ upregulated MMP-2 de um modo dependente da dose, na concentração de 200 ng /ml, a MMP-2 de expressão atingiu o pico. (B) Foram tratados células DH e DV, com ou sem PD98059 (25 uM) de 30 min e, em seguida, incubadas durante 24 h com meio isento de soro, de Western blot mostrou que hCGβ upregulated expressão da MMP-2 e PD98059 aboliu os aumento. Os tamanhos para Pro-MMP-2 e MMP-activo-2 são 72 Kd e 64 Kd, respectivamente. *, Indica

P 0,05

versus controlo. Os dados foram apresentados como médias ± SEM de três testes separados.

HCGβ aumento da MMP-2 Actividade através da activação de ERK1 /2

ensaio Gelatina zimografia mostraram que a atividade MMP-2 foi reduzida por PD98059 (25? M) (Figura 5), ​​indicando que hCGβ activada MMP-2 através de ERK1 2 fosforilação /.

recolhidos a forma condicional a partir do tratamento acima para o ensaio foi geltin zimografia como os métodos. Os resultados mostraram que o aumento da actividade hCGβ MMP-2 e PD98059 reduziu esses efeitos. *, Indica

P 0,05

versus controlo. Os dados foram apresentados como médias ± SEM de três testes separados. O painel inferior do gel imagens mostraram um carregamento igual que um gel SDS paralela foi executado para testar β-actina via Western blot.

HCGβ aumento da motilidade celular via ERK1 /2 fosforilação

no estudo anterior, demonstramos que hCGβ induzida migração de células de câncer de próstata e invasão. No presente estudo confirmou ainda como hCGβ induzida de célula migratória e comportamentos invasivos. Para saber se hCGβ motilidade celular induzida resultou de ERK1 fosforilação 2 /, os ensaios de migração e invasão foram conduzidas com ou sem PD98059 (25 uM). Os métodos exatas foram como descrito nos Métodos. Os resultados mostraram que hCGβ aumentou significativamente tanto a migração celular e invasão; mas PD98059 diminuiu significativamente estes efeitos (Figura 6A, Figura 6B). Note-se que exactamente hCGβ acelerou a migração celular e invasão por meio de ERK1 2 fosforilação /.

(A) foi semeado 1 × 10

5 as células em uma placa de 24 poços com pastilhas de células, as células foram adicionadas com /sem PD98059 (25 | iM) durante 6 h para detectar a migração de células, os resultados mostraram que hCGβ promove a migração de células de forma significativa em relação ao controlo. (B) Nas mesmas condições que incubadas as células na câmara de invasão com membrana basal artificial, as células foram adicionadas com /sem PD98059 (25 uM) durante 12 h, para se detectar a invasão de células, os resultados mostraram que hCGβ promove a invasão de células de forma significativa. Todos os procedimentos foram realizados como descrito nos Métodos. *, Indica

P 0,05

versus controlo. Os dados foram apresentados como médias ± SEM de três testes separados.

Discussão

contas de câncer de próstata para 29% de todos os cancros nos homens [25]. células de cancro da próstata têm uma tendência marcante para metástase, e metástase é a maior causa de mortalidade em doentes com cancro [26]. Portanto, é necessário para localizar e caracterizar os alvos moleculares para inibir a invasão e metástase através de direccionamento génico.

HCGβ é um marcador importante de transformação maligna. Quase todos os cancros humanos produz hCGβ em certa medida [27]. Estudos mostraram que hCGβ promove a proliferação de células de cancro e pode também promover metástases. Por exemplo, Laurence Um Cole descoberto que hCGβ pode competir com um TGF-p de se ligar um receptor de TGF-p, como um antagonismo do receptor de TGFp para controlar a apoptose e promover a invasão por metaloproteinases de activação [28]. Além disso, outro relatório mostrou que hCGβ e VEGF desempenhar um papel coordenada através de suas propriedades angiogênicos e invasivos no desenvolvimento de adenocarcinomas de Barrett [29]. Através dos resultados acima podemos inferir que hCGβ pode desempenhar um papel importante no cancro de promoção através de múltiplas vias de sinalização. Assim, é essencial para investigar hCGβ-desencadeada em vias de migração e invasão do tumor sinalização.

No estudo anterior demonstrou-se que a morfologia das células mudou hCGβ cancro, acelerar a motilidade celular, regulação negativa de inibição de migração da proteína E-caderina, promover a migração do cancro da próstata humano e invasão [11]. No entanto, os mecanismos adicionais que causam migração e invasão manter desconhecido. No presente estudo, verificou-se que algumas vias de sinalização foram relacionados com migração e invasão. Aqui demonstramos que hCGβ upregulated ERK1 /2 e MMP-2, levando a célula a migração e invasão. Usando a ERK1 /2 fosforilação bloqueador PD98059, descobrimos que a MMP-2 resultou regulação positiva de ERK1 /2 fosforilação. ERK1 /2 têm provado contribuir para tumor a proliferação, migração e metástase, e vários estudos mostraram que a hCG promoveu a activação de ERK1 /2 em alguns tipos de células [30], [31]. Obviamente, estes resultados são consistentes com os resultados que a hCG induzida ERK1 fosforilação 2 /em uma dose e dependente do tempo em células DU145 maneiras. A via de ERK relacionados é uma das vias de sinalização mais críticos na ocorrência de tumor, desenvolvimento e expansão clonal. Particularmente, a MMP-2 é a molécula-chave na invasão tumoral. Nossas descobertas que hCGβ activadas MMP-2 através de ERK1 fosforilação 2 /em células DU145 são muito importantes. Estes resultados não só revelou a relação entre hCGβ e câncer, mas também indicou que encontramos um caminho chave romance para inibir câncer. Obviamente, o /ERK1 /2 /MMP-2 via hCGβ é vital na invasão do tumor, pelo menos no cancro da próstata. Por outras palavras, verificou-se abordagens mais úteis para inibir a invasão do tumor, e ainda que podem desenvolver drogas alvo molecular.

de hCG é composto por duas subunidades, hCGα e hCGβ. Estas duas subunidades fazer um complexo, que se liga ao receptor da hormona luteinizante e desencadeia vias de sinalização. No entanto, não sabemos se hCGβ também se liga ao receptor da hormona luteinizante separadamente. Este estudo nos deu a nova pista e vai empurrar-nos caracterizar hCGβ receptor específico.

Além disso, MMPs foram considerados para ser moléculas que promovem a metástase com muitos tipos de isoformas. Eles têm potencial para degradar a membrana matriz e cave extracelular. MMP-2 tem sido implicada ser um membro chave em MMPs. Mais, a ERK1 /2 pode translocar para o núcleo e activar o factor de transcrição AP alguns-1 para regular a transcrição de genes [32]. AP-1 localiza-se na região promotora a MMP-2 do gene de MMP-2, assim, a ERK1 /2 pode promover a MMP-2 a transcrição e libertar [33], [34]. Assim, a fim de investigar o papel de ERK1 /2 em regulando a migração e invasão celular, determinou-se com êxito a expressão de MMP-2 e actividade. Descobrimos que hCGβ aumentou significativamente MMP-2 expressão e atividade. Estes efeitos foram extremamente reprimida por PD98059 em hCGβ transfectadas DU145 células. Estes resultados mostraram uma diafonia entre ERK1 /2 e a MMP-2. Coincidentemente, também descobrimos que hCGβ promovido ERK1 2 fosforilação /e expressão de MMP-2 seguindo os mesmos padrões de dose e do tempo. Estes resultados indicaram que hCGβ desencadeada ERK1 2 activação /resultou na supra-regulação da MMP-2 e o aumento da actividade de MMP-2. Consequentemente, hCGβ-causado migração e invasão resultou de ERK1 2 activação /. No entanto, não temos provas suficientes se hCGβ-causado MMP-2 regulação positiva desempenha um papel importante na migração e invasão. Transfecção com MMP-2 construção e bater para fora do estudo MMP-2 pode ajudar a responder a estas perguntas. Melhor caracterização da sinalização hCGβ vai ajudar-nos a encontrar mais marcadores metástase para atender às exigências terapêuticas.

Na verdade, alguns especialistas começaram a pesquisa sobre anticorpos relacionados hCGβ no campo de câncer [35], [36]. Aqui descobrimos que hCGβ fosforilada ERK1 /2 e mais upregulated MMP-2 para aumentar a motilidade câncer em células cancerosas da próstata. Nossos resultados podem dar novos insights sobre os mecanismos moleculares de regulação hCGβ, e fornecer uma base mais forte para a investigação relacionada com hCGβ sobre o agente supressor de tumor.

Nós encontramos alguns novos alvos moleculares para inibir a invasão e metástase de câncer de próstata Câncer. O tratamento eficaz do câncer de próstata é de grande importância. Bloqueio de sinalização hCGβ é uma estratégia terapêutica potencial para tratar o câncer de próstata e outros cânceres. Além disso o trabalho precisa para caracterizar receptor hCGβ; desenvolvimento de bloqueadores de sinalização hCGβ será um campo potencial para reduzir invasão e metástase.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Ameae Walker, da Universidade da Califórnia, em Riverside para sua espécie direção no desenho original do projeto . Agradecemos também o Dr. Tao Jiang, Hospital Tiantan, Capital University Medical por sua ajuda nos experimentos.