Abstract

O antiapoptótico membro da família Bcl-2 Mcl-1 é um proteína PEST (contendo sequências enriquecidas em prolina, ácido glutâmico, serina, treonina e) e está sujeita a uma rápida degradação através de várias vias. degradação prejudicada levando à manutenção de Mcl-1 expressão é um importante determinante da resistência aos medicamentos em câncer. A fosforilação em Thr 163 na região PEST, estimuladas por ácido acético 12-O-tetradecanoilforbol (TPA) induzida por activação de extracelular quinase regulada por sinal (ERK), está associada com Mcl-1 de estabilização em células de linfoma de Burkitt BL41-3. Isto contrasta com a observação de que a fosforilação Thr 163 em fibroblastos normais primos glicogénio sintase quinase (GSK3) fosforilação induzida pelo Ser 159, produzindo um phosphodegron que tem como alvo de Mcl-1 para a degradação. Nos presentes estudos de acompanhamento em células BL41-3, Mcl-1 degradação foi encontrado para ser independente da via mediada por GSK3, proporcionando um paralelo com descobertas emergentes mostrando que Mcl-1 degradação através desta via é perdida em muitos tipos diferentes de câncer. Apreciação em células CHO Mcl-1-transfectadas em células corroboram os BL41-3 em que o alvo phosphodegron-GSK3 não desempenhar um papel importante na degradação de Mcl-1, e uma mutação T163E marcada phosphomimetic resultou em Mcl-1 de estabilização. TPA-tratada BL41-3 células, para além de exibirem Thr 163 fosforilação e de Mcl-1 de estabilização, exibiu um aumento de ~ 10 vezes na resistência a vários agentes quimioterapêuticos, incluindo Ara-C, o etoposido, a vinblastina, ou cisplatina. Nestas células cancerosas em que Mcl-1 degradação não é dependente da /via segmentados por phosphodegron, a activação de ERK de GSK3 e Thr 163 fosforilação estão associados com pronunciada Mcl-1 de estabilização e de resistência aos medicamentos – efeitos que pode ser suprimida pela inibição da activação de ERK .

Citation: Nifoussi SK, Vrana JA, Domina AM, De Biasio A, Gui J, Gregory MA, et al. (2012) Thr 163 fosforilação Causas Mcl-1 Estabilização quando a degradação é independente da Adjacente Phosphodegron Targeted-GSK3, promovendo resistência aos medicamentos em Câncer. PLoS ONE 7 (10): e47060. doi: 10.1371 /journal.pone.0047060

editor: Justin L. Mott, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de junho de 2012; Aceito: 07 de setembro de 2012; Publicação: 09 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Nifoussi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (R01 CA 057.359 para RWC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

expressão

Aumento de Mcl-1, estimulada por factores de crescimento e outros sinais ambientais, promove a viabilidade e permite a amplificação e a função dos tipos de células e linhagens necessário pelo organismo [1] – [4]. Mcl-1 regulação negativa, por sua vez, inibe estes processos e induz a morte de células danificadas, não funcionais, ou senescentes [1], [5] – [7]. Manutenção de elevados de Mcl-1 de expressão está associado com resistência a drogas e mau prognóstico em uma variedade de cancros [8] – [15]. Agentes que induzem Mcl-1 volume de negócios, e inibidores desenhadas para combater a proteína, pode promover a morte de células tumorais [16] – [20].

Mcl-1 foi identificado com base no aumento da transcrição no ML-1 mieloblástica humana células de leucemia induzidas para se diferenciarem após exposição a TPA [21], [22]. Mcl-1 também é regulada pós-tradução (Fig. 1A), conforme observado na linha celular de linfoma de Burkitt BL41-3 em que endógena Mcl-1 é amplificado e sobre-expresso [1], [23], [24]. Mcl-1 é uma proteína PEST e está normalmente sujeita a rotatividade. No entanto, a exposição de células a TPA BL41-3 resulta na activação da ERK MAP quinase (MAP), juntamente com um aumento dependente da ERK em Mcl-1 fosforilação em Thr 163 e retardou acentuadamente a degradação da proteína de Mcl-1 [25], [26].

os locais de fosforilação em Thr 163 e Ser 159 na proteína de Mcl-1 humano está esquematizado. Thr 163 é sujeito a fosforilação por cinases de MAP, como pode ser visto depois da activação de ERK induzida por TPA em células BL41-3. Ser 159 é sujeito a fosforilação pela GSK3. Mcl-1 é uma proteína PEST sujeita a rotatividade, a meia-vida de decadência sendo ~ 3 horas em BL41-3 células (ponteado de menor contra o maior densidade indica pobres PEST e sequências PEST potenciais; PESTFIND). No entanto, Mcl-1 exibe notáveis ​​estabilização após a activação de ERK induzida por TPA e Thr 163 fosforilação nestas células. Mcl-1 está também sujeita a uma outra modificação pós-tradução envolvendo truncagem da extremidade N-terminal ([28] indicada com uma seta). Isso resulta em um dupleto 42/40 kD estreitamente espaçadas, em que a banda de 40 KD inferior carece -16 resíduos de aminoácido e é a banda mais abundante presente nas células BL41-3. O dupleto é melhor visualizado em geles de grandes dimensões formato de electroforese (Fig. S1B), mas por vezes pode ser detectado em géis de padrão (Fig. 1C). Como Thr 163 fosforilação não impede que o truncamento do terminal N, Mcl-1 na presença de estabilização do presente fosforilação é visto como decaimento retardado da banda de 40 KD. B: células BL41-3 eram ou não tratada ou expostos a TPA (5 nM) durante os tempos indicados, e monitorizadas quanto à expressão de Thr 163 fosforilada Mcl-1 (Mcl-1 PT163), total de Mcl-1, a ERK fosforilada (pERK ), e GAPDH (ChemiDoc). Todas as amostras foram executadas ao mesmo tempo e submetido à mesma exposição autoradiográfica, onde a linha vertical preto nesta e as figuras subsequentes indica que as pistas foram rearranjadas para facilitar a comparação. Thr 163 também fosforilação foi induzida por concentrações mais baixas de TPA (por exemplo, 1 nM; Fig. S1C), e foi inibida pelo U0126 (Fig S1D.). m C: células BL41-3 ou foram deixadas sem tratamento ou expostos a TPA (1 nM). Algumas células foram imediatamente expostas a CHX para monitorar Mcl-1 decaimento proteína no dia 0. As células adicionais foram tratados com TPA incubados durante 24 horas (dia 1 após a adição de TPA) e, em seguida, expostos a CHX, em que uma parte destas células foi recuado com TPA neste momento. A amostra de células não tratadas (Tempo 0) é idêntico para cada par de transferências de Western. A mancha no fundo confirmou que vantagem foi reduzida a 24 horas

Mcl-1 também está sujeito a fosforilação da GSK3 por [20], [27] -. [34]. Na verdade, a fosforilação induzida por cinase de MAP em Thr 163 fornece um sítio de iniciação para a fosforilação induzida por GSK3 em Sor 159, como tem sido demonstrado em fibroblastos de ratinho normais expostos à luz ultravioleta (UV) [27]. Neste sistema, a fosforilação no local da fosforilação da quinase MAP (Thr 163) é levada a cabo por quinase c-Jun N-terminal (JNK); subsequente fosforilação no local de fosforilação da GSK3 (Ser 159) resulta na produção de um phosphodegron que tem como alvo de Mcl-1 para a degradação por ubiquitina ligases E3 contendo proteínas da caixa-F [28], [32] – [34]. Mcl-1 também pode ser degradado por uma variedade de outras vias, tais como por meio do BH3 contendo E3 MULE ubiquitina-ligase (também chamado Arf-BP /Lasu1 /Huwe1 [35], [36]), a anafase promover complexo [37 ], e mecanismos independentes de ubiquitina [38].

Emerging resultados indicam que a redução na Mcl-1 degradação pela via induzida pela GSK3 acima contribui para a resistência a drogas em cancro. Por exemplo, GSK3 inativação em amostras de pacientes com câncer de mama está associado com abundante Mcl-1 expressão e de mau prognóstico [20], [32]. Da mesma forma, reduzida de Mcl-1 degradação pela via da GSK3 /alvo-phosphodegron tem sido implicado na leucemia linfocítica crónica [13], [39], [40]. Uma variedade de cancros resistentes a fármacos apresentam inactivação da proteína F-box FBW7, que se encontra a jusante dos eventos de fosforilação tais como aqueles induzidos pela GSK3 [33], [34]. Em outros casos, as células cancerosas exibem expressão aumentada de uma deubiquitinase [41].

Devido à importância de Mcl-1 em cancro, nós estudamos ainda mais a estabilização de Mcl-1 que ocorre após a activação da ERK induzida por TPA em células BL41-3. Nosso objetivo foi compreender melhor a constatação de que Thr 163 fosforilação está associada com Mcl-1 estabilização estas e outras células cancerosas [42], mas primos Mcl-1 para GSK3 /degradação segmentadas phosphodegron em fibroblastos normais [27]. Embora a fosforilação em locais adicionais podem estar envolvidos (por exemplo, Tre 92 [20]), isto não parece ser o caso em BL41-3 células [25]. Os resultados dos nossos estudos mostraram que a via mediada por GSK3 não desempenha um papel importante na degradação de Mcl-1 em células BL41-3. Isto contrasta com o que se observa nos fibroblastos normais, mas é paralelo as descobertas emergentes mostrando que Mcl-1 degradação através desta via é prejudicado frequentemente no cancro. A associação de Thr 163 fosforilação com Mcl-1 de estabilização nesta situação foi recapitulado em células CHO transfectadas, em que Mcl-1 degradação não foi afectada por uma mutação não-T163A fosforilável mas foi quase completamente bloqueada por uma mutação T163E phosphomimetic. Juntamente com a activação de ERK, Thr 163 fosforilação, e de Mcl-1 de estabilização, TPA-tratada BL41-3 células exibiram acentuadamente um aumento da resistência à apoptose por indução aquando da exposição a drogas quimioterapêuticas. No entanto, a sensibilidade ao fármaco foi parcialmente restaurada por um inibidor da activação de ERK. Em contraste com as células normais, onde Thr 163 fosforilação pode promover a GSK3 /Sor 159 Mcl-1 degradação e morte, em células de cancro em que Mcl-1 não é degradado por esta via, a activação de ERK e Thr 163 fosforilação segmentados por phosphodegron estão associados com reduzida Mcl-1 e degradação notável resistência às drogas. A inibição da ativação ERK /Tre 163 fosforilação representa uma abordagem promissora para a promoção de Mcl-1 degradação e de sensibilidade às drogas nessas células cancerosas.

Métodos

linhas celulares e Tratamentos

BL41 -3 células foram derivados como uma sub-linha de células de linfoma de Burkitt BL41, tal como descrito [23], e foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo 7,5% de FBS. Os derivados 5A-HSmyc células CHO [43] [44], foram mantidas em meio alphaMEM contendo 5% de FBS. O rato AKR-2B linha de fibroblasto embrionário era de M. J. Getz (Mayo Foundation, Rochester, MN) [45], e foi cultivado em meio 5A de McCoy contendo 5% de FBS. TPA foi de Alexis Biochemicals, LiCl, ciclo-heximida, LY294002, etopósido, vinblastina, cis-diaminodicloroplatina (II) (cisplatina), wortmanina, e citosina-arabinósido (Ara-C) eram da Sigma, U0126 foi de EMD Chemicals, e NaCl a partir de Fisher Scientific.

Mcl-1 constrói e transfecção

Mcl-1 construções de expressão estavam no 3.1 vector pcDNA [25] contendo um marcador de resistência neo. O WT-se Mcl-1, Mcl-1-T163A, e Mcl-1-T162A construções têm sido descritos, e de Mcl-1-T163E e Mcl-1-S159A foram preparados usando os mesmos métodos de [25], com os seguintes iniciadores . Para MCL-1-T163E (iniciador superior) 5′-GGTCACTACCCTCGGAGCCGCCGCCAGCAG-3 ‘e (iniciador inferior) 5′-CTGCTGGCGGCGGCTCCGAGGGTAGTGACC-3′, e para o LCM-1-S159A (iniciador superior) 5’-CGGACGGGGCACTACCCTCGACGCCGCCGC-3 ‘e ( iniciador inferior) 5’-GCGGCGGCGTCGAGGGTAGTGCCCCGTCCG-3 ‘. A transfecção foi realizada com Effectene (Qiagen) ou Lipofectectamine 2000 (Invitrogen), utilizando células plaqueadas no dia anterior.

análise de Western

condições de Western blotting que detectam a proteína de Mcl-1 humana têm foi descrito [25], [43], em que qualquer reactividade cruzada com a proteína de hamster chinês é visto. géis de eletroforese de tamanho padrão foram utilizados, excepto quando indicado em géis de grande formato que separam o gibão Mcl-1 foram utilizados. Para a monitorização de Mcl-1 de decaimento em células CHO, as células foram novamente plaqueadas para meio fresco no dia após a transfecção e expostos a CHX (20-25 microgramas /ml) 24 horas mais tarde [30]. Para BL41-3 células foi usada uma concentração de 2,5 microgramas /ml CHX [25]. A ChemiDoc sistema Imagem Molecular (BioRad) tornou-se disponível e foi usado para algumas experiências, o que permitiu a estimativa de mudanças no Mcl-1 expressão. Estas alterações foram calculadas como uma diminuição de Mcl-1 em relação à expressão de células de controlo não tratadas em paralelo. Embora um anticorpo dirigido contra útil de Mcl-1 phosphoThr 163 não está disponível comercialmente, uma pequena quantidade do anticorpo descrito anteriormente estava disponível [46].

Pulso /perseguição

35S-Met Etiquetagem

métodos anteriormente descritos [24] – [26]. Resumidamente, um dia após o plaqueamento, as células foram lavadas 3 vezes e incubadas com meio RPMI em meio isento de metionina contendo FBS dialisado a 5% e tampão HEPES 25 mM. As células foram marcadas com impulsos-transcrição

35S-Met durante 2 horas, e, em seguida, triturou-se com meio de alphaMEM contendo FBS a 5% e um 15 mg /ml de L-metionina adicional. Após a colheita e a lavagem duas vezes com PBS em gelo, o sedimento foi lisadas por passagem através de uma seringa em tampão de lise [tampão de lavagem (KCI 142,5 mM, MgCl 5 mM de

2, EGTA 1 mM em 20 mM Tris-Cl, pH 7,4 ) contendo 0,2% de Nonidet P-40 e protease e fosfatase Sigma inibidor cocktails]. O sedimento foi incubado durante a noite no frio com um anticorpo antiMcl-(Santa Cruz S-19) conjugados com Dynabeads (Dynal, Noruega), lavadas duas vezes com tampão de lise, uma vez com tampão de lavagem, e submetido a electroforese SDS em gel de poliacrilamida. O gel foi fixado em ácido acético a 10%:. 30% de metanol, embebido em NAAMP 100 Amplify (Amersham Biosciences, Reino Unido), secou-se, e exposta a filme de raios-X e uma tela de PhosphorImager, este último sendo analisados ​​utilizando o software ImageQuant

Citometria de Fluxo

a citometria de fluxo foi realizada utilizando um anticorpo antiMcl-1 conjugado com FITC com o Fix . kit Perm (10.000 células analisadas de cada amostra)

a morte celular ensaios

As células apoptóticas como definidas inicialmente foram morfologicamente registados com Giemsa de Wright preparações Cytospin coradas (Shandon) Deslize [17], [47], [48]. clivagem de PARP foi testada por análise de Western blot utilizando o anticorpo total de PARP (Cell Signaling), e digitalização quimioluminescente das membranas utilizando o sistema ChemiDoc. intensidades de banda foram quantificados usando o programa Fiji (NIH ImageJ).

Análise estatística

A meia-vida de degradação de Mcl-1 proteínas codificadas (testada utilizando o sistema ChemiDoc) foi estimada por non regressão -linear usando Prism 5 (GraphPad Software). Outras análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SigmaStat.

Resultados

ERK Activation, Thr 163 fosforilação, e Estabilização do endógena Mcl-1 Proteína ocorrem logo após exposição de células BL41-3 para TPA e são, subsequentemente, regulada negativamente

BL41-3 células exibem expressão constitutiva abundante de endógena Mcl-1 (~ 5 vezes mais elevadas do que as células ML-1 estimuladas com TPA [23]), e provaram ser muito úteis para estudos de sua regulação pós-tradução. resultados da activação de ERK induzida por TPA em pequeno aumento adicional de Mcl-1 de expressão nestas células (Fig. S1A, B), ao contrário de ML-1 e outras células [17], [21], [22], [25], [26]. BL41-3 células são assim particularmente úteis para os estudos de TPA /Thr 163 fosforilação de ERK induzida por [24], porque os efeitos sobre a estabilidade da proteína pode ser analisada na ausência de Mcl-1 de indução substancial.

as experiências iniciais caracteriza-se ainda mais o sincronismo dos efeitos induzidos por TPA, uma vez que a activação de ERK é frequentemente transitória [17], [49]. a activação de ERK e aumento da fosforilação Thr 163 eram detectáveis ​​no espaço de 0,5 horas após a adição de TPA [24], [25] e mantidas durante cerca de 6 horas, a diminuir subsequentemente como monitorizado durante até 24 horas (Fig. 1B e a Fig. S1A). Para determinar se o declínio na ativação ERK e Thr 163 fosforilação visto após exposições prolongadas TPA seria refletida em um declínio na Mcl-1 de estabilização, acompanhámos Mcl-1 decadência tanto imediatamente após TPA adição e 24 horas depois. Quando CHX foi aplicada para inibir a síntese de proteínas, Mcl-1 degradação era quase completa no prazo de 7 horas (Fig. 1C, canto superior esquerdo) mas foi retardado aquando da aplicação concomitante de TPA (Fig. 1C, superior direito), como em estudos anteriores [ ,,,0],25]. No entanto, quando foi aplicado CHX 24 horas depois de TPA, Mcl-1 de estabilização foi atenuado (Fig. 1C, inferior esquerdo), embora pudesse ser restaurado através da aplicação de TPA adicional no momento (fig. 1C, inferior direito). Em suma, a ativação ERK, Thr 163 fosforilação, e Mcl-1 estabilização ocorrem eventos como início após a exposição das células BL41-3 a TPA, e estão todos posteriormente reprimidos. Estes resultados reforçam os achados anteriores, que tinham sugerido uma estreita associação entre estes efeitos induzida por TPA em que todos foram inibidos pela U0126 inibidor da via ERK ([25] e Fig. S1D).

Mcl-1 Degradação em células BL41-3 é

LiCl-insensitive

Mcl-1 pode ser canalizado para a degradação pela GSK3, e exposição a TPA resulta em GSK3 inativação em algumas células [29], [31], [32], [50 ], [51]. Por conseguinte, pareceu possível que induzida por TPA inactivação da GSK3 e inibição de Mcl-1 degradação através desta via pode explicar a estabilização visto em BL41-3 células. Como um meio de examinar esta possibilidade, sondadas quanto a um efeito da TPA sobre a expressão da beta-catenina alvo GSK3. O efeito do inibidor da GSK3 LiCl foi monitorizada em paralelo. O último agente serviu como um controlo positivo capaz de causar um aumento da expressão de beta-catenina (Fig. 2A pista 3, uma fotografia do meio). Nosso objetivo foi determinar se o TPA imitou o efeito de LiCl para produzir um aumento da expressão da beta-catenina, como isso seria sugestivo de um efeito sobre GSK3. . No entanto, TPA não pareceu ter um tal efeito na medida em que não aumentou a expressão de beta-catenina, na ausência de LiCl (Fig. 2A pista 2, meio fotografia)

a: células foram BL41-3 quer deixados sem tratamento ou expostos a TPA (20 nM) e /ou LiCl (20 mM, NaCl ou como um controlo). Após 18 horas, a expressão de Mcl-1, beta-catenina, e GAPDH e foi analisada por Western blotting. Resultados comparáveis ​​foram observadas quando as células foram expostas a TPA durante 30 minutos em vez de 18 horas (não mostrado). B: células BL41-3 foram expostas às concentrações indicadas de LiCl (ou de KCl ou NaCl como controlo), e ensaiadas para a expressão de Mcl-1 e beta-catenina, após 24 horas. Um gel de formato grande que separa as bandas doublet Mcl-1 foi utilizado. inibição ligeira de crescimento celular foi observada em 10-20 mM de LiCl (13 e 27%, respectivamente, em comparação com 5% com NaCl 20 mM). Resultados semelhantes aos apresentados foram obtidos com um tempo de exposição de 12 horas ou uma concentração de 40 mM de LiCl (não mostrado). C: células BL41-3 foram incubadas na ausência ou na presença de LiCl (20 mM) durante 0,5 horas, altura em que foi aplicado CHX. Expressão de Mcl-1, beta-catenina, e GAPDH foi ensaiada após os tempos indicados. Nenhuma diferença significativa foi observada em células paralelas expostas ao NaCl (20 mM, não mostrado) em vez de LiCl.

Mcl-1 expressão foi também monitorizada no experimento acima, e não foi encontrada para ser aumentada na presença de LiCl (Fig. 2A, fotografia superior). Na verdade, nenhuma mudança na Mcl-1 expressão foi visto até mesmo em concentrações LiCl que causaram um aumento máximo da expressão da beta-catenina e após o exame usando géis de grande formato (Fig. 2B). Esta observação foi interessante como LiCl estabiliza Mcl-1 em uma variedade de células e que tinha inicialmente assumido que, uma via de LiCl-sensível mediada por GSK3 pode estar envolvido na BL41-3 células. No entanto, outras observações também foram consistentes com a falta de um papel para esta via de Mcl-1 em células de degradação BL41-3. Assim, a exposição destas células a wortmanina ou LY294002, inibidores de PI3K que podem impedir a fosforilação inibidora da GSK3 e, assim, aumentam a degradação dos seus objectivos, não afecta sensivelmente a expressão de Mcl-1, reduzindo a de beta-catenina (Fig. S2A ). Além disso, não foi encontrado LiCl para afectar de Mcl-1 de degradação na presença de CHX (Fig. 2C). Em suma, Mcl-1 em células de degradação BL41-3 parecia ser em grande parte LiCl-insensível, e TPA não actuar, imitando o efeito deste inibidor da GSK3. Estes resultados, em conjunto com os achados anteriores (Fig. 1 e [25]) sugeriu que Thr 163 fosforilação pode estar associado a Mcl-1 estabilização nas células em que a degradação segmentada por GSK3 não desempenham um papel importante. Este ponto foi considerado mais adiante, usando o sistema de células CHO transfectáveis ​​em que mutantes sítio de fosforilação poderia ser examinado.

Mcl-1 Degradação não depende do Phosphodegron segmentada por GSK3 e é nitidamente retardado por um T163E Mutação no As células transfectadas CHO

células

CHO proporcionar um sistema facilmente transfectáveis ​​útil para o estudo de mutações em locais encontrados para sofrer modificação pós-tradução de forma endógena em células BL41-3 [24], [25], [30], [43] . células CHO contêm basal activada ERK ao contrário BL41-3 células. Por conseguinte, Thr 163 fosforilação ocorre após a transfecção com WT-se Mcl-1, e não é ainda aumentada pela adição de TPA [25]. Por conseguinte, estabelecido para examinar o efeito de uma mutação não-T163A fosforilável, bem como uma mutação T163E phosphomimetic, por transfecção de construções mutantes em células CHO. Curiosamente, os resultados preliminares mostraram que LiCl não afectou a expressão ou a degradação de WT-Mcl-1 em células CHO, embora a expressão de beta-catenina foi aumentada (Fig. 3A e a Fig. S2B). Isto proporcionou um paralelo com as descobertas em células que expressam endogenamente BL41-3 (Fig. 2C), e sugeriu que Mcl-1 degradação pode também não ser mediada através de GSK3 em células CHO transfectadas. Neste caso, não seria de esperar que uma mutação T163A de afectar Mcl-1 degradação. Este seria diferente do que é visto em fibroblastos normais, onde uma mutação T163A retarda Mcl-1 degradação porque Thr 163 fosforilação primos induzida por GSK3 Ser 159 fosforilação e degradação [27]. Com efeito, a proteína de Mcl-1-T163A-codificados foram submetidos a rápida degradação após exposição de células CHO transfectadas de CHX (Fig. 3B), assim como o WT-Mcl-1, Mcl-1-S162A- e Mcl-1-S159A proteínas codificado pelo (Fig. 3B, C). Mcl-1-S162A representa um controle adicional, tal como a fosforilação não foi observada neste local [25]. Notamos que, como em relatórios anteriores [27], um /T163A duplo mutante S159A não foi examinada, porque uma perda quase completa de Mcl-1 fosforilação é visto com a mutação T163A em células CHO [25] e esta mutação sítio de iniciação Ser 159 impede a fosforilação em fibroblastos [27]. Tomados em conjunto, estes resultados com mutações não-fosforilável bem como LiCl sugerem que o alvo phosphodegron-GSK3 não desempenha um papel importante na degradação de Mcl-1 em células CHO transf ectadas. Nesta situação, a proteína codificada Mcl-1-T163E exibiu estabilização golpeando [Fig. 3B (ver a exposição mais leve incluídos na parte inferior por causa da extensa estabilização visto com esta construção) e Fig. 3C]. Resultados semelhantes foram obtidos com células AKR-2B (Fig 3D).

A:. as células CHO foram transfectadas com WT-Mcl-1 e incubadas na presença de LiCl (+ LiCl, 20 mM) ou na sua ausência (-LiCl) onde 20 mM de NaCl foi adicionado no último caso. Após 10 horas, foi aplicado CHX e expressão do produto do gene WT-Mcl-1 introduzida, e endógena beta-catenina e GAPDH, foi ensaiada após os tempos indicados (ChemiDoc). A meia-vida de Mcl-1 de decaimento foi estimada como sendo ~ 4 horas em células expostas a LiCl, e 3,7 horas nos controlos expostos a NaCl. Nenhuma diferença significativa foi observada em células paralelas não expostos ao NaCl ou LiCl. O blot mostrado é representativa de três experiências independentes. B-C: células CHO foram transfectadas com as construções indicadas, novamente plaqueadas no dia seguinte, e incubou-se durante um período de 24 horas para permitir a expressão. CHX foi então adicionada e a expressão do produto do gene introduzido Mcl-1 e beta-tubulina endógena foi ensaiada após os tempos indicados por Western blotting. No Painel B, o declínio no Mcl-1 expressão em 3 horas em 2 experimentos independentes variou de 53-66% com WT-Mcl-1, 25-54% com Mcl-1-S162A, e 25-50% com Mcl- 1-T163A. Embora a diminuição da expressão com WT-Mcl-1 pareceu ser ligeiramente maior do que a observada com Mcl-1-T163A, isto não era um resultado consistente. A exposição autoradiográfica curto também é mostrado, porque bandas adicionais foram detectadas nos níveis elevados de expressão obtidos com Mcl-1-T163E. No final do período de observação de 12 horas, a expressão de Mcl-1-T163E foi diminuída em -15% no Painel B e ~27% em Painel C, tal como estimado a partir de exposições autorradiográficas curtos. D: células AKR-2B transfectadas com as construções indicadas foram plaqueadas de novo no dia seguinte, altura em que a viabilidade celular tempo (exclusão de tripano corante azul) era 88-92% em não-transfectadas, bem como culturas transfectadas. Um dia mais tarde, as células foram expostas a 25 microgramas /ml CHX e ensaiadas após os tempos indicados para a expressão do produto do gene de Mcl-1 endógeno introduzido ou actina por Western blotting. placas duplicados são mostrados em faixas adjacentes.

Mcl-1-T163E Exposições Elevated Acumulação e impede o crescimento de estáveis ​​transfectantes resistentes a G418

No experimento acima, Mcl-1- T163E exibiu acumulação elevada durante o período de expressão, antes da aplicação de CHX (Fig. 3B, tempo 0). O exame do curso de tempo da acumulação confirmou que ocorreu um aumento dramático após transfecção com Mcl-1-T163E, em comparação com WT-Mcl-1 (Fig. 4A, pistas 4-5 contra pistas 1-2).

a: células CHO foram co-transfectadas quer com WT-Mcl-1 ou de Mcl-1-T163E juntamente com pEGFP, e ensaiaram-se nos momentos indicados para a expressão do produto do gene de Mcl-1 e de EGFP introduzido por transferência de Western. A taxa de aumento da proteína de Mcl-1-T163E foi estimada como sendo pelo menos 10 vezes maior do que a WT-Mcl-1. expressão aproximadamente equivalente de EGFP em culturas de WT-Mcl-1 e de Mcl-1-T163E-transfectadas foi também observada após ensaio por citometria de fluxo (não mostrado). B: células CHO foram transfectadas com WT-Mcl-1 ou de Mcl-1-T163E e submetido a um pulso de exposição de 2 horas a

35SMet, momento em que uma amostra de “tempo 0” foi colhido. A perseguição com meio contendo metionina não radioactiva foi então executada e os

35SMet- rotulados proteínas Mcl-1 foram testadas após os tempos indicados (fotografia superior). Uma banda não específica de ~32 KD está incluído na figura (*) para fins de comparação e uma alíquota separada de cada amostra foi ensaiado para expressão total de Mcl-1 por Western blotting (fotografia inferior). A meia-vida de decaimento foi estimada por PhosphorImager ser, de 2,5 vezes mais longa com

35S-Met Mcl-1-T163E do que com

35S-Met-WT-Mcl-1.

Após a marcação metabólica impulso /perseguição,

35S-Met-Mcl-1-T163E e

35S-Met-WT-Mcl-1 demonstrou síntese equivalente durante o impulso inicial (Fig. 4B, o tempo 0 ). Após a perseguição, a deterioração de

35S-Met-Mcl-1-T163E foi retardado, em comparação com a de

35S-Met-WT-Mcl-1 (Fig. 4B), embora retardando aqui não foi tão marcado como tinha sido visto na monitorização da proteína total de Mcl-1-T163E por Western blot (Fig. 3B). Isto pode reflectir o facto de que a marcação de pulso /ranhura ensaia a proteína sintetizada de novo (geralmente uma fracção do total), ou de outras diferenças entre estes métodos [52], [53]. Tomado como um todo, as conclusões acima reforçada e alargada, aqueles em BL41-3 células, mostrando que a mutação T163E resultou em Mcl-1 estabilização em células CHO, onde a degradação foi em grande parte independente do phosphodegron segmentada por GSK3 em S

159LPST

163P.

a extensa estabilidade e acumulação elevada visto com Mcl-1-T163E podem dizer respeito a uma outra observação, o que foi que não fomos capazes de obter linhas de células estavelmente transfectadas com esta construção. Esta observação era inicialmente um tanto inesperada, porque continuamente crescentes linhas celulares transfectadas foram anteriormente obtido com a WT-Mcl-1 após a selecção com G418 (devido às neo

R marcador [43]) e poderia também ser obtida com Mcl-1- T163A. Mcl-1 expressão nestas linhas celulares transfectadas de forma estável foi na gama visto em células que expressam endogenamente Mcl-1, tais como BL41-3 células e células ML-1 tratadas com TPA ([43] e o painel superior e legenda).

Tendo em conta a observação acima, nós examinamos culturas Mcl-1-T163E-transfectados em tempos precoces após a transfecção e selecção com G418. Directamente após a transfecção, uma gama de Mcl-1 níveis de expressão foi observada (Fig. S3A painel inferior). Quando a G418 foi então aplicado para eliminar as células não transfectadas, células viáveis ​​não crescem para fora a partir de culturas de Mcl-1-T163E-transfectadas, ao contrário do que acontecia com WT-Mcl-1 [Fig. S3B (preenchido símbolos em certo contra o painel do meio), em que as células cresceram na ausência de G418, em ambos os casos, mas perdeu-se Mcl-1 expressão (símbolos abertos)]. As células resistentes a G418 que cresceram com WT-Mcl-1 apresentaram níveis muito mais baixos de expressão do que a população em massa inicial transfectadas (Fig. S3C, pistas 10-12). Em contraste, a expressão abundante foi mantida de Mcl-1-T163E-transfectadas culturas (Fig. S3C, pistas 16-18). Em geral, a selecção com G418 resultou no crescimento de linhas transfectantes que exibem expressão na gama endógeno com WT-se Mcl-1, assim como Mcl-1-T163A, mas não com Mcl-1-T163E.

Além ao seu efeito anti-apoptótico, Mcl-1 tem sido relatado para inibir a proliferação celular, em alguns sistemas de [54], [55]. Este efeito não foi observado em transfectantes estáveis ​​que expressam a proteína em níveis na gama endógeno [56]. No entanto, a inibição da proliferação foi visto por transfecção transiente ou outras abordagens capazes de produzir níveis elevados de expressão. O facto de as linhas de células CHO-WT Mcl-1-transfectadas exibiram expressão na gama endógeno (Fig. S3A painel superior) sugere que estas células pode ter tido uma vantagem de crescimento sobre aqueles com níveis mais elevados de expressão. transfectantes estáveis ​​com outra linha destinatário igualmente exibiram expressão na faixa endógena, mas não superior [56]. Em geral, enquanto que a WT-Mcl-1 promove a viabilidade em clones transfectados de forma estável que expressam níveis na gama endógeno, que continua a ser determinado se os níveis de expressão mais elevados resultar em efeitos adicionais, tais como a inibição da proliferação celular.

Tendo em conta as considerações acima, talvez não seja surpreendente que as linhas transfectadas de forma estável não foram obtidos com Mcl-1-T163E. Fazemos notar que a expressão de tubulina endógena foi reduzida nas culturas transfectadas com esta construção (Fig. S3C), que pode estar relacionada com a expressão elevada da proteína transfectado e /ou a presença da mutação Glu não removível. Observamos também que algumas células dentro da população inicial em massa Mcl-1-T163E-transf exibiu expressão (Fig. S3A painel inferior) inferior.