Abstract

A resistência às drogas é um desafio na quimioterapia e tem interesse de pesquisa atraiu todo o mundo e uma atenção especial foi dada aos compostos naturais para superar esta dificuldade. Um Pulchrin, um novo composto isolado a partir de produtos naturais demonstrou novo potencial para o desenvolvimento de uma droga. A identificação de pulchrin A foi conduzida utilizando várias técnicas espectroscópicas tais como ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa de cromatografia líquida, espectrometria de infravermelho e ultravioleta. Os efeitos de citotoxicidade sobre as células Caov-3 indica que pulchrin A é mais activa do que a cisplatina, que tem um IC

50 de 22,3 uM. Alterações significativas na morfologia celular estavam presentes, tais como formação de bolhas de membrana celular e a formação de corpos apoptóticos. O envolvimento de fosfatidilserina (PS) na apoptose foi confirmada por anexina V-FITC, após um tratamento de 24 h. A apoptose foi activada através da via intrínseca pela ativação de pró-caspases 3 e 9, bem como caspases clivados 3 e 9 e terminou na via de carrasco, com a ocorrência de escada do ADN. A apoptose foi ainda confirmada através de níveis de expressão de genes e proteínas, em que a proteína Bcl-2 foi regulada para baixo e proteína Bax foi regulada. Além disso, o ciclo celular Caov-3 foi interrompido na fase G0 /G1, que conduz à apoptose. A modelagem molecular de proteínas Bcl-2 demonstraram uma afinidade de ligação elevada, o que inibia a função de Bcl-2 e proteínas conduziu à morte celular. Os resultados do estudo atual pode lançar luz sobre o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, particularmente, humanos tratamentos contra o cancro do ovário

Citation:. Nordin N, Fadaeinasab M, Mohan S, Mohd Hashim N, Othman R, Karimian H, et ai. (2016) Pulchrin A, um derivado de New Natural cumarina da

Enicosanthellum pulchrum

, induz a apoptose em células de cancro do ovário via intrínseca Caminho. PLoS ONE 11 (5): e0154023. doi: 10.1371 /journal.pone.0154023

editor: Yi-Hsien Hsieh, do Instituto de Bioquímica e Biotecnologia, TAIWAN

Recebido: 26 Dezembro, 2015; Aceito: 07 de abril de 2016; Publicado em: 02 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Nordin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Universidade de Malaya sob concessão PPP (PG151-2012B) e do Ministério do Ensino Superior Malásia sob impacto confere elevada de investigação (UM -MOHE UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma das principais doenças que afectam a população humana em todo o mundo [1]. Aproximadamente, metade de todos os homens e mais de um terço de todas as mulheres são diagnosticadas com cancro no decurso da sua vida útil. Enquanto isso, um quarto dos adultos morrem por causa de câncer [2]. Dados compilados pela Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC) sobre o registo câncer e mostram uma mortalidade que cerca de 12,6 milhões de novos casos de câncer foram relatados apenas em 2008 em todo o mundo [2]. De acordo com o Registro Nacional do Câncer da Malásia [3], um total de 8.123 (44,6%) do sexo masculino e 10.096 (55,4%) residentes fêmeas foram diagnosticadas com câncer na península da Malásia em 2007.

Enquanto isso, um total de 239.000 novos casos em todo o mundo foram registrados para o câncer de ovário [4]. O câncer de ovário é o câncer ginecológico mais fatal, principalmente por causa da falta de sintomas especificidade e biomarcadores disponíveis para a detecção durante os primeiros estágios da doença. Na maioria dos casos de cancro do ovário, o diagnóstico em estágio final era comumente detectada entre os pacientes que eram incapazes de responder de forma eficaz ao tratamento. Geralmente, estes pacientes têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos, mas esta taxa foi reduzida para 20-30% [5-7]. Tratamento de doentes com cancro do ovário é baseado no protocolo padrão em que a cirurgia é o tratamento inicial seguido por quimioterapia. Três diferentes drogas comumente usadas para tratar o câncer de ovário são doxorrubicina, carboplatina e taxanos. No entanto, estas drogas são frequentemente menos eficaz do que os doentes podem apresentar resistência à droga administrada [8]. Estas desvantagens levaram os pesquisadores a explorar compostos alternativos potencialmente eficazes como tratamento para câncer de ovário.

A cumarina e seus derivados pertencem à família lactona que compreende a estrutura esquelética benzopirona, que pode ser encontrado amplamente na natureza [9]. derivados de cumarina têm sido encontrados para exibir consideráveis ​​actividades biológicas e terapêuticas diferentes [10, 11] que são úteis em fotoquimioterapia, a terapia anti-tumoral e terapia anti-HIV [12, 13]. Eles podem ser utilizados como sistema nervoso central (SNC) estimulantes [14], anti-bacterianos [15, 16], antifúngicos [17, 18], anti-inflamatórios [19], anti-coagulantes [20], tuberculostáticos [21] e corantes [22]. Alguns dos derivados de cumarina foram também relatados como fixadores e agentes aromatizantes. No entanto, os Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) regulou o uso de cumarina como aditivos alimentares [23-25]. antibióticos potentes derivados de cumarina, tais como a novobiocina, coumaromycin chartesium e estão comercialmente disponíveis [26]. No presente estudo, um novo derivado de cumarina foi isolado pela primeira vez a partir de produtos naturais,

Enicosanthellum pulchrum

. Um grupo alquilo de comprimento foi ligado ao anel de cumarina heterocíclico para investigar o seu potencial como agente anticancro promissora contra a linha celular de cancro do ovário humano Caov-3 em baixas concentrações dentro de 24 h.

Materiais e Métodos

experimental

gel de sílica H foi adquirido de Sigma-Aldrich, enquanto gel de sílica 60 (malha 230˗400), dimetylsulfoxide (DMSO), metanol (MeOH), etanol (EtOH),

N

-hexano e acetato de etilo (EtOAc) foram adquiridos a Merck @ Co. (Alemanha). 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazólio (MTT) foi fornecida por Invitrogen (Carlsbad, EUA). RPMI-1640 (pH 7,4), penicilina /estreptomicina e soro fetal de bovino (FBS) foram adquiridos a ‘Nacalai Tesque’ (Japão) e tripsina-EDTA 10X foi fornecido por Biowest (EUA). A luz ultravioleta (UV) os espectros e os espectros de infravermelhos (IV) foram registados num espectrofotómetro de UV (Shimadzu UV-1601, Japão) e o espectrómetro de FT-IR Spectrum RXI (Perkin Elmer, EUA), respectivamente. A ressonância magnética nuclear (RMN) Os espectros foram registados num espectrómetro Bruker de 600 MHz (Suíça) espectrómetro. Rotação óptica foi realizada em Jusco (Tóquio, Japão). Os espectros de massa foram registados para ionização de pulverização de electrões (ESI) espectrometria de massa em IT-TOF da Shimadzu, Japão. análise de alto desempenho cromatografia líquida (HPLC) também foi realizado.

Preparação de planta de extração

Raízes do

E

.

pulchrum

foram coletados em setembro de 2011 na floresta de montanha de Cameron Highlands (Pahang, Malásia). O Diretor do Departamento de Pahang Florestal, Malásia foi dada a permissão para entrar e recolher as amostras [27]. A planta foi identificada pelo falecido Prof. Dr. Kamarudin Mat Salleh de Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM). O espécime (SM769) foi colocado à Botany Department Herbário da Faculdade de Ciência e Tecnologia, UKM (Bangi, Malásia). As raízes foram secas ao ar e moído até 40-60 tamanho de partícula de malha. Os extratos foram obtidos por maceração em

n

solvente hexano. Um evaporador rotativo (Buchi, Suíça) foi usado para remover os solventes a partir das amostras.

A extracção e o isolamento de pulchrin Um

Para a purificação de pulchrin A, o extracto de hexano foi separada por cromatografia em coluna (CC) usando sílica tipo gel 60 (malha 230-400). O sistema de solventes foi utilizado para separar os compostos na coluna de gradiente de menos polar para mais polar (hexano-EtOAc-MeOH). Um total de 157 fracções foram recolhidas utilizando um frasco de 20 mL. Um total de 12 fracções foram obtidos com base no factor de retenção de cada composto por análise de cromatografia em camada fina (TLC). Fracção 3 (A9-A12) foi ainda purificado usando TLC preparativa. Um novo composto foi separada com sucesso usando o

N

-hexano-EtOAc (8: 2) como sistema solvente. O composto referido como pulchrin A foi elucidada por RMN, ao passo que a pureza de pulchrin A foi determinada por HPLC utilizando 10% a 100% de acetonitrilo (v /v) eluio gradiente ao longo de 15 min a uma velocidade de fluxo de 0,5 mL /min.

Análises estruturais Elucidação

Nuclear espectroscopia de Ressonância magnética (RNM).

Em resumo, pulchrin a foi analisado por RMN para examinar a presença de prótons e átomos de carbono através de 1D (

1H e

13 C) e 2D (COSY-45, HSQC e HMBC) experimentos. O composto foi preparado por dissolução com clorofórmio deuterado (CDCl

3) no tubo de RMN. Antes da análise, o tubo de NMR foi colocado no espectrómetro de NMR para processamento adicional.

Espectroscopia de Massa (MS).

A espectroscopia de massa é principalmente para determinar o peso molecular de pulchrin A. A análise foi realizada utilizando o instrumento LCMS-TI-TOF. Pulchrin A foi dissolvido em MeOH antes de injectar no instrumento. O espectro de massa foi gravado no modo positivo e negativo.

Transformada de Fourier-Espectroscopia no Infravermelho (FT-IR).

Foi realizada a espectroscopia de Fourier Transform Infrared-(FT-IR) para detectar a presença do grupo funcional na pulchrin A. o composto foi dissolvido em CHCl

3 e cair sobre o cloreto de sódio (NaCl) pelota. Antes da análise, o sedimento foi colocada no instrumento FT-IR. O resultado foi registrado na absorção de 500-4000 cm

-1.

Ultraviolet Spectroscopy (UV) e Rotação óptica.

Pulchrin A foi dissolvido em MeOH antes de ser transferido para uma cuvete. Os comprimentos de onda utilizados para detectar a presença de átomos, variou de 190 nm a 800 nm. A absorção foi, em seguida, gravada utilizando um espectrofotómetro de UV. Os resultados foram expressos sob a forma de um espectro de absorção. Enquanto isso, um total de 0,05 M de pulchrin A foi dissolvido em CHCl

3 e transferida para um polarímetro Jasco P-1020. A temperatura de medição da rotação óptica foi de 24 ° C.

citotoxicidade ensaio

Duas células de cancro do ovário humano (Caov-3 e SKOV-3) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, EUA). células ovarianas humanas imortalizadas epiteliais (T1074) foram obtidos de Applied Materials Biológicas (ABM

® Crestwood Place Richmond, Canadá). Estas linhas de células foram cultivadas no nosso laboratório instituição. Todas as células foram subcultivadas e cultivadas em frasco de 25 ml contendo meio RPMI-1640 (Caov-3 e SKOV-3) e um meio de Prigrow (T1074) [28], complementado com 10% de FBS e 1% de penicilina /estreptomicina. As células confluentes foram então lavadas com PBS, antes de serem colhidas com solução de tripsina-EDTA 10X. As células colhidas foram centrifugadas a 1800 rpm durante 5 minutos e diluídas até 1 × 10

6 células /mL de células. O ensaio foi realizado numa placa de 96 poços contendo 1 × 10

4 células /poço. Antes do tratamento, um total de 1 x 10

4 ug /mL de pulchrin A foi preparada por adição de 1,0 mg do composto em 100 ul de DMSO. As células Caov-3 foram tratados com pulchrin A na concentração de 50 ug /ml até 0,78 ug /mL por duas vezes em série de diluição. As células foram então incubadas a 24, 48 e 72 h. Antes da medição, solução MTT (20

μ

L) foi adicionado em cada poço e incubou-se durante 3 h. A placa foi registada a uma absorvância a 570 nm usando um leitor de microplacas. O resultado foi definido como o IC

50 valor, em que a cisplatina (IC

50: 30,6 uM). Foi utilizado como controlo positivo no estudo

laranja de acridina /iodeto de propídio (AO /PI) dupla marcação ensaio

ensaio de dupla marcação aO /PI foi conduzido de acordo com o procedimento padrão usado para a microscopia de fluorescência (Lieca com o software Q-Floro). O ensaio foi realizado em um frasco de 25 mL de cultura (Nunc), através do qual as células Caov-3 foram expostas e T1074 com pulchrin A (22 uM), às 24, 48 e 72 h. Antes da coloração, as células colhidas foram lavadas com PBS. Um total de 10

μ

L de AO e PI (10

μ

g /mL) foram adicionados ao sedimento de células. As células foram observados dentro de 30 minutos sob um microscópio fluorescente à luz ultravioleta (Olympus BX51) para avaliar as alterações morfológicas antes de fluorescência desaparecendo.

anexina-V-FITC ensaio

O efeito da pulchrin A durante a fase inicial da apoptose foi avaliada utilizando o Kit (FITC) de anexina V de detecção da apoptose isotiocianato de fluoresceína I (BD Pharmingen

™). As células Caov-3 foram cultivadas numa placa de 6 poços e tratadas com pulchrin A (22 fiM) durante 24, 48 e 72 h. As células (5 × 10

4 células /mL) foram em seguida recolhidas por centrifugação a 1600 rpm durante 5 min. Um total de 100 uL de cada amostra foi transferida para um tubo que continha 5 uL de FITC anexina V e 10 ul de PI. A suspensão foi misturada suavemente e adicionou-se 100 uL de 1 x tampão de ensaio. A detecção foi realizada utilizando um citómetro de fluxo (BD FACSCanto

™ II, San Jose, CA, EUA)

caspases colorimétricos análise

Os cisteinil ácido aspártico-protease (caspases) -3,. – 8 e -9 ensaios foram realizados utilizando um kit comercial (caspases 3, 8 e 9 ensaio colorimétrico: R D Systems, Inc., EUA). As células foram semeadas num frasco de 75 ml e tratou-se com o CI

50 pulchrin concentração de A para 24, 48 e 72 h. As células tratadas foram recolhidas por centrifugação a 1800 rpm durante 5 min. O tampão de lise foi então adicionado ao sedimento de células e incubado em gelo durante 10 min. O lisado foi ainda centrifugado a 9450 rpm durante 1 min para recolher o sobrenadante. O ensaio foi realizado em uma parte inferior microplaca de 96 poços plana. Cerca de 5 ul de caspase 3, 8 ou 9 substrato colorimétrico (LEHD-pNA) foi adicionada a cada reacção contendo um lisado celular e um tampão de reacção de 2 X de caspase 3, 8 ou 9. A reacção foi incubada durante 1 h a 37 ° C e depois ler num leitor de microplacas (Infinito M200PRO, Tecan, Männedorf, Suíça) no comprimento de onda de 405 nm.

vários ensaios de citotoxicidade

vários ensaios de citotoxicidade foram realizados usando o Cellomics

® Multi citotoxicidade 3 Kit (Thermo Scientific, PA, EUA). Um total de 5 × 10

3 células foram semeadas em cada poço de microplacas de 96 poços. As células foram então tratadas com pulchrin Um a três concentrações (11, 22 e 33 uM) durante 24 h e, em seguida, incubadas durante a noite a 37 ° C. Após a incubação, várias soluções foram continuamente adicionados em cada cavidade contendo 50 mL de solução de coloração de células vivas, com 100 uL de tampão de fixação, com 100 uL de tampão de permeabilização 1 X e 100 uL de 1 x tampão de bloqueio, que foram incubadas durante 20 min, 10 min, 30 min e 15 min, respectivamente. Duas soluções de anticorpo (citocromo

C

anticorpo primário e DyLight

™ 649 anticorpos secundário conjugado de cabra anti-IgG de ratinho) foram adicionados na fase final da preparação a testar. A placa foi então lidas e avaliadas na ArrayScan, alto teor de triagem (HCS) Reader da Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA).

fragmentação do DNA ensaio

Este experimento foi realizado utilizando a Suicide-Track

™ Kit DNA isolamento Ladder (Calbiochem, KGaA, Darmstadt, Alemanha). As células COAV-3 foram semeadas em frascos de cultura de 75 mL e, em seguida, tratada com pulchrin A (22 fiM) durante 24, 48 e 72 h. Os pellets celulares foram obtidos por centrifugação a 1800 rpm durante 5 min. Os sedimentos de células foram suavemente ressuspensas em três soluções sucessivamente: 55 ml de solução de # 1, 20 ul de solução de 2 # e 25 mL de solução de # 3 (os componentes do kit). Antes da incubação a 50 ° C, 500 ul do tampão de ressuspensão foi adicionada à mistura. A electroforese foi realizada através da preparação do gel de agarose (1,5%) em tampão TAE 1 X com um reagente de coloração fornecido no kit. O gel foi operado a 50 volts até o corante atingiu 1-2 cm a partir da extremidade do gel. O gel foi visualizado sob luz UV num transiluminador e depois fotografadas.

-PCR em tempo real

O ARN total foi extraído a partir de células Caov-3 utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha). A concentração final de ARN total e a sua pureza foi medido utilizando um espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). A conversão de ARN em ADNc foi realizada utilizando o kit Two-Step qRT-PCR (Applied Biosystems, EUA). Um total de 1 ug /mL de ADNc (1 mL) foi utilizada no ensaio de expressão de genes com iniciadores sete TaqMan específicas e sonda (β-actina, Bax, Bcl-2, a survivina, bem como as caspases 3, 8 e 9) genes foram adicionadas no ensaio (Applied Biosystem, EUA). Os níveis de expressão de genes foram, em seguida, avaliada utilizando o sistema de PCR (Applied Biosystems, EUA) StepOne Além disso, em tempo real; cada ciclo consistiu em dois minutos de transcriptase reversa a 50 ° C, 20 seg de activação da polimerase a 95 ° C, 1 s de desnaturação a 95 ° C e 20 s de recozimento a 60 ° C. O processo foi concluída após 40 ciclos de leitura. Os dados foram então calculado com base no Ct comparativa (2-ΔΔCt) método padrão descrito no estudo de Wong e Medrano (2005) [29].

Western blot ensaio

O Caov-3 As células foram semeadas num frasco de cultura de 75 ml e tratou-se com pulchrin a (22 uM), às 24, 48 e 72 h. As células colhidas foram centrifugadas a 13000 rpm durante 10 s e 400 uL de PRO-PREP

™ solução foi adicionado para ressuspender as células. As células foram induzidas para a lise por incubação a -20 ° C durante 20 min. Antes da separação por 10% SDS-PAGE, com 100 ug de proteína foi aliquotado e misturou-se com corante de carga. O gel foi deixada correr durante 90 min antes de ter sido transferido para uma membrana de polyvinylidenedifluoride (PVDF) (Bio-Rad). A membrana de PVDF foi bloqueada durante 3 horas com BSA a 5%. O anticorpo primário para

β

-actina (1: 1000), Bax (1: 1000), Bcl-2 (1: 1000), survivina (1: 1000), as caspases 3 e 9 (1: 1000 clivados) e as caspases 3 e 9 (1: 1000) foram conjugados com um anticorpo secundário (pAb de cabra IgG de RB). O processo continuou durante 1 h de incubação à temperatura ambiente. O anticorpo ligado foi detectado utilizando um kit de detecção colorimétrica e expostas durante vários minutos para permitir o aparecimento das bandas. A membrana de PVDF foi visto e fotografado usando um transiluminador de luz UV.

array perfil Protein

Caov-3 células tratadas com Pulchrin A (22 mM) foram avaliados para proteínas marcadores apoptóticos usando o Proteome Profiler array (RayBio

® Human apoptose Antibody Kit array, Raybiotech, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. proteína extraída (200 ug /ml) a partir de células Caov-3 foi adicionada a cada poço contendo membrana e foi deixado durante a noite a 4 ° C durante a incubação. Os procedimentos de lavagem usando tampões de lavagem I e II foi executado para cada incubação. Antes da detecção de, a membrana foi adicionado com um cocktail de anticorpo biotinilado e subsequentemente com HRP-estreptavidina para incubação durante a noite. Um total de 500 ul do tampão de detecção foi pipetada para a membrana. As membranas colada foram transferidos e exposto ao sistema de imagem de quimiluminescência e depois fotografado (Biospectrum AC Chemi HR 410, UVP, Cambridge, UK).

ciclo celular ensaio

As células tratadas com pulchrin A foram recolhidas e, em seguida, lavada duas vezes com PBS a 1800 rpm durante 5 minutos a centrifugação. As células foram fixadas com uma solução de fixação por adição de 700 mL de EtOH frio a 90% e mantido durante a noite a 4 ° C, para restaurar a integridade células. EtOH foi então descartada e enxaguou-se com 600 ul de PBS por centrifugação a 1800 rpm durante 5 min. Um total de 25 ul de ARNase (10 mg /mL) e 50 mL de iodeto de propídio (PI) (1 mg /mL) foram misturados para as células fixas e incubou-se durante 1 h a 37 ° C. A análise do conteúdo de DNA para paragem do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo (BFACSCanto

™ II).

interacção de ligação às proteínas

Este estudo foi realizado utilizando a proteína anti-apoptótica Bcl 2 em conjunto com o padrão de Bcl-2 inibidor ABT 737 [30]. A estrutura cristalina de Bcl-2 tridimensional foi obtido a partir do Protein Data Bank RCSB [31, 32] com o ID do 4IEH PDB [30]. O programa de software de encaixe automático (AutoDock 4.2) foi usado para calcular o acoplamento de moléculas pequenas, com base no algoritmo genético lamarckiano [33]. As moléculas de água foram removidos para a preparação de moléculas de proteína. átomos de hidrogênio polares foram adicionados à estrutura, ao passo que os átomos de hidrogênio não polares foram fundidas. Além disso, os encargos Gasteiger e parâmetros de solvatação foram atribuídos por padrão. Ao utilizar o software 4.2 AutoGrid, o arquivo de parâmetro grade foi definida usando os valores para x, y, e z eixos; o espaçamento da grade foi a 0,375 Å, o valor padrão. A energia de ligação interação também foi calculada utilizando o programa AutoDock 4.2.

A análise estatística

O IC

50 valores foram determinados utilizando GraphPad Prism ver. 4.0 (GraphPad Software Inc, EUA). Cada teste foi realizado em três repetições e os valores foram registados como média ± desvio padrão (SD). Usando SPSS ver. 17,0 (IBM Corporation, EUA), ANOVA de uma via com o teste de Dunnett foi usado para analisar os dados para significância estatística. Enquanto isso, as análises quantitativas de proteínas foram perfomed usando software ImageJ.

Resultados

Identificação Estrutura de Pulchrin A

Um novo derivado de cumarina natural, pulchrin A (Fig 1) foi elucidada usando o espectro completo NMR (Tabela 1), bem como espectrometria de massa UV, IR e ESI (S1-S7 Figs).

a correlação HMBC é realçada com setas vermelhas e azuis indicados como

J

2 e

J

3, respectivamente, enquanto as correlações COSY na cor seta preta

óleo branco.; Rendimento: 0,005%, [α] -16 (

C

0,05, CHCl

3). TLC: (

N

-hexano: EtOAc, 80:20 v /v): R

f = 0,56. UV (MeOH) λ

max (log €): 356 (3,80), 315 (4,03), 280 (4,32) nm. IR ν

max (CHCl

3); 2921, 2853 (CH), 1759 (OC = O), 1463 cm

-1. HRESIMS m /z [M + Na] 465,3240 (10), 338,3380 (90), 339,3430 (60) (calculado para C

30H

50o

2, 442,7066).

1 H-NMR (CDCl

3, 600 MHz) δ ppm: 0,89 (3H,

m

, H-21), 1,25 (2H,

m

, H-18) , 1,28 (14H,

m

, H-11, H-12, H-13, H-14, H-15, H-16, H-17), 1,29 (2H,

m

, H-6 ‘), 1,30 (2H,

m

, H-19), 1,32 (2H,

m

, H-20), 1,34 (2H,

m

, H-7 ‘), 1,43 (2H,

m

, H-8′), 1,51 (2H,

m

, H-2), 1,55 (2H ,

m

, H-10), 1,59 (2H,

m

, H-5 ‘), 2,02 (2H,

m

, H-9), 2,21 (2H,

m

, H-3), 2,25 (2H,

m

, H-1), 2,91 (2H,

m

, H-6), 2,93 (1H,

m

, H-4a), 4,90 (1H,

m

, H-8a), 5,33 (1H,

m

, H-7) , 5,35 (1H,

m

, H-8), 5,40 (2H,

m

, H-4, H-5), 6,98 (1H,

m

, H-4 ‘).

13 C RMN (CDCl

3, 150 MHz) δ ppm: 14,1 (C-21), 22,4 (C-20), 22,7 (C-18), 24,3 (C-3), 25,2 (C- 1), 26,6 (C-2), 27,2 (C-7 ‘), 27,4 (C-9), 27,9 (C-5’), 28,0 (C-10), 29,2 (C-6 ‘), 29,5 ( C-11, C-12, C-13, C-14), 29,6 (C-15, C-16, C-17), 29,7 (C-8 ‘), 32,0 (C-19), 56,8 (C -4a), 57,3 (C-6), 76,9 (C-8a), 128,3 (C-8), 129,8 (C-7), 131,0 (C-4, C5), 134,4 (C-3 ‘), 148,8 (C-4 ‘), 173,9 (C-2’).

citotóxica Efeito da Pulchrin A

Três linhas celulares foram testadas, incluindo duas células de cancro do ovário (Caov-3 e SKOV- 3) e uma linha imortalizada humana normal das células epiteliais do ovário (T1074) para determinar os efeitos citotóxicos da pulchrin a (Tabela 2). Além disso, a cisplatina também foi testada como controlo positivo neste estudo (Figura 2). A IC

50 resultados mostraram que pulchrin A inibiu 50% da Caov-3 em células de crescimento 22,31 uM, em comparação com 33,63 | iM contra células SKOV-3, após 24 h de tratamento. -3 SKOV células A Caov-3 e foram investigados os efeitos citotóxicos às 48 e 72 h, mostrando diminuições no IC

50 valores tal como mostrado na Figura 2. Por outro lado, os efeitos citotóxicos da pulchrin A apresentaram efeitos comparáveis ​​em comparação com cisplatina a 24 h contra Caov-3 e as células SKOV-3, os quais demonstraram que pulchrin Um exercida maior citotoxicidade contra ambas as linhas celulares do cancro do ovário. Em contraste, um efeito menos citotóxica contra células T1074 foi encontrada mesmo em concentrações superiores a 100 uM.

A experiência foi realizada em triplicado. Os dados são apresentados como média ± SD.

citomorfologia Avaliação da apoptose por AO /PI dupla marcação

O efeito apoptótica de pulchrin A no Caov-3 e T1074 células foram observados através de alterações morfológicas sob um microscópio de fluorescência. A avaliação foi conduzida citomorfologia em células Caov-3 devido a pulchrin A mostrou baixa IC

50 concentração contra Caov-3 células, em comparação com células SKOV-3 no ensaio de citotoxicidade. Após o tratamento, a uma concentração de 22 uM para 24, 48 e 72 h, as células Caov-3 exibiram características de apoptose em comparação com as células T1074. Sob condições não tratadas, as células exibiram uma forma arredondada saudável com uma estrutura nuclear intacta. A morfologia de células foram mudados depois de 24 h de tratamento em células Caov-3 com a presença de formação de bolhas de membrana celular e fragmentação do ADN. lesão celular extensa pode ser claramente observada após 48 h em diante com a presença de corpos apoptóticos e uma cor laranja-avermelhado, o que indica que as células sofreram apoptose tardia (Figura 3a). Em contraste, as células T1074 exibiram nenhuma diferença significativa na morfologia celular em comparação com células não tratadas para com T1074 processo de apoptose, sugerindo que pulchrin A foi inofensiva para as células normais de ovário (Fig 3B).

[A] não tratados e tratados -CAOV-3 células com pulchrin A a 24, 48 e 72 h de tratamento. As células Caov-3 exibiu blebbing célula de membrana tão cedo quanto 24 horas de tratamento. Os seguintes 48 h de tratamento mostrou mais blebbing célula de membrana e a presença de corpos apoptóticos e condensação cromatin. A presença de células coradas de laranja em 72 h de tratamento, o que representa a marca de apoptose tardia. [B] As células não tratadas e tratadas-T1074 com pulchrin A a 24, 48 e 72 h de tratamento. As células T1074 não apresentaram diferenças significativas na morfologia após células tratadas com pulchrin A até 72 h de tratamento. VI, as células viáveis; BL, vesiculação da membrana celular; CC, condensação da cromatina; LA, apoptose tardia; AB, corpos apoptóticos. (Ampliação de 40 × e 100 ×).

Análise da membrana Alteração

Alterações na membrana celular foi observado pelo ensaio de anexina V-FITC conduzida usando um frasco de 25 mL cointaining Caov-3 As células tratadas com pulchrin a a 24, 48 e 72 h. Como mostrado na Fig 4, os resultados revelaram que as células Caov-3 tratado com pulchrin A a 24, 48 e 72 h foram submetidos a apoptose de fase precoce como indicado por 5,3, 9,4 e 14,3% de aumento na quantidade de uma forma dependente do tempo, respectivamente. As células que sofreram apoptose e necrose fase tardia também aumentou durante as primeiras 24 a 72 horas após o tratamento, ao contrário das células viáveis, que revelaram uma diminuição de 92,5% para 40,5% em população de células após o tratamento.

[A] Controlo (não tratado), [B] 24 h, [C] 48 h, [D] 72 h. cor vermelha vermelho, azul, verde e luz escura indicada viável, apoptose inicial, apoptose tardia e necrose secundária, respectivamente. Movimento da população celular foi iniciada em Q3 (células viáveis) a Q4 (precoce de apoptose) de Q2 (apoptose tardia), e, finalmente, para Q1 (necrose secundária). [E] Histograma das populações de células de células viáveis, no início a apoptose, late-apoptose e secundário-necrose Caov-3. Os resultados foram representados como a média ± DP de três réplicas. *

p

. 0,05 indica diferença significativa do controle

Análise de caspases

As caspases 3, 8 e 9 foram testados para determinar as vias de apoptose. Os resultados na figura 5 mostram que as caspases 9 e 3 foram ativados por pulchrin A exposição através das vias intrínseca e execução, respectivamente. Em contraste, a caspase 8 mostraram valores irregulares, como representado no gráfico de barras, o que sugere que nenhuma activação da caspase 8 foi detectado através da estimulação de pulchrin A. activação de caspases 3, 8 e 9 foram também confirmadas aos níveis de ARNm em que apenas caspases 3 e 9 exibiram sobre-expressão relativa de caspase 8 de uma forma dependente do tempo. Do mesmo modo, os níveis de caspase 3 e caspase 9 proteínas de expressão foram significativamente regulada positivamente (

P

0,05) em relação à das células não tratadas Caov-3. Além disso, a expressão da proteína de caspase 3 clivada e caspase 9 clivada aumentada sob os três períodos de tratamento diferentes, indicando que a indução de apoptose ocorreu pelas vias intrínsecas e de execução.

[A e B] colorimétrico e real análise de PCR em tempo de caspases 3, 8 e 9, respectivamente. [C] análise de Western blot caracterizada por imagens e histograma para pró-caspases e caspases clivada. Os resultados foram representados como a média ± DP de três experiências independentes. A diferença significativa é expressa como *

p

. 0,05

Análise de mitocondriais Alterações

Este estudo foi realizado para examinar o envolvimento da mitocôndria em apoptose em cima pulchrin Um tratamento. Os três parâmetros de intensidade nuclear total, a permeabilidade celular e citocromo

C

libertação indicou que a intensidade de fluorescência foi aumentado, como mostrado na figura 6. As intensidades de fluorescência das estes três parâmetros aumentou a concentrações tão baixas quanto 22 pM e significativa diferenças (

P

0,05) foram determinadas para uma concentração de 33 uM. Em contraste, a intensidade de fluorescência do potencial de membrana mitocondrial (MMP) para as células tratadas pulchrin-A Caov-3 diminuiu de um modo dependente da concentração. foi observada diferença significativa entre as células Caov-3 tratadas e não tratadas em concentrações superiores a 33 M, quando o

p

. 0,05

As células foram coradas com Hoechst, a permeabilidade celular, potencial de membrana mitocondrial (MMP) e citocromo

c

corantes. As imagens de cada linha foram capturados a partir do mesmo campo. As células Caov-3 apresentaram uma redução no número de células e MMP, enquanto que as células tratadas com pulvhrin A a 24 h (20 × ampliação) mostrou aumentos na permeabilidade celular e citocromo

c

release. Histograma representa intensidades médios observados simultaneamente em células Caov-3 de uma forma dependente da concentração para a intensidade total de nuclear, a permeabilidade celular, MMP e citocromo

c

release. Todos os dados foram determinados como média ± SD em que a diferença significativa foi expressa como *

p Art 0,05.

ADN A fragmentação Ensaio

Este ensaio foi conduzido para confirmar a ocorrência da tarde apoptose em células tratadas com pulchrin A. A presença de uma escada de ADN nas células Caov-3 foi observado após 24 horas de tratamento (Figura 7); o mesmo foi observado para o próximo 48 e 72 h. A formação do segmento característico de ADN revelou a ocorrência de fragmentação do ADN nas células Caov-3, que induziu apoptose

pistas A-C:. As células tratadas com pulchrin A para 72, 48 e 24 h, respectivamente. Pista D: células não tratadas.