Abstract

Fundo

antígeno (PSA) de triagem espondina-2 (SPON2), a mais de câncer de próstata-específico prostático específico, embora comum, foi recentemente sido posta em causa. Para encontrar o cancro da próstata (PCA) biomarcadores de diagnóstico que pode compensar os defeitos de PSA, foram comparados os secretomes de várias linhas de células benignas e APC, moléculas candidatas seleccionadas e, em seguida, confirmaram o seu valor clínico.

Metodologia /Descobertas principais

identificado pela primeira vez por proteínas extracelulares bidimensional electroforese em gel (2-dE) acoplada a espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS /MS) identificação. Em seguida, as proteínas secretadas validado em um nível celular, e finalmente determinar se elas podem ser utilizadas como biomarcadores de diagnóstico CaP usando tecido da próstata e as amostras de soro de voluntários chineses por immunohistostaining e ELISA em sanduíche. Obtivemos credíveis proteína extracelular 2-DE gráficos de linhas de células de próstata. As manchas 5 que mostraram repetibilidade superiores foram selecionados para análise de LC-MS /MS, que identificou sete moléculas candidatas. Uma das moléculas candidatas, espondina-2 (SPON2), só foi expressa no meio condicionado (CM) de receptor de androgénio (AR), linhas celulares de CaP positivos. Usando tissue microarray por immunohistostaining, encontramos SPON2 a ser sobre-expresso em CaP. SPON2 coloração foi mais intensa no Gleason pontuação soma 7-8 e em pacientes APC com metástase. Por análise da curva receiver característica operador (ROC), descobrimos que o nível SPON2 soro foi elevada em pacientes APC, mostrando sensibilidade e especificidade adequada para uso em diagnóstico. Nós também descobrimos que SPON2 poderia ser usado para identificar pacientes APC com níveis séricos de PSA não superior a 10 ng /ml de homens idosos saudáveis.

Conclusão /Significado

SPON2 é um novo soro e histológica biomarcador de diagnóstico para CaP. Ele pode evitar alguns dos problemas do teste PSA e foi aqui encontrada para oferecer relativamente alta sensibilidade e especificidade em relação ao PSA

Citation:. Qian X, Li C, Pang B, Xue M, Wang J, Zhou J (2012) espondina-2 (SPON2), um diagnóstico de Biomarcadores Mais Prostate-Cancer-Specific. PLoS ONE 7 (5): e37225. doi: 10.1371 /journal.pone.0037225

Autor: Christina Lynn Addison, Instituto de Pesquisa Hospital Ottawa, Canadá |

Recebido: 20 Dezembro, 2011; Aceito em 15 de abril de 2012; Publicado em: 15 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Qian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa para Jianguang Zhou e Jian Wang da National Natural Science Foundation da China (No. 30870961 e 81172445). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em os EUA, o câncer de próstata (PCA) só por si representa 28% de todos os casos de câncer em homens [1]. antigénio específico da próstata (PSA), uma serina-protease regulada de androgénios produzidos por ambas as células epiteliais de próstata normais e do cancro da próstata (CaP), é o biomarcador soro mais comumente usado para CaP [2]. A determinação dos níveis séricos de PSA e exame retal digital (DRE) são recomendados pela maioria de diretrizes clínicas para a detecção precoce do câncer de próstata [3].

Apesar de rastreio PSA tem muitas vantagens, tem sido questionada nos últimos anos anos. Uma das principais desvantagens do PSA é que ele não pode ser utilizado para monitorar os homens saudáveis ​​para o cancro da próstata com elevada sensibilidade e elevada especificidade simultânea [4]. O nível de PSA total é elevada em prostatite aguda e hiperplasia benigna da próstata (HBP) [5], [6]. Entre os homens com níveis de PSA ligeiramente elevados em 4-10 ng /ml, quatro homens que se submeter a biópsia para detectar um homem com PCA [3]. rastreio PSA também podem causar erros de diagnóstico e impedir que os pacientes que procuram tratamento em tempo hábil. Thompson et ai. descobriu que entre 2950 homens idosos com um nível de PSA de 4,0 ng por mililitro ou menos, o PCA foi diagnosticada em 449; 67 deles tiveram uma soma pontuação de Gleason de 7 ou superior [7]. Estes exemplos destacar a urgência de descobrir novos biomarcadores séricos próstata-específicos de cancro que podem discernir ng APC, bem como APCs com níveis de PSA no soro com risco de vida ≤10 /ml.

Aqui comparamos o meio condicionado concentrado (CM) de proteína a electroforese em gel bidimensional (2-dE) grafo de células BPH-1 (uma linha celular epitelial BPH, e o seu perfil de expressão de citoqueratina é consistente com uma célula epitelial luminal da próstata [8]), LNCaP, e C4-2 (uma linha celular derivada de LNCaP que é independente de androgénios, altamente tumorigénicas, e metastático [9]). Cerca de 400 pontos prata-coloração-positivos foram obtidos por 2-DE gel. Após a eliminação do ruído de fundo, padronização e análise de jogo, escolhemos 5 pontos cujas diferenças apareceu estável para a identificação LC-MS /MS. Foram identificados sete moléculas candidatas. Uma das moléculas candidatas, SPON2, só foi expressa em linhas celulares de CM CaP (Ar-positivo) andrógeno-receptor-positivas.

por microarrays de tecido imuno coloração, verificou-se que a expressão em tecidos SPON2 foi CaP maior do que em tecidos da próstata e BPH normais. expressão SPON2 foi maior nos tecidos APC com a pontuação de Gleason 7-8 e naqueles de pacientes metastáticos. Utilizando um protocolo de ELISA de sanduíche, comparou-se 13 homens saudáveis ​​idosos, a 70 pacientes com CaP e descobriram que o nível SPON2 soro foi elevada neste último. A área sob a curva característica de operador receptor (ROC) (AUC) de SPON2 soro foi maior do que 0,90, o que indica um valor mais elevado de diagnóstico. A curva ROC também sugeriu que as concentrações SPON2 séricos de cerca de 8 ng /mL deu a maior precisão e valores-97,2 preditivos melhor positivos e negativos% e 100%, respectivamente, bem como a melhor sensibilidade (100%) e especificidade (84,6%) . Comparando as curvas ROC de SPON2 soro e PSA de pacientes APC com níveis de PSA abaixo de 10 ng /mL aos controles saudáveis, SPON2 foi encontrado para diferenciar pacientes APC com PSA≤10 soro ng /ml de homens idosos saudáveis, idosos, enquanto PSA não podia .

resultados

Triagem de moléculas candidatas em linhas de células CM de CaP

Oitenta microgramas de proteínas extracelulares concentrado e purificado em CM de BPH-1, LNCaP e C4- 2 foram separados por 2-dE. As imagens digitalizadas de geles 2-DE corados com prata são mostradas na Figura 1A-C. Os resultados foram analisados ​​utilizando software PDQuest, revelando cerca de 400 pontos de proteína por gel, dos quais cinco eram up-regulamentados no CM a partir de células LNCaP e C4-2 em três ensaios repetidos independentes (as regiões correspondentes são ampliadas e mostrado na Figura 1D). . Os cinco pontos de proteínas diferencialmente expressas foram ainda detectadas por LC-MS /MS, e foram identificados sete moléculas candidatas: triosefosfato isomerase 1 (TPI1), trombospondina 1 (THBS1), fosfoglicerato mutase 1 (PGAM1), espondina-2 (SPON2), proteína sindecam ligação 1 (ST1), peroxiredoxin 1 (PRDX1) e nucleofosmina (NPM1). Como mostrado na Tabela 1, todos os sete proteínas tinham uma elevada cobertura da sequência e pontuações Mascot. A pontuação de Mowse de cada ponto e os péptidos correspondentes de cada proteína à base de probabilidade estão apresentados na Figura S1. Não fomos capazes de determinar qual das quatro proteínas candidatos identificados no ponto 1 (Tabela 1) foi regulada em CM a partir de células LNCaP e C4-2. Além disso exploração de cada proteína, no nível celular, é merecido.

electrophoregram bidimensional de meios condição de (A) células BPH-1, (B) LNCaP e (C) células C4-2 são mostrados. (D) áreas correspondentes ampliada de spots de proteínas selecionadas a partir destas linhas celulares também são mostrados. Proteínas em meios condição de todas as células foram resolvidos por eletroforese bidimensional e corado com prata. setas brancas indicam os pontos diferenciais.

A expressão de SPON2 foi regulada na CM de AR-positiva linhas de células CaP

Em primeiro lugar, foram identificados cinco dos sete moléculas candidatas por RT-PCR em seis linhas de células de próstata, na linha celular de cancro cervical HeLa, e na linha celular de cancro da mama MCF-7. Uma das moléculas candidatas, SPON2, de acordo com a tendência de o 2-seleccionado DE ponto, foi regulado para cima em cm de LNCaP e C4-2 relação à BPH-1 (Figura 2A). Os resultados de RT-PCR sugeriram que o ARNm SPON2 foi altamente expressa em linhas celulares de PCA-andrógeno-receptor positivo. Western blots de lisados ​​celulares (CL) e proteína CM também demonstraram que SPON2 foi apenas positivo no CM de LNCaP e C4-2 (Figura 2B). Isto foi consistente com os resultados de semi-quantitativa por RT-PCR. Nós estabelecemos um método para SPON2 sanduíche ELISA quantificação. Representando graficamente o log das leituras de densidade óptica corrigida (eixo dos xx) versus o log da sua concentração SPON2 correspondente (eixo y), uma equação linear foi montado como mostra a Figura 2C. SPON2, em 10 ug de proteína extracelular concentrado em CM a partir de diferentes linhas de células de próstata, foi quantificada por ELISA sanduíche, como mostrado na Figura 2D. Descobrimos, de acordo com os resultados de semi-quantitativo de RT-PCR, que SPON2 só foi expressa em linhas de células CM de CaP AR-positiva LNCaP, C4-2, e C4-2B. Foram selecionados SPON2 como um candidato para análise histológica e teste sorológico.

(A) transcrição reversa PCR análise semi-quantitativa de cinco moléculas candidatas. (B) Análise de transferência de Western de lisados ​​celulares e proteínas com meios condição SPON2 e anti-anticorpo anti-antigénio específico da próstata (PSA). (C) Curva padrão para SPON2 ELISA em sanduíche. (D) a quantificação SPON2 em 10 ug de proteína extracelular em meio condição de diferentes linhas de células de próstata.

Immunohistostaining sugeriu SPON2 era um potencial biomarcador para CaP

Duas seções de um bloco de tecido separadamente corados com hematoxilina eosina (HE) e com SPON2 são mostrados na coloração Figura 3. Ele é mostrado como controlo. A expressão de SPON2 em diferentes casos é também mostrada na Figura 3A-D. A densidade óptica integrada média (DOI) para a expressão SPON2 proteína (imuno-histoquímica) em 73 amostras contendo 10 amostras de tecido normal da próstata, 19 amostras de tecido de BPH, 44 amostras de tecido APC com diferentes escores de Gleason, e amostras de tecido CaP com e sem metástases eram calculadas usando o Image-Pro Plus 6.0 software (Tabela S1).

SPON2 densidade óptica integral (IOD) somas de todos os pacientes com câncer de próstata (A), grupo Gleason soma 7-8 (B) e metástase (C ) foram superiores aos de ambos hiperplasia prostática normal e benigna (SNK * representa SNK agrupar resultados de testes e grupos com a mesma letra não são significativamente diferentes; GS ** representa Gleason soma; M *** representa o estado de metástase).. Mesmas regiões do mesmas amostras de coloração com hematoxilina e eosina (HE) e SPON2 separadamente foram mostrados em (D).

somas SPON2 IOD foram representados por mediana (intervalo interquartil), por exemplo, M (Q

R), e estatisticamente testados pela SNK agrupamento (teste q). Descobrimos que a expressão SPON2 foi maior em CaP do que em qualquer amostras de tecidos normais ou de BPH, numa extensão estatisticamente significativa (Figura 3A)

Os espécimes CaP foram divididos em três grupos de acordo com a escala de Gleason soma:. Gleason score somas não mais do que 6, Gleason somas 7 ou 8, e classificação de Gleason soma 9 ou 10. Descobrimos expressão SPON2 no grupo resume 7 ou 8 a ser mais elevada do que em qualquer uma das amostras de tecido normal ou HBP, para um grau estatisticamente significativo. As amostras que foram somas não mais do que 6 apresentaram significativamente mais expressão do que BPH (Figura 3B)

espécimes CaP também foram divididos em dois grupos com base no status dos pacientes:. Amostras de doentes sem metástase (M0) e espécimes provenientes pacientes com metástases (M1). Descobrimos que a expressão SPON2 foi significativamente maior no grupo M1 do que em tecidos normais ou de BPH (Figura 3C).

Os níveis séricos de SPON2 foram elevados em pacientes CaP

Os níveis de SPON2 soro de 13 saudável , 70 homens idosos e pacientes com CaP (Tabela S2) foram quantificados utilizando SPON2 ELISA em sanduíche com a curva padrão acima mencionada (Figura 2C). Encontramos nível SPON2 soro de pacientes com CaP (95% intervalo de confiança, IC 95% = 27,55-52,69) foi significativamente maior do que a de homens saudáveis, idosos (95% CI = 0-7,78) (

P 0,001, Figura 4A). Sensibilidade, especificidade, AUC, e tudo o corte valores de níveis SPON2 foram determinadas usando análise ROC. valores de corte SPON2 de 3, 6, 8, 10, 15, e 20 ng /mL originou sensibilidades de 100%, 100%, 100%, 94,3%, 75,7% e 54,3% e especificidade de 69,2%, 76,9%, 84,6 %, 84,6%, 84,6% e 100%, respectivamente. Quando 8 ng /ml, foi escolhido como o valor de corte, a soma de sensibilidade (100%) e especificidade (84,6%) era a mais elevada, e os valores preditivos positivo e negativo foram 97,2% e 100%, respectivamente (AUC = 0,942, sE = 0,039, IC 95% = 0,866-1,019,

P

. 0,001)

(a) SPON2 em 70 pacientes com câncer de próstata e 13 homens idosos saudáveis ​​foram comparados. Willcoxon teste 2 amostra foi utilizada para determinar a significância das diferenças entre os dois grupos. (B) A SPON2 operador receptor característica (ROC) para os casos acima é mostrado. (C) SPON2 e curvas ROC para pacientes com câncer de próstata com PSA≤10 soro ng /mL e os homens idosos saudáveis ​​antigénio específico da próstata (PSA) são mostrados.

Os 70 pacientes CaP foram divididos em dois grupos, 9 com o nível de PSA no soro ≤0 ng /mL e 61 com o nível de PSA no soro 10 ng /mL. Os SPON2 soro e níveis de PSA destes dois grupos de pacientes foram comparados com um grupo de homens saudáveis, idosos (Tabela 2). O SPON2 soro de APC com PSA≤10 ng /ml e 10 ng /ml foi significativamente mais elevada do que a de controlos saudáveis ​​(

P = 0,0013

e

P

0,001). Como esperado, os níveis de PSA no soro de CaP 10 ng /ml foram significativamente maiores do que os dos controles saudáveis, enquanto PSA≤10 ng /ml não mostraram qualquer significância estatística em comparação com controlos saudáveis ​​(

P

= 0,2852). análise ROC para SPON2 soro de PSA e de pacientes com níveis de PSA CaP ≤ 10 ng /ml e os controlos saudáveis ​​também foram conduzidos (Figura 4C). As AUC foram 0,915 (SE = 0,063, IC 95% = 0,790-1,039,

P

= 0,001) e 0,645 (SE = 0,146, IC 95% = 0,359-0,931,

P

= 0,256), respectivamente. Para os níveis SPON2 soro desses pacientes e os controles saudáveis, um valor de corte de 8 ng /ml deu sensibilidade de 100% e especificidade de 84,6%. Para PSA, pelo valor /ml de corte 4 ng recomendado, sensibilidade e especificidade foram apenas 44,4% e 92,3%, respectivamente.

Discussão

Todas as proteínas secretadas por células viáveis ​​constituem um organismo de ” secretome “. Algumas proteínas secretadas são liberados no sangue, pelo que a investigação secretome pode ajudar a revelar biomarcadores séricos candidato novos com significado clínico potencial [10].

Gross et al. perfis de proteínas secretoma comparados em meio de células LNCaP estimuladas com androgénios, estrogénios, e interleucina-6 e descobriu que β2-microglobulina (B2M) tornou-se especificamente sobre-regulada na condição de médio de células LNCaP induzida por andrógeno [11]. Outras pesquisas sugerem que os níveis séricos de B2M são elevados em pacientes com metástases, cancro da próstata independente de androgénios. Sardana G. realizada uma análise proteômica qualitativa do CM a partir da linha de células PC3 PCA (AR)

6 e descobriu um novo biomarcador de soro APC, Mac-2BP [12]. Isto sugere que a análise de CM pode revelar mais novo, valiosos marcadores biológicos APC.

SPON2 (2-espondina, Mindin, DIL-1) pertence à família de F-espondina de proteínas de matriz extracelulares segregadas [13] . SPON2 é expresso diferencialmente em células pulmonares cancerosas e não cancerosas [14]. É essencial para a iniciação da resposta imune inata e representa uma molécula de reconhecimento de padrão único na matriz extracelular de agentes patogénicos microbianos [15]. Outro estudo relatou que serve como um ligando de integrina e é crítica para o recrutamento de células inflamatórias [16]. Pesquisas recentes têm sugerido que os membros da família R-espondina regular a via Wnt por um mecanismo comum, e que o R-spondin2 é um activador segregada de Wnt /β-catenina sinalização [17], [18]. Iris Simon descobriu que SPON2 é regulado para cima em soros de pacientes com câncer ovariano [19]. A pesquisa de Renate Parry sugeriu que SPON2 ARNm é expresso predominantemente na próstata (tanto de tumor e amostras normais), e em níveis significativamente menores em outros tecidos [20]. A análise de Romanuik demonstrado que SPON2 é enriquecida em linhas celulares de cancro de próstata humanas ao longo de outras linhas de células de cancro humano [21]. Utilizando modelos de xenotransplante tumoral LNCaP ratos nus, SPON2 foi utilizado para a radioterapia à base de anticorpo de cancro da próstata [20]. Sardana et al analisaram os proteómica cm do PC3, LNCaP, e linhas celulares de cancro 22Rv1 próstata por cromatografia bidimensional e espectrometria de massa em tandem, obtida quatro candidatos a biomarcadores incluindo espondina-2, e descobriu que seu nível de expressão em soros mostrou uma diferença significativa entre pacientes com ou sem cancro da próstata [22]. Todos estes resultados sugerem SPON2 pode ser um novo biomarcador para CaP.

Um microarray tecido da próstata foi immunohistostained com o anticorpo anti-SPON2. Descobrimos que a intensidade da coloração SPON2 da ACP foi significativamente mais intensa do que a de homens, idosos saudáveis ​​e doentes com HBP. SPON2 coloração foi mais intensa na amostra com pontuação de Gleason resume 7-8 e em amostras de pacientes com CaP metastático.

Foi utilizado um protocolo de ELISA sanduíche para comparar os níveis séricos de SPON2 13 controles saudáveis ​​e 70 pacientes CaP usando Willcoxon 2 amostra de teste e para avaliar a eficiência de diagnóstico utilizando curvas ROC. Nós descobrimos que o nível SPON2 soro foi significativamente elevados em pacientes APC. A área sob a curva de ROC era maior do que 0,90, indicando precisão. Serum SPON2 concentrações. 8 ng /mL deu os melhores valores preditivos positivos e negativos, 97,2% e 100%, respectivamente, a melhor sensibilidade (100%), ea melhor especificidade (84,6%)

Por Willcoxon de teste de 2 amostras, nós também descobrimos que os níveis de soro de pacientes SPON2 a PCA e os níveis de PSA no soro foi igual ou inferior a 10 ng /ml foi significativamente mais elevada do que a de controlos saudáveis, mas os seus níveis de PSA no soro não eram. Com base nas AUCs e seus valores CI e P 95%, curvas ROC para SPON2 soro e PSA sugeriu que SPON2 pode diferenciar pacientes APC com PSA≤10 soro ng /ml a partir, controles de idosos saudáveis ​​e que a PSA não pode.

Infelizmente nós não recolhemos qualquer soros de BPH, prostatite aguda ou pacientes neoplasia intraepitelial prostática candidatos, em parte por causa de preferências dos pacientes e em parte por causa das dificuldades de excluir concomitante CaP sem biópsia. São necessários mais estudos sobre esses pacientes, mas combinando os resultados com os resultados immunohistostaining acima mencionados, acreditamos que SPON2 mostra potencial como um biomarcador de soro mais CaP específica do que PSA.

Com base nestes resultados, concluímos que SPON2 foi um novo soro e biomarcador de diagnóstico histológico de câncer de próstata, mostrando valor diagnóstico independente e uma habilidade para evitar alguns dos problemas inerentes à PSA.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

as amostras de soro foram coletadas antes de qualquer tratamento clínico do Hospital do Câncer, da Academia chinesa de Ciências Médicas (Tabela S2). Todos os voluntários eram chineses nativos, xanthoderm. Setenta CaP pacientes deste hospital também ofereceu. Seus diagnósticos foram verificadas por biópsia, e todos deram o seu consentimento informado por escrito. Treze saudáveis, homens idosos (também com consentimento informado por escrito) ofereceu-se para servir como grupo de controle. Somente os homens encontrados por DRE e ultra-som modo B não ter legiões de próstata foram autorizados a servir como controles. Os protocolos para coleta e análise das amostras foram aprovadas pelo (NCC) Comissão de Ética do Centro Nacional de Câncer da China, de acordo com a actual revisão da Declaração de Helsínquia. As amostras foram armazenadas a -80 ° C até à análise. Os níveis de PSA no soro dos pacientes foram quantificadas utilizando um imunoensaio de electroquimioluminescência automática a Roche Elecsys bem como o seu kit de detecção de PSA electroquimioluminescência complementar (Roche Diagnostics GmbH),. Correspondente preparação curva padrão e quantificação PSA obedecidas rigorosamente o protocolo de operação oferecido pela Roche.

cultura celular

próstata humana linhas de células de carcinoma, LNCaP, C4-2, C4-2B (também celular derivado a linha de LNCaP que é independente de androgénios, altamente tumorigénicas, e metastático [9]), PC3 e DU145, que tinha sido usado na referência [23] foram obtidas como presentes de Leland WK Chung (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, EUA); linha de células BPH-1 foi um presente de J. Zhang (Universidade de Nankai, Tianjin, China, PR.) e tinha sido usado em referência [24]. A linha celular de cancro da mama MCF-7 e linha celular de cancro cervical HeLa foram adquiridas a partir da ATCC e preservados no nosso laboratório. Elas foram crescidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) suplementado com 10% de soro fetal de bovino.

a separação de proteínas por 2-DE e coloração com prata

Collection, ensaio, concentração, e purificação de proteínas a partir de CM foram realizadas como na referência [25]. amostras de proteína precipitada (80 ug) foram carregados para a separação de proteínas 2-DE usando 7 cm Tiras ReadyStrip IPG (pH 3-10, linear) em estrita conformidade com o manual do produto

2-D Eletroforese para Proteomics

(Bio -Rad), Cada experimento foi repetido três vezes de forma independente. Os géis foram corado com prata como na referência [26]. A digitalização foi efectuada com um digitalizador de mesa e processados ​​com software PDQuest (Bio-Rad). Cada gel foi normalizada pela intensidade total local válida, e manchas expressos diferencialmente foram definidas como manchas com mais do que uma diferença de duas vezes entre linhas celulares.

na digestão em gel, LC-MS /MS, e base de dados de consulta

na digestão gel, LC-MS /MS, e consulta de banco de dados são operações de rotina no centro do instrumento do nosso instituto. Protocolos estão listados em textos S1.

semi-quantitativa de transcrição reversa PCR (RT-PCR)

O ARN total foi purificado utilizando Trizol Reagent (Invitrogen Life Technologies). O ADNc da primeira cadeia foi gerado utilizando a primeira cadeia Synthesis System (TOYOBO, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers para a semi-quantitativo de RT-PCR são mostrados na Tabela S3.

Western blot

As proteínas extracelulares em CM e holoproteins em CL foram colhidos e ensaiados como descrito na referência [25]. As análises de Western blot foram também realizadas como descrito, excepto que usamos de cabra anti-humano SPON2 (R D Systems), de cabra PSA anti-humano e de coelho anti-humano β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) anticorpos [25] .

imuno coloração

Um microarray tecido da próstata humana foi comprado de Chaoying Biotecnologia Co., China, e todos os seus assuntos incluídos foram nativa chinesa. tissue microarray foi imuno-histoquimicamente coradas com anticorpo anti-SPON2 cabra (R D Systems, Inc., diluição 1:50). tal como recomendado pelo Zhongshan Goldenbridge Biotecnologia, Co., China

Cinco seleccionados aleatoriamente 400 × campos visuais por espécime foram fotografadas e a soma SPON2 IOD de cada campo foi calculada usando o programa Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). O IOD Soma de cada amostra, ou seja, a média aritmética dos montantes IOD de cinco campos selecionados aleatoriamente, foi reflexo do nível de expressão SPON2 no tecido da próstata. tecidos de câncer de próstata foram classificados de acordo com a pontuação de Gleason e sistemas de estadiamento TNM. detalhes dos tumores foram extraídos de prontuários por Chaoying Biotecnologia Co. (Tabela S1).

Estabelecimento de SPON2 sanduíche ELISA protocolo de quantificação

A microplaca de poliestireno de 96 poços foi revestida com cabra SPON2 anti-humana anticorpo policlonal (R D Systems, Inc.) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, lavada três vezes com PBST (PBS com 0,1% de Tween 20 (v /v)) e bloqueados (tampão de bloqueio: PBST com 1% de albumina de soro bovino ( BSA, v /v)). proteína recombinante SPON2 (Abnova, Inc.) foi diluída com tampão de bloqueio para concentrações específicas: 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, e 1,57 ng /mL. Estas foram utilizadas como padrões. O tampão de bloqueio serviu como padrão zero (0 ng /mL). O tampão de bloqueio foi descartado, e cada padrão foi adicionado a microplaca a 100 ul por poço, com duas repetições. A placa foi então incubada. Após três lavagens com PBST, adicionou-se de ratinho anti-humano monoclonal de anticorpo SPON2 (Abnova, Inc.) diluído com tampão de bloqueio para a microplaca e incubadas. Após três lavagens com PBST, diluiu-se anticorpo secundário correspondente e incubou-se. Após três lavagens com PBST, as soluções de substrato TMB solúveis único foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 15 minutos. As leituras de densidade óptica a 570 nm foram subtraídos das leituras a 450 nm. A média aritmética de dois poços de zero-padrão foi subtraída daquele dos dois poços repetidos. Estes valores serviu como as leituras da densidade óptica corrigida das suas concentrações SPON2 correspondentes. Ao traçar o log de leituras corrigidas ópticos densidade (eixo-x) versus o log das suas concentrações SPON2 correspondentes (eixo y), uma equação linear foi equipado como a curva padrão para SPON2 sanduíche ELISA quantificação usando o Microsoft Office Excel 2003.

soro e CM SPON2 quantificação por ELISA sanduíche

Sera eram 01:02 diluído pelo tampão de bloqueio para a amostragem. O tampão de bloqueio foi utilizada para diluir 10 ug quantidades de proteína ensaiado e concentrada cm a um volume final de 100 ul para a amostragem. O tampão de bloqueio serviu como padrão zero. De acordo com o protocolo de ELISA de sanduíche acima mencionada, excepto que foi utilizado para recolha de amostras, subtraiu-se o bem padrão zero de cada poço para proporcionar corrigidos leituras de densidade óptica de cada amostra correspondente. Cada registo de leitura corrigida como X e substituídos na curva padrão acima mencionado, para as amostras de soro, 3 × 10

Y ng /ml foi tomada como sendo a concentração de SPON2 o soro correspondente. Para CM de diferentes linhas celulares, 0,1 × 10

Y ng era o conteúdo em SPON2 10 ug de proteína extracelular concentrado em CM.

A análise estatística

2 Willcoxon teste da amostra foi utilizada para determinar o significado das diferenças entre os dois grupos de dados de distribuição de assimetria, e

P

0,05 foi considerado significativo. Por mais de três grupos de dados de medição de distribuição, foi utilizado SNK agrupamento (teste q) eo teste Kruskal-Wallis. Todas as análises acima foram realizadas utilizando o software estatístico SAS 8.0 para Windows. Curvas ROC foram construídas usando SPSS 13.0 for Windows.

Informações de Apoio

Figura S1. identificação

LC-MS /MS dos pontos seleccionados. pontuação A. Mowse da mancha 1. Cobertura Sequence B. de peptídeos para SPON2 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito). cobertura C. Sequência de peptídeos para THBS-1 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito). cobertura D. Sequência de peptídeos para TPI1 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito). cobertura E. Sequência de peptídeos para PGAM1 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito). pontuação F. Mowse da mancha 2. Cobertura Sequence G. de peptídeos para ST1 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito). pontuação H. Mowse da mancha 3. Cobertura Sequência I. de peptídeos para TPI1 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito). pontuação J. Mowse da mancha 4. Cobertura Sequence K. de peptídeos para PRDX1 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito). pontuação L. Mowse da mancha 5. cobertura M. Sequência de peptídeos para NPM1 (peptídeos correspondentes mostradas em negrito)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0037225.s001

(TIF)

Tabela S1.

Detalhes de microarray tecido da próstata humana utilizada neste trabalho de investigação, incluindo SPON2 IOD soma foi calculado.

doi: 10.1371 /journal.pone.0037225.s002

(DOC)

Tabela S2.

Detalhes de pacientes APC e homens com idades compreendidas entre normais utilizados neste trabalho de pesquisa incluindo o nível SPON2 soro foi calculado.

doi: 10.1371 /journal.pone.0037225.s003

(DOC)

Tabela S3.

Primers para Semi-RT-PCR quantitativo.

doi: 10.1371 /journal.pone.0037225.s004

(DOC)

texto S1.

Protocolos para a digestão gel, LC-MS /MS e consulta de base de dados.

doi: 10.1371 /journal.pone.0037225.s005

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