Sumário
hipometilação de DNA é uma modificação importante epigenética encontrado para ocorrer em muitos tipos de cancro diferentes, levando à sobre-regulação de genes silenciados anteriormente e perda de estabilidade genómica. Nós já demonstraram que a hipoxia e hipoglicemia (isquemia), duas mudanças micro-ambientais comuns em tumores sólidos, diminuir a metilação do DNA através da regulação negativa da DNMTs em células de câncer colorretal humanos. Aqui, utilizamos uma abordagem multi-plataforma de todo o genoma para identificar genes hypomethylated e regulados positivamente pela isquemia. Após a exposição a hipoxia ou hipoglicemia, o ADN metilado a partir de células humanas de cancro colorrectal (HCT116) foram imunoprecipitadas e analisadas com uma série promotor Affymetrix. Além disso, o ARN foi isolado e analisado em paralelo com uma matriz de expressão de Affymetrix. Ingenuity software de análise de percurso revelou que uma proporção significativa dos genes hypomethylated e upregulated estavam envolvidos no movimento celular, incluindo
PLAUR
e
Cyr61
. Um ensaio de invasão Matrigel revelou que na verdade células HCT116 cultivadas em condições de hipóxia ou hipoglicemiantes têm aumentado as capacidades de mobilidade. Confirmação da expressão de genes regulada positivamente movimento celular foi realizada com qPCR. A correlação entre isquemia e metástase está bem estabelecida na progressão do câncer, mas os mecanismos moleculares responsáveis por esta observação comum não foram claramente identificados. Nossos dados novos sugerem que a hipoxia e hipoglicemia pode estar a provocar alterações na metilação do DNA através da regulação negativa da DNMTs. Este é o primeiro relatório para o nosso conhecimento que fornece uma explicação para o aumento do potencial metastático nas células visto isquémicos;
ou seja
que a isquemia pode ser a condução hipometilação do DNA e aumentar a expressão de genes movimento celular
Citation:. Skowronki K, Andrews J, Rodenhiser DI, Coomber BL (2014) Genome-Wide Analysis in Human células de câncer colorretal revela Expressão isquemia-Mediated de Genes da Motilidade via DNA hipometilação. PLoS ONE 9 (7): e103243. doi: 10.1371 /journal.pone.0103243
editor: Hassan Brim, Howard University, Estados Unidos da América
Recebido: 14 de fevereiro de 2014; Aceito: 30 de junho de 2014; Publicação: 31 de julho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Skowronski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma Research Grant # 020094 a BLC e DR, do Instituto canadense Research Cancer Society (https://www.cancer.ca/research/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
os tumores sólidos passam por um processo fundamental conhecido como angiogênese (recrutamento de neo-vascularização), a fim de manter níveis adequados de oxigênio e nutrientes para a massa em expansão [1]. vasos sanguíneos dos tumores são altamente anormal e, devido à taxa de crescimento do tumor que ultrapasse a taxa de angiogénese, as áreas de um tumor vai desenvolver o fluxo de sangue reduzido, ou isquemia [2]. Para além de outras modificações, as regiões isquémicas terão áreas de hipoxia e hipoglicemia, e enquanto que o impacto de hipoglicemia em tumorigénese não está bem estudada, o papel de hipoxia na progressão do cancro é bem documentada e inclui o aumento da instabilidade genética, e estimulando a invasão de células e angiogênese, contribuindo assim para a metástase [3].
movimento Celular /migração é um passo crítico na metástase, que é a causa da maioria das mortalidades relacionadas ao câncer [4]. Uma variedade de modificações moleculares pode causar uma célula para ser móveis e deslocar-se para o sistema linfático ou vasculatura, conduzindo eventualmente a prender a um local novo no corpo [5]. As células dentro de um ambiente isquêmica têm potencial metastático superior através do upregulation de genes tais como
VEGF
para estimular a angiogênese, e
uroquinase do ativador do plasminogênio
(
uPA
) que activa plasmina para degradar a ECM [5]. Através da estabilização de uma subunidade a do factor de transcrição hipóxia-responsivo, HIF1α, hipoxia dirige a expressão destes dois genes, e muitos outros, promover metástases. As células também podem ser tornados mais móveis via reprogramação epigenética. Vários genes relevantes, tais como
uPA
[6] e
S100A4
padronização epigenética [7] têm alterado em células cancerosas, permitindo que a morfologia das células que ser modificado para um estado mais metastático favorável. O que permanece desconhecido é se as modificações epigenéticas e isquemia estão ligados na promoção da metástase do tumor.
metilação do DNA é um mecanismo epigenético importante que regula a expressão de genes [8]. ADN metilado está associado com o silenciamento transcricional, uma vez que os grupos de metilo a resíduos de citosina mudar a configuração de ADN e, por conseguinte, impedir que os factores de transcrição de ligação [9], bem como desencadear o recrutamento de repressores e cromatina modificar enzimas que silenciar mais expressão por meio de condensação da cromatina [10], [11]. Vários metiltransferases de ADN (DNMT) catalisar a conversão de citosina e 5-metilcitosina [12], com as DNMTs mais comumente estudada sendo DNMT1 (a metiltransferase de manutenção) e DNMT3a e DNMT3B (
de novo de
metiltransferases) [13] .
No câncer, duas interrupções comuns aos padrões de metilação de DNA são observados: hipermetilação específico do promotor e hipometilação mundial [14]. A maioria dos estudos têm-se centrado sobre hipermetilação de ADN e o impacto que o silenciamento de genes supressores de tumores tem na iniciação do tumor, progressão e prognóstico. hipometilação do DNA, por outro lado tem sido ofuscado pela extensa atenção para hipermetilação DNA na terapia do cancro, apesar de hipometilação foi a primeira interrupção epigenética observado no cancro [15], [16]. Apesar da falta inicial de compreensão sobre a importância da hipometilação do DNA no câncer, sabe-se agora que as sequências repetitivas tornar desmetilado e levar ao caos genômico [17], [18]. Tal como acontece com a hipermetilação do ADN, pode ser hipometilação específica do local, contribuindo assim para uma maior expressão [16]. Em adição a tais efeitos específicos do gene, a instabilidade genómica, perda de imprinting [19] e a activação do cromossoma X anormal também contribuir para a tumorigénese [20].
Hoffmann e Schultz [16] a hipótese de que a hipometilação de ADN acelera a adaptação de células cancerosas para o microambiente dinâmica através de selecção para as funções de genes específicos, tais como a motilidade. A evidência para esta teoria reside no ativador do plasminogênio uroquinase
(uPA
) gene. Uma protease serina envolvido na degradação da matriz extracelular,
uPA tem sido mostrado para ter uma região de promotor hypomethylated, levando a sobre-expressão em ambos cancro da mama e da próstata e está directamente relacionado com o aumento do potencial invasivo e metastático [ ,,,0],6].
associado ao melanoma antígeno
(
MAGE
) é outro do grupo de genes encontrados para ser desmetilado e regulada em muitos cancros como o melanoma, colorectal, gástrico e câncer de pulmão não-pequenas células [ ,,,0],21], [22], [23], [24], [25]. Em geral, vários mecanismos podem ser responsáveis pela desregulação de metilação de ADN em cancro. Superexpressão de DNMTs tem sido relatada em muitos cancros diferentes [26] e explica hipermetilação aberrante, mas menos foco tem ido para a compreensão hipometilação do DNA, apesar de DNA hipometilação desempenha um papel igualmente importante na modificação do epigenoma câncer.
A nossa trabalho anterior descrito um relacionamento romance entre isquemia e metilação do DNA, com a redução da citosina metil visto em células de regiões isquêmicas de tumores [27]. Nós também descobrimos que em células cancerosas HCT116 humanas colorretais, DNMT1, DNMT3a, e expressão DNMT3B e as atividades foram reduzidas em
in vitro
hipoxia e hipoglicemia [28]. Estas mudanças na expressão e actividade foram concomitante com hipometilação do
p16
INK4a e região promotora em condições de hipoglicemia [28]. No presente estudo, nós exploramos a expressão e metilação alterações nas células HCT116 em um nível de todo o genoma, utilizando uma abordagem de plataforma cruzada para identificar genes regulados por condições isquémicas. Dadas as nossas descobertas anteriores, combinadas com a observação comum de aumento do potencial metastático nos tumores de isquemia, a hipótese de que o aumento da motilidade celular de células de cancro colorectal humano em condições isquémicas é devido à regulação positiva de genes associados à motilidade, e que estas alterações na expressão são impulsionado por hipometilação do DNA mediada por isquemia.
resultados
número de variação cópia Minimal
o número de cópias de genes nas células HCT116 foi avaliada com a matriz Affymetrix SNP 6.0 para determinar Se, e em que medida, as células que tinham usado deriva /mutado em cultura comparado com o cariótipo original da linha celular. Quando comparado com um cariótipo humano normal reunido a partir da base de dados International HapMap Project [29], as células não tinham anomalias cromossómicas extensas (Figura 1). Fizemos observar regiões em 8q, 10q, 16q e 17q que exibia ganhos cromossômicas regionais (indicados em vermelho), como descrito anteriormente por outros [30]. Muito poucos perda completa de cópias foram vistos (azul), excepto para o cromossoma Y, que foi relatada como sendo ausentes em 50-100% de células HCT116 [31]. Assim, em comparação com outras linhas celulares de cancro, HCT116 têm um cariótipo relativamente normal e estável com instabilidade cromossômica mínima [30].
Numbers (e X /Y) correspondem aos cromossomos e MT representa DNA mitocondrial. Os resultados foram comparados a um conjunto de dados do Affymetrix contendo 270 amostras de população mista do Projeto Internacional HapMap [29]. Regiões em cinza indicam nenhuma mudança no número de cópias, vermelho indica um ganho número de cópias, e azul uma perda do número de cópias. Esta matriz foi realizada em duplicado.
impactos Hipoglicemia mais genes do que a hipóxia
A análise de expressão foi realizada para avaliar quantitativamente as mudanças de expressão de genes em células HCT116 em condições isquêmicas. As matrizes de expressão indicou que após exposição a hipoxia durante 48 horas, as células HCT116 tinha 310 e 1081 genes para cima e para baixo-reguladas, respectivamente. Quando as células foram expostas a hipoglicemia, 1052 e 2433 genes foram para cima e para baixo-regulado, respectivamente (Tabela 1). Análise de metilação do promotor utilizando matriz ladrilhos Affymetrix 1.0R revelou que a hipoxia resultou em 1386, e os genes hypomethylated 1655 genes hipermetilado. Crescimento em condições de hipoglicemia resultou em 1940 genes hypomethylated e 1980 genes hypermethylated (Tabela 1). Assim, ambos os padrões de metilação de expressão e promotor foram mais fortemente impactado pela hipoglicemia, como medido pelo número total de genes significativamente alterados.
Cross-plataforma de análise
Em seguida, avaliou-se o funcional significado dessas expressão genética complexa e perfis epigenéticos (de metilação do DNA). Usando a Partek Software Suite, genes únicos que foram hypomethylated e upregulated (bem como hypermethylated e reprimidos) foram sobrepostos, a fim de identificar alterações na expressão de genes associados às alterações na metilação do promotor. Havia 58 genes únicos hipermetilado e reprimidos por condições hipóxicas, e 161 genes por hipoglicemia (dados não mostrados). Estamos focados em genes que foram hypomethylated e aumento na expressão, uma vez que o nosso trabalho anterior mostrou DNMTs foram reprimidos na isquemia. Observou-se que 18 e 96 genes únicos foram hypomethylated e regulada positivamente pela hipoxia e hipoglicemia, respectivamente (Figura 2). listas parciais destes genes pode ser visto nas Tabelas 2 e 3, com a lista completa apresentada na Tabela I em Informação S1.
número de genes que foram significativamente hypomethylated e regulada por hipóxia (A) e hipoglicemia ( B) são indicados nas regiões sobrepostas.
Ingenuity Análise Caminho de genes hypomethylated e upregulated
Ingenuity Pathway Analysis (IPA) foi usada para analisar e classificar os genes hypomethylated e upregulated em vias funcionais, a fim de compreender melhor a importância biológica dos genes do nosso conjunto de dados. O software determina se uma função biológica é enriquecido em um, examinando a lista gene inteiro para anotações funcionais encontrados na base de conhecimento de ingenuidade, e realizando o teste exato de Fisher comparando a proporção de genes com uma dada anotação no conjunto de dados com os dados a proporção de genes ter essa mesma anotação em toda a população (
ou seja
todos os genes na matriz HG U133 mais 2,0). Se a primeira relação é significativamente maior do que o segundo, então a lista é dito para ser enriquecido para genes que têm essa anotação
Com a exposição hipóxia, os três principais funções celulares de nossa lista de genes hypomethylated /upregulated eram.: célula-a-célula desenvolvimento de tecido conjuntivo (Figura 3) de sinalização, movimento celular, e. A hipoglicemia enriquecido para alterações na morte da célula, do ciclo celular, e a regulação da expressão do gene (Figura 4). Apesar de não ser dentro do top algumas categorias funcionais, movimento celular foi também uma função enriquecido no grupo de hipoglicemia. A análise de redes foi também realizado para fornecer uma representação gráfica de relações biológicas conhecidas de genes regulados positivamente e hypomethylated. As redes são geradas por meio da determinação de uma molécula de foco, e depois examinar as listas de genes para a maioria das ligações na molécula de foco, com base na literatura na base de dados da capacidade. As redes de topo (tendo a maioria das conexões), tanto em hipoxia e hipoglicemia envolvidos genes que têm papéis em movimento celular. Em condições de hipóxia,
PLAUR, LDLR
, e
LAMB3
(Figura 5A) estavam todos em uma rede e têm sido mostrados para ser envolvido em movimento celular. A rede superior em condições de hipoglicemia incluídos genes movimento celular
ETS1,
KLF4, IL6ST, NEDD4L, e
ARN
(Figura 5B). É importante notar que alguns genes em nossa lista pode ter funções biológicas /anotações que o banco de dados Ingenuity não reconhece. Como exemplo,
AFAP1L1
não estava na lista Ingenuity de genes envolvidos no movimento celular, entretanto, há evidências para o papel desta molécula na migração e invasão [32]. Com base na análise IPA das vias funcionais e redes, a categoria “movimento celular” apareceu interessante e relevante e nós perseguido ainda mais os genes associados a essas funções para validação de matriz.
banco de dados Ingenuity Pathways A análise foi usado para atribuir genes para funções biológicas e determinar funções que foram enriquecidos, com base na significância estatística.
banco de dados Ingenuity Pathways a análise foi usado para atribuir genes para funções biológicas e determinar funções que foram enriquecidos, com base na significância estatística.
As redes de topo (a maioria das ligações a molécula central) para genes hypomethylated e upregulated são apresentadas para hipóxia (a) e hipoglicemia (B). A intensidade da coloração vermelha das moléculas reflecte o nível de expressão como encontrado na matriz de expressão (mais escuras significa maior aumento da expressão em comparação com as condições de controlo).
genes associados à migração são enriquecidos em hipoxia e hipoglicemia
A análise multi-plataforma de genes hypomethylated e upregulated por hipoxia e hipoglicemia revelou uma série de genes que estão envolvidos no movimento celular:
LDLR, LAMB3, ALDOA, PLAUR, SCAI,
e
NEDD4L
no grupo hipóxico (Figura 3), e
ITGB1, ETS1, IL6ST, ARN, TJP1, Smad3, TMOD3, LATS2, KLF4, ADI1, NCOA3, PTEN, CSNK2A2, TRIO, CSNK2A1, BRD4, RTN4, SEMA3C, NEDD4L
,
Cyr61, TFPI,
e HEY1 no grupo de hipoglicemia (Figura 4). Em adição a estes genes, observou-se que os outros dois foram regulados positivamente hypomethylated e provavelmente também envolvido em movimento celular.
ANKRD37
e
AFAP1L1
no ‘grupo hipóxico “foram mostrados para ser envolvido na migração e invasão das células cancerosas (Tabela 2). Muitos dos genes de “movimento celular” na nossa análise estão envolvidos na mediação de adesão celular, ou para outras células ou a ECM, ou na degradação da ECM, todos os processos necessários para uma célula para se mover no interior do tecido e para inserir os vasos sanguíneos.
a confirmação da expressão aumentada de genes movimento celular
utilizadas qRT-PCR para quantificar a expressão de genes seleccionados a partir de ambos os grupos de hipoxia e hipoglicemia. Nós escolhemos focar em genes envolvidos no movimento celular identificada na análise multi-plataforma como regulada e hypomethylated. Para o grupo hipóxia, examinamos
PLAUR
,
AFAP1L1
, e
LAMB3
. Ambos PLAUR e LAMB3 foram significativamente regulada positivamente em hipoxia, em comparação com as condições de controlo (Figura 6A). A dobra-alterações na expressão destes dois genes tal como determinado por qRT-PCR foram comparáveis à dobra-visto mudança na matriz expressão (Tabela 2). Genes avaliados para mudanças de expressão por qRT-PCR em condições de hipoglicemia incluídos
EphA2,
ARN
,
NEDD4L
, e
Cyr61
. Todos estes quatro genes foram regulados positivamente na análise de arranjo de expressão e hypomethylated na matriz ladrilhos promotor, excepto o EphA2 não foi hypomethylated de acordo com a matriz de promotor. regulação positiva significativa do EphA2, NEDD4L Cyr61 e em hipoglicemia foi confirmada por qRT-PCR (Figura 6B).
os níveis de ADNc a partir de células crescidas em hipoxia HCT116 (A) e hipoglicemia (B) foram medidos para os genes de interesse e normalizado para p-actina, e de controlar. N = 5 para nenhum oxigénio e N = 3 para não glicose. * Indica diferença significativa relativamente ao controlo;
p
≤0.05.
isquêmicos-condições melhoram HCT116 motilidade
ensaios de invasão foram realizados para determinar os efeitos da isquemia sobre a motilidade celular. Após 48 horas em condições isquémicas, tornou-se evidente que as células expostas à hipoxia e hipoglicemia tinham aumentado significativamente de mobilidade e capacidades invasivas, como determinado pela capacidade das células para se degradarem e migram através de Matrigel (Figura 7). Este ensaio funcional suportada nossa descoberta de que a expressão elevada de genes associados a mobilidade através hipometilação do promotor em condições isquémicas traduz a alterações fenotípicas em células HCT116.
imagens celulares tomadas a 10 × ampliação da parte inferior das transwells Matrigel-revestidas (UMA). células de refracção de luz (preto) indicam que estas células que migraram através da membrana Transwell. Número de células HCT116, que invadiu transwells Matrigel revestidos após 48 horas de exposição a qualquer de oxigénio (NO) e sem glicose (NG), seguido de 24 horas nas transwells (B). * Indica diferença significativa relativamente ao controlo;
p
. 0,01
Discussão
Neste estudo, utilizamos uma abordagem multi-plataforma de identificar alterações do genoma na metilação do promotor e expressão gênica para descobrir como aguda impactos isquemia expressão do gene mediada por metilação em células de câncer colorretal em humanos. Foram identificados e verificaram que os genes envolvidos no reforço movimento celular são regulados sob condições isquêmicas, representado por hipoxia e hipoglicemia
in vitro
.
isquemia aguda ocorre frequentemente em tumores sólidos, devido à vascularização do tumor dinâmica e da rápida expansão dos tumores superior a angiogênese [2]. Nós previamente estabelecido que a isquemia aguda leva a sub-regulação de ambos os conteúdos metilcitosina celular e expressão e actividade DNMT [27], [28]. Para prosseguir este achado e identificar quais genes são hypomethylated e regulada pela isquemia em uma escala global, usamos plataformas que compartilham a base comum de tecnologia Affymetrix para facilitar o cruzamento de conjuntos de dados. Utilizou-se, assim, um único pacote de software de bioinformática (Partek Genomic Suite) para importar, analisar e correlacionar dados brutos das várias plataformas de microarray [33]. Do nosso, o estudo multi-plataforma de todo o genoma, encontramos condições isquêmicas upregulated significativamente genes envolvidos na motilidade celular e invasão, e estes genes tinha desmetilado regiões promotoras identificados pelas matrizes. Por isso, o nosso multi-plataforma análises apontam para um conjunto de genes que parecem responsivo à hipóxia ambiental e hipoglicemia via alterada metilação CpG.
Estudos anteriores demonstraram que alguns genes mediada por HIF1 (
por exemplo CA9, EPO
) requerem o CpG dentro do elemento de resposta de hipoxia (HRE) para ser desmetilado, a fim de HIF1 para se ligar, e expressão de ocorrer [34] – [36]. S100A4, um membro da família S100 de Ca
2 + liga�o ao proteínas, é conhecido por estar envolvido na motilidade celular do cancro pela sua capacidade para activar miosina não-muscular, e foi mostrado estar relacionado com o cancro gástrico progressão [ ,,,0],34]. S100A4 foi regulada por hipóxia em câncer de ovário, com a metilação reduzida do HRE no
regiões promotoras de S100A4 Comprar e aumentou a ligação de HIF1 [7]. Estes estudos fornecem provas para o conceito de que a hipometilação é necessário em condições de hipóxia para a expressão do gene ocorra.
Um gene relevante significativamente regulada e hypomethylated por hipóxia de nossa análise multi-plataforma é receptor do ativador do plasminogênio uroquinase, ou PLAUR , o receptor para o activador do plasminogénio tipo uroquinase (uPA). uPA é uma serina-protease que catalisa a conversão de plasminogénio a plasmina, a qual degrada em seguida, o ECM [35]. PLAUR está envolvido no movimento celular e metástase [36] e expressão aumenta durante a transição crítica da adenoma displásicos grave a carcinoma invasivo do câncer colorretal [35]. Além disso, PLAUR é regulada positivamente em hipoxia [37] através de actividade HIF1 [38], e é responsável pela invasividade mediada por hipoxia em células HCT116 [39]. Como assim, o uPA ligante é regulada pelo fator de transcrição ETS1, e os sítios de ligação para ETS1 no
uPA
promotor também deve ser desmetilado para a transcrição de ocorrer [40].
A laminina beta 3 (LAMB3), uma subunidade de laminina-5 (laminina-332), é uma proteína da membrana basal pensado para mediar a ligação de células, migração, organização e de células durante o desenvolvimento embrionário. expressão LAMB3 é maior no carcinoma epidermóide de esôfago maligna do que no tecido normal, e expressão correlaciona-se com profundidade de invasão e sobrevivência [41]. LAMB3 também tem sido relatado para ser hypomethylated e regulada positivamente em cancro gástrico [42]. Nós confirmou que LAMB3 foi regulada em condições de hipóxia no CRC. Curiosamente, um estudo examinou biópsias adenocarcinoma de cólon, e viu laminina-5 coloração positiva foi associada com brotamento células cancerosas localizadas na ponta de invadir o epitélio maligno, e que laminina-5 colocalized com PLAUR [43].
além de
PLAUR
e
LAMB3
,
S100A10
foi outro gene regulada por ambos hipoxia e hipoglicemia com base na nossa análise de matriz, e tem se mostrado importante na célula cancerosa invasão e metástases através de uma co-localização com o sistema de uPA /PLAUR [44]. S100A10 é sobre-expresso em cancro gástrico [45] e é essencial para a migração de macrófagos associados a tumores em locais de tumores [46]. Nós somos o primeiro a relatar que
PLAUR
e
LAMB3
parecem ser alvos de genes-chave no hipometilação mediada por isquemia, semelhante à
S100A4
. PLAUR, LAMB3 e S100A10 poderia estar trabalhando em conjunto com os outros para aumentar a mobilidade celular em tumores hipóxicos. Mais estudos são necessários para determinar se estas proteínas são colocalized no tecido hipóxico.
61 (Cyr61) é um membro da família do CCN de fatores de crescimento ricos em cisteína. Cyr61 é conhecido por ligar a superfície celular e o ECM, e está envolvido na adesão celular, proliferação e migração [47]. Nós identificamos
Cyr61
como um gene hipoglicemia-responsivo. Cyr61 expressão é aumentada em uma variedade de cancros, incluindo mama, melanoma, glioma, gástrico, do cólon, da bexiga, da próstata, do pâncreas e [47]. O silenciamento de Cyr61 no osteossarcoma e células de carcinoma escamoso esofágico levou a migração reduzida e a invasão de células [48], [49]. Cyr61 expressão tem sido demonstrado que se correlacionam com a agressividade de células de cancro do pâncreas, o que demonstra ainda mais o papel deste factor de crescimento de metástases em [47]. Até o momento, não há estudos que mostram que
Cyr61
expressão é regulada por metilação do promotor. No entanto, a expressão Cyr61 é regulada pelo factor de transcrio STAT3 [50], e outros demonstraram que o CpG no local de ligação a STAT3 requer desmetilação para STAT3 para ligar e expressar os seus genes-alvo [51].
Dois outros genes que foram regulados positivamente em nossa análise por hipoglicemia foram
EphA2
e
NEDD4L
. EphA2 é um receptor transmembranar da tirosina quinase, que é sobre-expressa em muitos carcinomas, incluindo o cancro colo-rectal fase precoce [52], e a sua expressão está altamente correlacionado com a invasão tumoral e metástase [53]. NEDD4L é uma ubiquitina-ligase E3 demonstrado que têm expressão aumentada com a progressão do câncer de vesícula biliar. Usando siRNA, silenciamento de NEDD4L levou à diminuição Matrigel e colágeno invasão das células cancerosas da vesícula biliar, e seu papel na invasão é possivelmente devido à sua associação com MMPs [54]. Atualmente, não existem estudos que demonstram que a desmetilação promotor poderia ser responsável pela regulação positiva de um desses dois genes.
antígenos associados a melanoma (magos) são um grupo de genes cuja expressão é silenciada na maioria tecido somático normal, excepto no testículo, mas regulado positivamente em muitos cancros [22]. Um estudo mostrou que a região promotora de
MAGE-A1
contém dois locais de ligação ao ETS, que deve ser desmetiladas para o factor de transcrição e expressão de se ligar a ocorrer [55]. A desmetilação e expressão foram observados em várias linhas de células de cancro diferentes, e o tratamento com 5-aza-dC aumento da expressão de MAGE-A1, em fibroblastos normais devido a desmetilação na região promotora. A expressão de MAGE-A1 e -A4 tem sido mostrado para ser correlacionado com o estágio da doença em pacientes com melanoma [23]. Ambos desmetilação e expressão de MAGE-A1 e -A3 tem sido visto em câncer colorretal [22] e em pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas, onde a expressão correlacionada com mau prognóstico [24]. Nossos dados de matriz indicou que dois genes MAGE foram desmetilado por hipóxia (
MAGEA11
) e hipoglicemia (
MAGEB1
), embora não se observou indução da expressão. No entanto, os Mages são um grupo de genes que suportam a importância de resíduos de CpG desmetilados em factor de transcrição sítios de ligação, e que a desmetilação no cancro podem ser específicos para o gene.
Dois outros genes envolvidos no movimento celular,
AFAP1L1
e
ARN
, que estava determinada a ser significativamente regulada em hipoxia e hipoglicemia pelos microarrays, respectivamente, também foram quantificados por qRT-PCR. Ambos os genes não demonstraram aumento da expressão quando marcada por qRT-PCR, possivelmente devido a hibridação cruzada de sequências não-específicos ou variantes de splicing, dois motivos mais comuns para discrepâncias entre os resultados de microarray e qRT-PCR [56].
Existem provas suficientes na literatura apoiando o conceito de que CpG dentro de diferentes factor de transcrição sítios de ligação (tais como HRE, STAT3 e ETS) deve ser desmetilado em ordem para a transcrição ocorra, e mais importante ainda, alguns destes genes estão envolvidos no aumento da motilidade celular. Neste estudo, contribuíram para este importante conceito fornecendo evidências por meio da análise de matriz multi-plataforma para outros genes do movimento celulares que são hypomethylated e regulada pela isquemia. Nós validado alterações na expressão dos genes movimento celular PLAUR, LAMB3, EphA2, NEDD4L, Cyr61 e em condições isquémicas. É sabido que os níveis de HIF1α são mais elevados na mama e de metástases do cancro do cólon [3]. Esta observação complementa a nossa conclusão de que a hipóxia diminui a metilação, e que uma diminuição da metilação de CpG de HRE em seguida, poderia facilitar a ligação HIF e expressão do gene promotor. Talvez diminuição induzida por hipoxia de níveis DNMT é um evento precoce em tumores primários. As células com a metilação do DNA diminuiu são, portanto, em seguida, preparado para o fator de transcrição de ligação aos promotores de genes que irão reforçar o movimento celular, como
PLAUR
. A importância da hipóxia na progressão do cancro é bem demonstrado em pacientes com câncer cervical cujos tumores são hipóxica e têm maior incidência de metástase, em comparação com pacientes com tumores de uma melhor oxigenação [57]. É claro que a progressão do câncer influências hipóxia e alterações globais na metilação do DNA são uma ocorrência comum influenciar a progressão do câncer [58].
Análise IPA dos dados multi-plataforma para genes que foram ambos hipermetilado e reprimidos genes identificados envolvido em funções celulares, tais como o movimento celular e sinalização célula-a-célula e interacção (Tabelas II e III em Informação S1). Regulação negativa de genes envolvidos na adesão celular pode conceptualmente contribuir para o aumento da motilidade celular e metástase. Com o prosseguimento da revisão da literatura, muito poucos destes genes hypermethylated e reprimidos estão associados com adesão célula-célula. Embora uma ideia interessante, os nossos dados não suporta supressão de adesão célula-a-célula expressão da molécula como um mecanismo provavelmente responsável pelo aumento da motilidade visto na isquemia.
DNMT inibidores tais como a decitabina têm sido utilizados clinicamente com algum sucesso no tratamento de malignidades hematológicas, tais como leucemia mielóide aguda [59]. No entanto, a eficácia destes inibidores não tenha sido replicado em tumores sólidos [60]. genomas cancro submetidos a hipometilação concorrentemente com a hipermetilação [61], assim ainda mais a hipometilação com inibidores DNMT resolve apenas uma metade da desordem metilação. Além disso, tumores sólidos têm uma característica única falta em cancros hematológicos: um microambiente com as regiões isquêmicas. Como já demonstrado anteriormente, a expressão e a actividade DNMT são reduzidos em condições isquémicas [28]. Portanto, o uso de inibidores DNMT em tumores com regiões isquêmicos podem ser ineficientes na terapia do câncer se estas regiões já estão passando por hipometilação como resultado da repressão DNMT mediada por isquemia.
Conclusões
É bem conhecido que as condições isquêmicas conduzir a metástase do câncer, e aqui nós sugerem um mecanismo potencial para esta ocorrência comum: através de hipometilação do DNA facilitada pela isquemia mediada por down-regulação da DNMTs. II. III.