Abstract
A seleção dos pacientes com cancro do pulmão para a terapia com inibidores da tirosina quinase dirigidas a EGFR requer a identificação de determinado
EGFR
mutações. Na maioria dos pacientes com amostras de tumor limitado avançados, carcinoma de pulmão inoperável muitas vezes representam o único material disponível tanto para tipagem histológica e análise molecular. Foi definido um protocolo seguinte geração de sequenciamento alvejado a
EGFR
exons 18-21 adequado para o diagnóstico de rotina de tais amostras clínicas. O protocolo foi validado através de uma série não selecionada de 80 biópsias de pequenos (n = 14) e a citologia (n = 66) tomas representativas do material normalmente apresentadas para avaliação de diagnóstico para três centros médicos de referência em Itália. Os espécimes foram avaliados sistematicamente para o número de células tumorais e proporção relativa de células não neoplásicas. Eles foram analisados em lotes de 100-150 amplicons por corrida, alcançando uma sensibilidade analítica de 1% e obtenção de um número adequado de leituras, para cobrir todos os exons em todas as amostras analisadas. sequenciamento de próxima geração foi comparado com seqüenciamento Sanger. Este último identificados 15
EGFR
mutações em 14/80 pacientes (17,5%), mas não detectado mutações quando a proporção de células neoplásicas foi inferior a 40%. geração de sequenciamento próxima identificadas 31
EGFR
mutações em 24/80 casos (30,0%). As mutações foram detectadas com uma proporção de células neoplásicas tão baixas como 5%. Todas as mutações identificadas pelo método de Sanger foram confirmadas. Em 6 casos próxima geração sequenciação identificado exão 19 deleções ou a mutação L858R não observada após a sequenciação de Sanger, permitindo que o doente a ser tratado com inibidores de tirosina-quinase. Em um caso adicional a mutação R831H associado com resistência ao tratamento foi identificado em um
EGFR
selvagem tipo de tumor após seqüenciamento Sanger. geração de sequenciamento próxima é robusto e de baixo custo e melhora a detecção de
EGFR
mutações. A sua utilização deve ser promovida para o diagnóstico clínico de mutações em amostras com conteúdo de células tumorais desfavorável
Citation:. De Biase D, Visani M, Malapelle U, Simonato F, Cesari V, Bellevicine C, et al. (2013) Next-Generation Sequencing do cancro do pulmão
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exons 18-21 Permite eficaz diagnóstico molecular de amostras de rotina Pequenas (citologia e biópsia). PLoS ONE 8 (12): e83607. doi: 10.1371 /journal.pone.0083607
Edição: Pan-Chyr Yang, da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan
Recebido: 18 Agosto, 2013; Aceito: 05 de novembro de 2013; Publicação: 23 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 de Biase et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores confirmar que este estudo foi apoiado por uma bolsa italiana MURST Governo (Grant não. 20093XZC57_003) para GT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinoma de pulmão apresenta frequentemente em estágio avançado e é a principal causa de morte relacionada ao câncer nos países desenvolvidos (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). A descoberta em 2004 de que mutações ativadoras somáticas na tirosina quinase
gene EGFR Ganhe o tumor sensível a tirosina quinase tratamento (TKI) tem representado um dos mais significativo avanço no campo da oncologia molecular na última década [1,2]. ensaios clínicos randomizados têm demonstrado respostas dos pacientes ao TKI Erlotinib (Tarceva, OSI Pharmaceutical) ou Gefitinib (Iressa, Astrazeneca) como tratamento de primeira linha em aproximadamente dois terços dos pacientes com
EGFR mutado
tumores com taxas muito superiores aos os obtidos com convencional à base de platina quimioterapia [3-9].
EGFR
mutações tornaram-se biomarcadores “críticos” para selecionar adequadamente pacientes para tratamento TKI e diretrizes para o diagnóstico molecular foram delineadas pelas organizações profissionais tanto na Europa como nos Estados Unidos [10, 11]. A maioria – 80-90% – do
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mutações são ou pequenas exão 19 supressões ou a mutação L858R no exão 21, mas outras TKI sensível
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mutações podem ocorrer em exons 12, 19 , 20, 21. as mutações associadas à resistência à TKI, como a T790M no exão 20, pode também desenvolver-se em células tumorais sublclones pequenos e precisam de ser identificados [1,2,8,12-23].
EGFR
tumores mutantes são tipicamente adenocarcinomas, em que as mutações podem ser identificadas em cerca de um quarto dos casos, e em uma proporção mais elevada de tumores de doentes asiáticos.
Os adenocarcinomas são agora considerados como o carcinoma de pulmão subtipo mais comum, constituindo aproximadamente 40% de todos os cânceres de pulmão não pequenas células (CPNPC) [24] e análise molecular de
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exons 18, 19, 20, 21 é recomendado em todos os tumores de adenocarcinoma do pulmão ou com um componente de adenocarcinoma [10]. Assim, a avaliação patológica de um carcinoma do pulmão agora requer um subtipos precisos por histológicas e imuno-histoquímico estudos, bem como a determinação do
estado mutacional EGFR
para selecionar pacientes para terapia de TKI. Essa avaliação em profundidade, obviamente, requer quantidades adequadas de tecido tumoral de boa qualidade, como aqueles obtidos a partir de ressecções pulmonares [25].
Infelizmente 60% das NSCLC são elevados estádio localmente avançada e /ou inoperacional tumores que já metástase para locais distantes no momento em que são detectados (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Assim, em pacientes com tais tumores muito amostras limitadas – pequenas biópsias ou espécimes de citologia – geralmente são o único material disponível para a tipagem histológica e para a análise molecular [26]. Nestas amostras o problema de pureza espécime isto é, a proporção de material da lesão para as células benignas ou não-lesionais “contaminantes” é muitas vezes crítico [27,28]. Sanger de sequenciação, o método mais amplamente utilizado para a detecção da mutação não tem sensibilidade analítica suficiente para identificar com segurança as mutações em amostras com uma baixa proporção de células tumorais. Ele pode dar resultados falsos negativos se a percentagem de células neoplásicas está abaixo de um limiar geral de 50% que corresponde a 25% alelos mutados, assumindo que a mutação é heterozigótica e que o
EGFR
local cromossómico 7p12 é dysomic [29 ]. métodos, portanto, alternativas – cada um com suas próprias vantagens e desvantagens – têm sido propostos para detectar
EGFR
mutações com o objetivo de alcançar uma maior sensibilidade. Muitos são actualmente utilizados para a análise molecular das amostras de rotina [30]. Estes incluem resolução de fusão alto (GRH) [31], Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) [32], mutante específica para o alelo de PCR [33], Peptide Nucleic Acid Locked PCR de aperto (PNA-PCR) [34,35], pyrosequencying [36], e imuno-histoquímica com anticorpos EGFR específicos que detectam a mutação L858R e exão 19 deleção [37,38]. Alguns métodos específicos de mutação como os braços Scorpion (kits de mutação TheraScreen EGFR29 de QIAGEN Manchester [anteriormente DxS], Manchester, Inglaterra) [39] chegar a uma sensibilidade muito alta (~ 1%), mas não subestimar mutações pré-concebido e exigem uma vez quantidade significativa de DNA, nem sempre disponível em amostras limitadas [40,41]
o desenvolvimento da próxima geração de sequenciamento (NGS) métodos -. também conhecido como sequenciamento paralelo maciço uma vez que permitem a análise paralela de um muito grande número de moléculas de DNA – tem representado um dos avanços técnicos mais importantes em biologia molecular [42]. Estes métodos tornaram-se disponíveis desde 2005 e estão produzindo avanços notáveis em oncologia, incluindo a definição da sequência de ADN inteira de tipos comuns de câncer em humanos [43].
Este é um estudo multicêntrico para avaliar a aplicação da NGS ao diagnóstico molecular de
EGFR
mutações em amostras limitadas de NSCLC, pequenas biópsias e espécimes de citologia. Em vez de analisar alguns casos para um grande número de genes, optamos por direcionar sequenciamento paralelo ao
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mutação “hot spots”. O foco foi em
EGFR
análise, porque, como mencionado acima,
EGFR
mutações muitas vezes precisam de ser identificados em ADN extraído de amostras que são tanto problemático para o diagnóstico molecular e ao mesmo tempo são muito crucial para decidir o tratamento do paciente. resultados de sequenciamento NGS foram comparadas com as de seqüenciamento Sanger, o método atualmente em uso para a análise molecular de rotina nos três centros parceiros italianos em Bolonha, Padova e Nápoles, que participou do estudo.
Nós fundamentado que, em apesar da sua maior complexidade, quando comparada com Sanger de sequenciação (ou outros métodos alternativos) NGS oferece várias vantagens – elevada sensibilidade analítica, análises de toda a sequência de nucleótidos da região relevante, a avaliação semiquantitativa do alelo mutado, análise de muitas amostras em uma única execução (alto rendimento) – que o tornam ideal para o estudo de carcinoma de pulmão. Nossos resultados indicam que NGS pode ser efetivamente aplicada para satisfazer as necessidades de análise de DNA de rotina, e que representa uma alternativa prática para outros métodos actualmente utilizados para detectar
EGFR
mutações.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Desde
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análise mutacional é parte da investigação diagnóstica de rotina de pacientes com NSCLC a necessidade de aprovação da comissão de ética não era necessário para este estudo, de acordo com as diretrizes de ética médica da Azienda Unità Sanitaria Locale di Bologna, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Napoli Federico II, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Padova e de acordo com autorização geral para processar dados pessoais para fins de investigação científica de “The Italian Autoridade de Protecção de dados “(https://www.garanteprivacy.it/web/guest/home/docweb/-/docweb-display/export/2485392). Em conformidade com estas orientações, um consentimento informado por escrito abrangente foi assinado para os procedimentos (aspiração com agulha fina, biópsias e ressecções cirúrgicas) que produziram as amostras de tecido e para a sua investigação diagnóstica. Todas as informações sobre o material humano foi gerido usando códigos numéricos anónimos. Os dados clínicos e acompanhar informações não foram utilizadas para este estudo. Todas as amostras foram tratadas em conformidade com a Declaração de Helsínquia (https://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/).
A seleção dos casos e coleta de material do tumor para análise molecular
Oitenta amostras de NSCLC foram selecionados aleatoriamente de pacientes que foram submetidos à investigação diagnóstica nas seções de Anatomia Patológica do Hospital Bellaria-Universidade de Bolonha e do Hospital Maggiore, em Bolonha, e nos Hospitais da Universidade de Nápoles e Padova. Todos os pacientes tinham indicação clínica para o
EGFR
testes de mutação para o carcinoma de pulmão avançado. As células tumorais para análise molecular foram obtidos a partir de lâminas de citologia em 66 casos e de parafina fixado em formalina seções incorporado (FFPE) de tecido em 14 amostras de biópsia. Ambos os espécimes de citologia e biópsia foram rotineiramente processadas e diagnósticos prestados de acordo com critérios padrão.
Todos os casos foram processados para extração de DNA após revisão patológica assegurou a presença de pelo menos uma centena de células neoplásicas. A proporção de células neoplásicas /número total de células (isto é, o enriquecimento de células de tumor) foi estimada em todos os casos. O número total de células neoplásicas presentes na amostra processada para análise molecular também foi avaliada. Calculou-se do seguinte modo: numa dada amostra de células neoplásicas foram contadas em cinco campos de um milímetro quadrado (1 mm
2) e a média dos cinco valores calculados; a média foi então multiplicado pela área total (em milímetros) do espécime – esfregaço de citologia ou seção histologia da biópsia -. selecionados para análise molecular
Para as células de amostras de citologia foram raspadas a área selecionada para a análise após a remoção da tampa-derrapante por imersão do slide em xileno. Para os materiais de FFPE, seis de 10 mm de espessura foram cortadas a partir de cada bloco seleccionado, seguido por um hematoxilina e eosina (H E) de controlo deslizante. A área do tumor foi marcado no slide e controle de material tumoral foi dissecada manualmente sob a orientação microscópica dos correspondentes 10 mm seções usando uma lâmina estéril. Vinte amostras de DNA adicionais – previamente caracterizadas para o
estado mutacional EGFR
– foram utilizadas para avaliar a reprodutibilidade de 454 sequenciamento paralelo (ver abaixo)
DNA extração
Para Sanger. a sequenciação de ADN foi extraído de acordo com processos convencionais como descrito anteriormente [44-46]. Para garantir um rendimento máximo de DNA para NGS dois protocolos distintos foram acompanhados por citologia e biópsias. O DNA foi extraído a partir de amostras citológicas utilizando MasterPure DNA Purification Kit (Epicentre, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para as amostras obtidas a partir de biópsias de DNA foi extraída com o kit de alta Pure PCR Template Preparation (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante.
Sequenciação
Oitenta amostras foram testadas para
EGFR
(exão 18, 19, 20 e 21), utilizando Sanger e /ou Next Generation sequenciamento. Seqüenciamento Sanger foi realizada nas instalações da patologia molecular das secções de Anatomia Patológica do Hospital Bellaria-Universidade de Bolonha (33 casos), do Hospital da Universidade de Nápoles (29 casos) e de Padova (18 casos). Next Generation sequenciamento de todos os casos foi realizada em paralelo com um 454 GS-Junior Next Generation sequenciador na instalação de Patologia Molecular do Bellaria Hospital-Universidade de Bolonha, seção de Anatomia Patológica, a partir de materiais processados rotineiramente originalmente selecionado na seção de Anatomia Patológica da o Hospital Bellaria e das instituições que apresentem em Padova e Nápoles. Os controlos negativos e controlos não há ADN molde foram incluídos em todas as pistas.
Sanger de sequenciação.
As reacções de PCR foram realizadas utilizando o kit de ADN-polimerase FastStartTaq (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha), a partir de 15-50 ng de DNA. Os iniciadores utilizados para PCR estão descritas na Tabela 1. Os produtos de PCR foram verificados em gel de agarose a 2,5% e purificado utilizando pérolas amplicões Agencourt Ampure XP (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, E.U.A.). A sequenciação foi levada a cabo de acordo com procedimentos padrão utilizando o kit GenomeLab CDT (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA) e um sequenciador de ADN automático CEQ2000 XL (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA) no Hospital Bellaria , utilizando o kit Big Dye Terminator (versão 3.1; Life Technologies). e executado no ABI 3730 analisador (Life Technologies) no Hospital Universitário Nápoles e no Hospital Universitário Padova
EGFR
Exon
seqüenciamento Sanger 5′-3 ‘
NGS 5′-3′
a
Comprimento (pb)
Ex18 FwCATgTCTggCACTgCTTTCCggCTgAggTgACCCTTgTC184Ex18 RvAgggACCTTACCTTATACACCgCCTgTgCCAgggACCTTACEx19 FwAgCATgTggCACCATCTCACAgCATgTggCACCATCTCAC182Ex19 RvATgAgAAAAggTgggCCTgACCCACACAgCAAAgCAgAAAEx20 FwAgCCACACTgACgTgCCTCTAgCCACACTgACgTgCCTCT208Ex20 RvCCTTATCTCCCCTCCCCgTATgCACACACCAgTTgAgCAgEx21 FwTgCAgAgCTTCTTCCCATgACCTCACAgCAgggTCTTCTC196Ex21 RvgCATgTgTTAAACAATACAgCCCACCTCCTTACTTTgCCTCCTTable 1. Os iniciadores utilizados para a amplificação de exões 18-21 EGFR
a 454 Os iniciadores para sequenciação próxima geração estão ligados a uma sequência de 10 nucleótidos (MID – Identificador múltipla)., 4 nucleótidos da “junção” e 25 nucleótidos de ” sequência universal “, de acordo com as instruções do fabricante (não representado na Tabela). Ex, Exon; Fw, Avançado; Rv, Reverse. CSV Baixar CSV
454:. Next Generation Sequencing
a análise da sequência de
EGFR
exão 18, 19, 20 e 21 foi realizada com o sequenciador 454 GS-Junior Next Generation (Roche Diagnostics , Mannheim, Alemanha), de acordo com protocolos estabelecidos (https://www.454.com/).
Resumidamente, estas incluem as seguintes etapas: a amplificação por PCR da sequência-alvo, purificação dos fragmentos amplificados, emulsão de PCR, e a recuperação dos produtos de PCR de emulsão que são depois carregados no PicoTiterPlate titânio (Roche Diagnostics) de o instrumento 454 GS Júnior para pyrosequencing massivamente paralelo. Primers para a execução inicial de amplificação são modificados com sequências de cauda universais e nucleotídeos vários identificadores (MID) (Integrated DNA Technologies Inc, www.idtdna.com). Um par específico de sequências MID identifica univocamente cada amostra (sequência alvo).
Para
EGFR
análise de mutação definimos o seguinte formato de fluxo de trabalho, utilizando os iniciadores apresentados na Tabela 1 para analisar exons 18- 19-20-21. Aproximadamente 10 ng de ADN genómico foram amplificados para cada exão. Todas as reacções de PCR foram realizadas usando um FastStart High Fidelity Taq polimerase (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemanha). Em cada sequenciamento de execução foram analisados 100 a 120 sequências alvo diferentes para pyrosequencing paralelo. Isso nos permitiu estudar 25-30 casos por prazo, uma vez que todos os quatro
EGFR
exons foram avaliados em todos os pacientes, com um número putativo de aproximadamente 700 leituras por alvo, de acordo com as especificações dos fabricantes (http: //. www.454.com/)
Considerando que cada sequência alvo – exão e específico do paciente – é univocamente identificado por um par específico de MIDs, pelo menos, 5 primers para a frente e, pelo menos, 6 iniciadores reversos com MIDs originais foram necessário analisar 30 casos em uma mesma corrida (ou vice-versa, pelo menos, 6 primers para a frente e, pelo menos, 5 queridos reversa). Usamos sistemas de grade por cada
EGFR
exão para identificar a associação única entre casais MID e sequências-alvo específicos (veja a Figura 1). Tanto para a frente e as sequências de cadeia reversa ( “lê”) foram avaliados após a amplificação paralela do ADN alvo. As sequências obtidas foram analisadas usando o Software Amplicon Variant Analyzer (AVA) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). variações de nucleotídeos únicos observados em ambas as vertentes foram considerados para chamada mutacional. chamadas de bases ambíguas associados a trechos de homopolímero de 4 pares de bases ou mais, foram considerados não mutada, devido às limitações da química pyrosequencing que é usado por 454 NGS para análise da sequência [47,48].
Para assegurar que num dado 454 próxima geração sequenciação executar uma sequência-alvo específico está associado com um único par de MID usamos regimes de grade; os pares MID para EGFR exão 18 são ilustrados; algarismos romanos indicam amostras de pacientes individuais. Ex, Exon; Fw, Avançado; Rv, Reverse
A sensibilidade analítica
A sensibilidade analítica do nosso formato de fluxo de trabalho 454 sequenciamento para
EGFR
análise mutacional foi testado por diluição em série (1:.. 1 , 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) de ADN a partir de uma piscina de amostras que albergam um polimorfismo de nucleótidos homozigótica G a na posição 2470 do
EGFR
sequência (c2470 G a , CAG CAA, Q787Q exão 20) em uma piscina de amostras que não abrigam a substituição de nucleotídeos (c2470, CAG). Cada análise foi repetida pelo menos duas vezes.
quantidade mínima de ADN de entrada ao limiar de sensibilidade analítica.
O ADN de entrada ao limiar de sensibilidade analítica foi diluída em série em H
2O para determinar a quantidade mínima de DNA necessária para a detecção de mutações
454:.. Next Generation Sequencing reprodutibilidade
reprodutibilidade inter-ensaio (ou seja, a consistência dos resultados com o mesmo protocolo em corridas diferentes) foi ensaiada por repetindo a análise da sequência de 20 amostras de DNA que foram previamente caracterizados pela sua
EGFR
estado mutacional (11 casos do tipo selvagem e 9,
EGFR mutado
– 7 com uma deleção no exon 19, um com o L858R e um com as mutações T790M).
Resultados
Desempenho do protocolo Sequencing 454 Next Generation
A sensibilidade analítica e definição do limiar da chamada mutacional.
A sensibilidade analítica de 454 NGS depende do número total de lê-se que pode ser obtido para uma determinada amostra. Conforme o protocolo do formato 454 de sequenciação, que tem como alvo um número putativa de aproximadamente 700 leituras por fragmento amplificado, foi testada uma série (1: 1, 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) diluição do DNA com o C 0,2470 G a substituição de nucleotídeos no local polimórfico 2470 do
EGFR
sequência do gene em uma piscina de DNA humano sem a substituição (c.2470 G)
o c.2470 G a substituição foi detectado consistentemente para baixo a uma diluição de 1: 100 apenas se, pelo menos, 10 consensual c.2470 G a de nucleótidos leituras foram obtidas após paralelo 454 sequenciação. Esta observação é ilustrado na Figura 2. Com uma diluição 1: 100 de c.2470 G A de ADN a substituição de nucleótidos foi observada quando o número total de leituras era 2,359, o que corresponde a 23 c.2470 consensual G A sequências (Figura 2D ). Não foi observada quando o número total de leituras era 750, que teria correspondido a 7 consensual c.2470 G A sequências (Figura 2E). O c.2470 G A substituição também não foi observada com uma diluição de 1: 1000, mesmo quando o número total de leituras analisado foi muito elevada (entre 3000 e 4000), mas não o suficiente para alcançar 10 c.2470 G A lê que teria exigido um total de 10.000 leituras por amplicon (Figura 2F)
AF) do c.2470 polimórfico G a substituição foi observado com os seguintes diluições de DNA não realizar o polimorfismo:. 1: 1 ( a), 1: 2 (B), 01:10 (C), 1: 100 (D), mas não a 1: 1000 (F). Na diluição 1: 100 a c.2470 G foi observada uma substituição em que o número total de leituras permitiu detectar, pelo menos, 10 lê com a c.2470 G A mudança (isto significa, pelo menos, 1,000 Total de leituras) (D). O c.2470 G A substituição não foi observado quando o número total de leituras não foi suficiente para detectar pelo menos 10 lê com o c.2470 G . Uma mudança (E)
Com base em estas observações que estabelecidos como critérios para definir uma amostra mutado a identificação da mutação em, pelo menos, 10 lê-se (i)
e
em, pelo menos, 1% do número total de leituras analisados (II). O requisito de 10 consensual lê faz com que os critérios para a chamada mutacional mais rigoroso para as amostras que geram um número total de leituras mais baixo do que o esperado, assegurando assim a especificidade dos resultados.
quantidade mínima de ADN de entrada ao analítica limiar de sensibilidade
o ADN quantidade necessária para detectar c.2470 G a de ADN no limiar de sensibilidade analítica de 1% (1: 100 c.2470 G a diluição de ADN). serialmente foi diminuída a partir de 10 ng , para determinar a entrada de ADN mínima necessária para detectar a substituição de nucleótidos. Uma quantidade mínima de 2 ng de ADN era suficiente para se obter consistentemente ADN amplificável e detectar a c.2470 G A de substituição. Considerando que cada célula diplóide humano contém 7 pg de ADN, 2 ng de uma diluição 1: 100 de c.2470 G A de DNA no DNA c.2470_G correspondem à detecção de cerca de 4 células mutantes em um total de 200 células sem o mutação, assumindo que a mutação é heterozigoto e
EGFR
dysomic.
reprodutibilidade.
para avaliar a reprodutibilidade de 454 sequenciamento paralelo utilizamos 20 amostras de DNA previamente caracterizados pela sua
EGFR
estado mutacional: 11 eram
EGFR
tipo selvagem, 7 tinha uma deleção do exão 19, e cada um tinha uma mutação L858R-exão 21 e uma mutação T790M-exon 20. Cada amostra foi repetido duas vezes com 454 NGS e em todos os casos, o estado mutacional foi confirmada. Nas amostras que abrigavam
EGFR
mutações a porcentagem de mutação lê variada, em média, 2,6% (variação média de 1,45%, intervalo 0. 6% – 8,6%)
diagnóstico patológico e avaliação microscópica de. celularidade tumoral em amostras de pulmão de não pequenas células de carcinoma
Oitenta casos foram estudados. diagnósticos patológicos são resumidos na Tabela 2. Cinquenta e seis dos 80 casos eram lesões pulmonares primários diagnosticados como adenocarcinoma (n = 33) ou NSCLC não especificado de outro modo (NOS) (n = 23). Vinte e duas amostras eram de metástases tumorais: 18 em gânglios linfáticos, 2 na pleura, e 2 no osso. Duas amostras foram preparações de citologia de derrame pleural.
Amostras de biópsia
Diagnóstico
número de células neoplásicas
a
enriquecimento de células tumorais
N = 1414 Adenocarcinoma848-42,504 (média: 11,828) 15-80% (média: 60,0%)
9 primária
5Metastasis (LN 3, osso 2)
Citologia SamplesDiagnosisNumber de células neoplásicas
b
células tumorais enrichmentN = 66190-730,000 (média: 11.200) 5-80% (média: 42,5%) 38 Adenocarcinoma952-228,150 (mediana: 3956) 10-80% (média: 32,5%)
24Primary
12Metastasis (LN 10, Pleura 2)
2 Derrame pleural
28 NSCLC190-730,000 (média: 18.000) 5-80% (média: 50,0%)
23Primary
5 Metástase (LN 5)
total SamplesDiagnosisNumber de células neoplásicas
a
,
b
células tumorais enrichmentN = 80190-730,000 (média: 17.400) 5 -80% (média: 50,0%) 52 Adenocarcinoma848-228,150 (média: 5.000) 10-80% (média: 45,0%)
33 Primária
17Metastasis (LN 13, Pleura 2, osso 2)
2 Derrame pleural
28 NSCLC190-730,000 (média: 18.000) 5-80% (média: 50,0%)
23Primary
5 Metástase (LN 5)
tabela 2. dados clínico-patológicos do amostras analisadas
um número de células neoplásicas foi avaliada em todas as amostras de biópsia. 14;
b
Número de células neoplásicas foi avaliada em 39 de 66 amostras de citologia; estimativa quantitativa da percentagem de células neoplásicas foi realizada em todos os 80 casos. LN, Linfonodo; NSCLC, não pequenas células do pulmão Carcinoma. CSV Transferir CSV
Os resultados da avaliação da celularidade do tumor encontram-se resumidos na Tabela 2 e ilustrados na Figura 3. A proporção de células neoplásicas /número total de células (isto é, o enriquecimento de células de tumor) foi avaliada em todos os casos. As percentagens de células neoplásicas variou de 5 a 80% (média 45,2%, mediana 50,0%). Em 35 amostras, a proporção de células neoplásicas foi inferior a 40%. Em metade dos casos, a proporção de células neoplásicas foi inferior a 50%. O número total de células neoplásicas na amostra submetida a
EGFR
análise mutacional foi estimada em 53 casos. Ele variou entre 190 e 730.000 (média de 68.147, mediana 17.400). Uma estimativa numérica de enriquecimento de células tumorais e do número total de células neoplásicas analisados para
EGFR
mutação estava disponível em todos, mas dois casos com resultados discrepantes entre Sanger e sequenciamento de próxima geração (veja abaixo).
a) espécime de citologia de uma mulher de 72 anos com metastático adenocarcinoma a um nó de linfa no mediastino (maio Grumwald Giemsa, 200X, inserir 600X); a proporção de células neoplásicas na amostra é de 35%; análise de DNA foi tipo selvagem após seqüenciamento Sanger, mas NGS mostrou dois
EGFR
mutações (G721W, R831H) (Caso 57 da Tabela 5). B) biópsia de um homem de 65 anos de idade com metástases adenocarcinoma para óssea (corpo vertebral) (Hematoxilina e Eosina, aumento de 200x, inserir 600X); a proporção de células neoplásicas na amostra é 5%; análise de DNA foi tipo selvagem após seqüenciamento Sanger, mas NGS mostrou a L858R
EGFR
mutação (caso 80 da Tabela 5).
estado mutacional EGFR
seqüenciamento Sanger .
Os resultados do seqüenciamento Sanger estão resumidos nas Tabelas 3, 4 e 5 e ilustrado nas Figuras 4 e 5. As mutações foram identificadas em 14 de 80 casos (17,5%) utilizando sequenciamento Sanger. Um total de 15 mutações foram identificadas: 10 foram exão 19 deleções, 3 foram L858R (exão 21), uma era G719A (exão 18) e uma era uma mutação T790M (exão 20). Em um caso houve uma mutação dupla T790M e L858R. Mutações foram encontradas em 9 de 52 (17,3%) casos diagnosticados como adenocarcinoma e em 5 de 28 amostras (17,8%) citologia que não poderia estar mais subtipadas e foram diagnosticados como NSCLC. Eles foram encontrados em 3 de 14 (21,4%) amostras de biópsia e em 11 de 66 amostras de citologia (16,7%) seqüenciamento Sanger detectadas mutações em uma ampla faixa do número de células neoplásicas. Um exão 19 deleção (del L747-A752) foi identificado na amostra com o menor número de células neoplásicas na nossa série (190 células neoplásicas). No entanto, em todos os casos em que a sequenciação de Sanger detectados
EGFR
mutações a proporção de células neoplásicas na amostra foi de 40% (Tabela 3, as Figuras 4 e 5)
amostras de biópsia
Número de casos mutados
Total de mutações observadas
mutações observadas em amostras com . 40% de células neoplásicas
mutações observadas em amostras com 40% de células neoplásicas
Sanger (%)
NGS (%)
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N=14 3 (21,4)
a
6 (42,9)
b
494
a
8
b
01
Del Ex19
2
2
2
2
2
2
0
0
L858R
1
2
1
2
1
1
0
1
Other muts.
1