Abstract
Objetivos
Para investigar a associação entre a expressão da nestina, uma proteína filamento intermediário classe VI e características patológicas ou a sobrevivência em pacientes com carcinoma urotelial da bexiga (UCB) .
Métodos
expressão Nestin em células tumorais foi imunohistoquímica estudados em 93 pacientes com UCB submetidos a cistectomia radical com linfadenectomia pélvica. Foram avaliadas as associações com parâmetros clínico-patológicas. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e modelos de riscos proporcionais de Cox foram usados para estimar o efeito da expressão nestin na sobrevivência.
Resultados
expressão Nestin em amostras cistectomia foi observada em 13 dos 93 pacientes (14,0% ). expressão Nestin foi associada com o estágio do tumor patológico (p = 0,006). pacientes nestina-negativos tiveram melhor sobrevida global em comparação com os pacientes nestina-positivas (log-rank p = 0,0148). análise univariada indicou que a expressão nestin, invasão linfática e estado dos linfonodos foram significativamente associados com a sobrevida específica por câncer (hazard ratio, 2,78, 2,15 e 2,80, respectivamente). Na análise multivariada, expressão nestin e estado dos linfonodos foram fatores independentes de prognóstico na sobrevida específica por câncer (hazard ratio, 2,45 e 2,65, respectivamente).
Conclusões
Os resultados sugerem que a expressão nestin é um romance indicador prognóstico independente para pacientes com UCB e um marcador potencialmente útil para selecionar pacientes que podem ser candidatos a quimioterapia adjuvante
Citation:. Tabata Ki, Matsumoto K, Minami S, Ishii D, Nishi M, Fujita T , et ai. (2014) Nestin é um preditor independente de sobrevivência de câncer-específica após Radical Cystectomy em Pacientes com urotelial Carcinoma da bexiga. PLoS ONE 9 (5): e91548. doi: 10.1371 /journal.pone.0091548
editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 15 de junho de 2013; Aceito: 12 de fevereiro de 2014; Publicado em: 02 de maio de 2014
Direitos de autor: © 2014 Tabata et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por Grant-in-Aid para terceiro termo abrangente pesquisa de controle para o cancro realizado pelo Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão e todo o estudo Projeto Kitasato (21-1) da Universidade de Kitasato. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinoma urotelial da bexiga (UCB) é a segunda malignidade mais comum e é uma das principais causas de morte em pacientes com neoplasias do trato geniturinário [1]. Embora a maioria dos pacientes apresentam UCB superficial, aproximadamente 50% a 70% desses casos são recorrentes; 10% a 15% destes tumores recorrentes proceder à invasão do músculo e tanto extensão local, que é comumente tratada com cistectomia radical [2]. Para os pacientes com a UCB músculo-invasivo e não-refractário músculo-invasivo, o tratamento padrão é a cistectomia radical. No entanto, apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas e quimioterapia perioperatória, a sobrevida específica da doença de 10 anos global após cistectomia radical manteve-se inalterada nas últimas décadas [3], [4]. Embora as variáveis clínicas e patológicas atuais fornecem importantes informações de prognóstico no câncer de bexiga, eles têm habilidades para prever a recorrência do tumor ou progressão e sobrevida do paciente limitado.
Nestin é uma proteína de filamento intermediário classe VI do citoesqueleto, que se expressa nas células em proliferação durante estágios de desenvolvimento de uma variedade de tecidos embrionários e fetais [5]. Em resposta ao dano, o sistema nervoso central, do músculo esquelético, e o fígado também podem expressar nestina [6], [7]. expressão Nestin em tumores foi originalmente relatado em neoplasias do sistema nervoso, tais como astrocitomas, glioblastomas, e schwannomas [8], [9]. Recentemente, vários estudos têm relatado que a nestina também é expresso em outros carcinomas sólidos [10] – [12]. No câncer de pâncreas, de expressão nestin correlaciona-se com nervos e estromal invasão [10]. Wolfman et ai determinado que nestina é um componente crítico de uma nova via de metástase do cancro da próstata [11]. Mais recentemente, Ryuge et ai demonstraram que a expressão nestina está associada com um prognóstico pior e é um factor de risco independente para a sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão de não-pequenas células [12]. A associação entre a expressão nestin e os resultados clínicos em pacientes com câncer está gradualmente a ser esclarecida.
Neste estudo, enfocamos a relação entre os níveis de expressão nestina e características clínico-patológicas e sobrevida em pacientes com UCB após cistectomia radical.
Materiais e Métodos
população de pacientes
Entre março de 1990 e novembro de 2006, 133 pacientes consecutivos com UCB submetidos a cistectomia radical com linfadenectomia pélvica e ilíaca no Hospital Universitário de Kitasato foram incluídos no este estudo. Dezenove pacientes que receberam terapia neoadjuvante no pré-operatório, incluindo tanto a radiação ou quimioterapia, 14 pacientes que foram perdidos para follow-up, e 7 pacientes com outro tipo de histologia, incluindo adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequenas e sarcoma, foram excluídos de análises posteriores. Nenhum paciente tinha metástases à distância no momento da cistectomia. Dos 93 pacientes restantes, 71 (76,3%) homens e 22 (23,7%) mulheres tinham uma idade média de 64 anos (variação, 40-81, com média de 62,5).
As indicações para cistectomia em pacientes com inicial Ta, T1 ou Tis UCB incluídos falha terapêutica intravesical (
n
= 14), características agressivas histopatológicos (tumores de alto grau, carcinoma in situ [CEI], doença extensa multifocal;
n
= 5), ou a progressão para cancro invasivo do músculo-(
N
= 13). Sessenta e um pacientes foram submetidos a cistectomia para uma apresentação inicial da doença muscular invasiva.
O tumor 2002 /node /metástases classificação foi utilizado para o estadiamento patológico, e a classificação da Organização Mundial da Saúde foi utilizado para a classificação patológica. invasão linfovascular determinada a presença de células cancerosas no interior do espaço endotelial. As células cancerosas que simplesmente invadiram uma luz vascular foram considerados negativos. blocos fixados em formalina, embebidos em parafina que representam as áreas mais invasivos de cada tumor foram recolhidas para posterior investigação. O acompanhamento médio foi de 38,4 meses (variação, 1,1-253,7; médias, 64,6) para os pacientes que estavam vivos no último follow-up. Quando os pacientes morreram, a causa da morte foi determinada pelo tratamento médicos, revisão de prontuários corroborada por declarações de óbito, ou certidões de óbito sozinho. espécimes de autópsia de urotélio da bexiga de 38 pacientes sem quaisquer achados patológicos sugestivos de malignidade serviram como controle
declarações éticas
O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Kitasato (Número Aprovado.; C-09-504). Temos obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes do estudo.
A imuno-histoquímica e marcando
As secções (3 mm de espessura) foram desparafinados em xileno, reidratadas em uma série de etanol descendente, e depois tratada com 3% peróxido de hidrogénio durante 10 min. Depois de bloquear com caseina 0,5% durante 10 min, foram feitos reagir com as secções de 100 vezes diluído de anticorpo policlonal anti-nestina (IBL, Takasaki, Japão) durante 2 h à temperatura ambiente. A especificidade deste anticorpo foi descrito anteriormente [12]. Após lavagem em solução salina tamponada com Tris (TBS; Tris HCl 0,01 pH 7,5, 150 mM de NaCl), foram feitos reagir as secções 3 vezes durante 5 min cada com Histofine simples mancha MAX-PO (MULTI; Nichirei, Tóquio, Japão) durante 30 min à temperatura ambiente. As secções foram visualizados subsequentemente com solução DAB estável (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e contra-coradas com Hematoxilina de Mayer. Lote controles negativos utilizado TBS. Todas as lâminas foram revisadas por dois investigadores (K. M. e Y. S.) que foram cegados quanto aos dados clínicos e patológicos. imunocoloração citoplasmática nas células tumorais indicou positividade para nestina. O corabilidade de células endoteliais vasculares peritumorais foi usada como um controlo positivo interno. Nestina foi marcado por adição da percentagem de células de tumor positivas e a intensidade da coloração. A percentagem de células tumorais foi pontuada como 0 (0%), 1+ (1-25%), 2 + (26-50%), 3+ (51-75%), e 4+ (75-100%) . intensidade da coloração foi também classificada como 1+ (fraca) = mais fraca do que as células endoteliais; 2+ (moderada) = o mesmo que as células endoteliais; 3+ (forte) = mais forte do que as células endoteliais. A média dos valores percentuais obtidos por medições em triplicado foram consideradas para análise. Em um estudo preliminar, avaliamos o valor discriminativo de cada corte no índice de soma, que varia de 0 a 7, no que diz respeito às características UCB e prognóstico. Kaplan-Meier de incrementos de Série do índice de soma, como um ponto de corte para positiva e negativa revelou que o ponto de corte de 0 para positivo e negativo era a melhor discriminador para a progressão e sobrevivência UCB (dados não mostrados). Do mesmo modo, a avaliação da associação deste corte para nestina com características clínicas e patológicas 0 mostrou que era o único ponto de corte, para se obter resultados estatisticamente significativos (dados não mostrados). pontuações de expressão de nestina foram estratificados mais para positivo (pontuação ≥1) e negativo (escore 0) para a apresentação.
acompanhamento pós-operatório
Cada paciente foi programado para ter um acompanhamento pós-operatório a cada 4 meses para o primeiro ano, semestralmente, no segundo ano, e depois anualmente; exames mais frequentes foram agendadas se clinicamente indicado. Vinte e um pacientes (22,6%) receberam quimioterapia adjuvante (metotrexato, vinblastina, adriamicina e cisplatina [MVAC] ou gemcitabina e cisplatina [GC]) após a cirurgia para as características patológicas adversas, incluindo metástases em linfonodos regionais ou distantes ou envolvimento extravesical. Quarenta e três pacientes (46,2%) receberam MVAC ou GC de recorrência da doença.
Análise estatística
Para esta análise, tumor estágio patológico (≤pT2 vs. ≥pT3), grau (graus 1 e 2 vs. grau 3), e estado dos linfonodos (N0 vs. N1 e N2) foram avaliados como variáveis dicotomizadas. O teste exato de Fisher foi usado para avaliar a associação entre sexo, estágio patológico, grau patológico, CIS, estado linfonodal e invasão linfática. A diferença de idade entre os grupos de expressão e de perda de nestina foi testada pelo Mann-Whitney
U
teste. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para calcular funções de sobrevivência, e as diferenças foram avaliadas com o teste log-rank. sobrevivência Multivariable análises foram realizadas com o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox, o controle de expressão nestin, estágio patológico e grau, CIS concomitante e metástases linfáticas. A significância estatística neste estudo foi de p 0,05. Todos os valores p relatados são de dois lados. Todas as análises foram realizadas com o Stata versão 11 para Windows (Stata, Chicago, IL, EUA).
Resultados
Associação de expressão nestin com características clínico-patológicas
A tabela 1 resume o características clínicas e patológicas de 93 pacientes que foram submetidos a cistectomia radical para UCB. Staging indicou que um paciente teve PTIS, 2 tiveram pta, 16 tiveram PT1, 21 tinham pT2, 17 tinham pT3a, 19 tiveram pT3b, e 17 tinham doença pT4. As correlações entre a expressão nestin e características clínico-patológicas também estão listadas na Tabela 1. citoplasmática expressão nestin em células de tumor foi observada em 13 de 93 pacientes (14,0%). A taxa positiva de nestina foi significativamente mais elevada em pacientes com doença do que em ≥pT3 ≤pT2 (p = 0,006). A Figura 1A demonstra fotografia representativa que nestina expressão não foi observada em células tumorais. Nestina tinha expressão citoplasmática em células de tumor (Figura 1B). nestina expressão também foi observada no citoplasma das células endoteliais vasculares e fibroblastos no estroma do tumor em cada caso (Figura 1A, B).
As fotografias são representativas células tumorais que foram negativos (A) e positivo (B) para nestina. nestina expressão também foi observada no citoplasma das células endoteliais vasculares e fibroblastos no estroma do tumor em cada caso (Figura 1A, B).
Relação entre a expressão da nestina e sobrevivência no SCU
Dentro de um período de acompanhamento médio de 38,4 meses, 45 pacientes (48,4%) tiveram recorrência da doença, 41 (44,1%) morreram de UCB, e 7 (7,5%) morreram de outras causas. A associação de expressão nestin com a taxa de sobrevida livre de progressão e específico do cancro sobrevivência e sobrevida global foram analisados utilizando análise de Kaplan-Meier (Figura 2A-C). A taxa de sobrevivência livre de progressão no grupo nestina-positivas foi significativamente mais pobre do que no grupo de nestina-negativo (p = 0,0195, Figura 2A). as taxas de sobrevivência significativamente mais pobres do específico do cancro e sobrevivência global foram observadas no grupo de nestina-positivas em comparação com o grupo de nestina-negativo (p = 0,0051 e 0,0148, respectivamente; Figura 2B e C, respectivamente).
( A) a sobrevivência livre de progressão; (B) específicas de sobrevivência de câncer; e (C) a sobrevida global.
implicações prognóstico da expressão nestin em UCB
Para investigar se a expressão nestin foi um fator prognóstico independente para sobrevida dos pacientes com UCB, univariável e multivariável Cox foram realizadas análises de regressão. Na análise univariável regressão de Cox, expressão nestin, fase pT, invasão linfática e estado dos linfonodos foram significativamente associados com a recorrência da doença, e expressão nestin, invasão linfática e estado dos linfonodos foram significativamente associados com a sobrevida específica por câncer (Tabela 2). Após receber quimioterapia cistectomia não afectou positivamente a sobrevivência específico do cancro e sobrevivência livre de progressão (dados não mostrados). Usando a análise de regressão de Cox multivariada, expressão nestin foi encontrado para ser fator prognóstico independente para sobrevida específica para o câncer, mas marginal para a recorrência da doença (hazard ratio [HR] = 2,45 e p = 0,04; HR = 2,27; p = 0,06, respectivamente; Mesa 2). Nesta análise multivariada, invasão linfovascular foi excluída como num relatório anterior [12], porque na determinação do efeito de nestina a recorrência ou sobrevivência, invasão linfovascular pode ser um factor intermediário na via da relação nestina-recorrência /sobrevivência.
Discussão
O prognóstico da maioria dos pacientes com a UCB avançada é pobre cistectomia radical, mesmo depois de adequadamente realizado e linfadenectomia pélvica [13]. Com a cirurgia por si só, 40% a 90% dos pacientes com doença ≥pT3 terá metástase distante ou recorrência local ou ambos, e será finalmente morrem da doença [4], [13]. Portanto, o tratamento adicional perioperatório incluindo quimioterapia sistêmica devem ser considerados para pacientes com alto risco de recorrência da doença se elegíveis com base na condição do indivíduo. No entanto, para refinar tomada de decisão clínica na escolha do tratamento perioperatório adicional para UCB avançada, os médicos precisam de marcadores moleculares associados com o comportamento biológico e clínico destes tumores. Por exemplo, os doentes com uma baixa probabilidade de progressão da doença podem ser guardados os efeitos colaterais de quimioterapia sistémica desnecessária, enquanto aqueles com risco elevado de progressão da doença pode ser encorajados a receber quimioterapia sistémica. Assim, marcadores moleculares, além de características clínico-patológicas poderia ser de ajuda para individualizado com relação à quimioterapia adjuvante de decisão.
O presente estudo esclareceu que a expressão nestin em células tumorais foi associada a sobrevida livre de progressão, específica ao câncer a sobrevivência e sobrevivência global dos doentes com UCB (Figura 2A-C). Além disso, na análise de regressão de Cox multivariável, expressão nestina foi um factor independente de prognóstico para a sobrevivência específico do cancro (HR, 2,45; p = 0,04; Quadro 2). Embora estado dos linfonodos também foi um fator prognóstico independente para sobrevida específica por câncer (HR, 3,59; p 0,001) e recorrência da doença e (HR, 2,65; p = 0,006) em nosso estudo, envolvimento ganglionar como um fator de risco independente após cistectomia de recorrência e sobrevida após cystectomy já estava estabelecido em vários estudos [14], [15]. nestina expressão em células do estroma foi observada em todos os casos. Especulamos que as células estromais por si só não afecta a sobrevivência ou recorrência sem células tumorais positivas para nestina, porque o compartimento celular de estroma desempenha um papel crucial na tumorigénese e invasão por estimular a transformação de células normais para a produção de factores de crescimento, citocinas e quimiocinas que podem células tumorais activos. Entretanto, invasão linfovascular foi excluído da análise multivariada de Cox neste estudo. O papel da invasão linfovascular como fator prognóstico para a progressão da doença e sobrevida é controversa. Os primeiros estudos identificados invasão linfática como um pobre características prognósticos [16], [17]. Em outros estudos, no entanto, a invasão linfática não foi um preditor de recaída ou a sobrevivência [14], [18], [19]. relatórios anteriores do pâncreas, próstata e câncer de pulmão revelou que a expressão nestin foi importante para recursos de migração e invasão de células tumorais, que posteriormente resultaram em mau prognóstico [10] – [12]. Portanto, invasão linfovascular também foi considerado como um factor intermediário na via da relação nestina-sobrevivência /recorrência no SCU. estudo anterior também excluiu invasão vascular, invasão linfática, invasão pleural a partir da análise multivariada e, assim, ajustando para eles pode subestimar o efeito de nestin. Além disso, os pacientes sem comprometimento de linfonodos e sem expressão nestin mostrou prolongada sobrevida livre de progressão e específicos do cancro de sobrevivência (dados não mostrados). Portanto, a expressão nestin possivelmente ajuda a tomada de decisão clínica na escolha do tratamento adicional, mesmo em pacientes sem envolvimento de gânglios linfáticos na cystectomy.
Por outro lado, os tumores epiteliais são populações heterogéneas de células com habilidades altamente variáveis para sobreviver , crescem, e metástase [20], [21]. Os relatórios anteriores sugeriram que esta heterogeneidade intratumoral surge das diferenças genéticas e epigenéticas de células tumorais através de pressão seletiva durante a evolução do tumor. Recentemente evidência emergente suporta a existência de uma hierarquia celular dentro de tumores epiteliais. Na parte superior desta hierarquia é uma célula estaminal do cancro (CSC) que pode população auto-renovação e diferenciação de células de progenia, resultando, assim, na heterogeneidade celular e funcional observada de tumores epiteliais [22], [23]. CSCs foram isolados a partir de leucemias e vários tumores sólidos [24], [25]. Estas células podem ser expandidas in vitro como esferas de tumor e são capazes de reproduzir o tumor original quando transplantadas em murganhos imunodeficientes. A existência de CSCs recentemente também tem sido relatado na UCB humana [26]. Recentemente, foi relatado como nestina um dos marcadores putativos de CSCs em uma variedade de tumores incluindo UCB [27], [28]. Relatórios anteriores sugeriram que a falha de terapias do cancro pode ser devido ao seu menor efeito sobre os CSCs que conservam a sua plena capacidade de sofrer e restaurar a massa de células de tumor. Mais recentemente, a partir deste conceito, as terapias de CSC-alvejados foram investigados em vários tumores [29], [30]. No entanto, a falta de marcadores de confiança para a identificação das CSCs impede o desenvolvimento deste tratamento. A este respeito, nestin não é apenas um fator de prognóstico, mas também pode ampliar a possibilidade de o tratamento CSC-alvo na UCB.
Este estudo tem limitações inerentes a qualquer coleta de dados retrospectiva. O tamanho da amostra e variações de follow-up pode ter limitado nossa capacidade de detectar pequenas diferenças. No entanto, este estudo demonstrou que a expressão nestin positiva está associada com mau prognóstico e é um fator prognóstico independente para sobrevida específica para o câncer em pacientes com UCB após cistectomia radical. No futuro, precisamos de uma validação deste novo marcador de prognóstico usando maior coorte com a longo prazo, estudo prospectivo.
Conclusões
Em conclusão, demonstramos que nestin é expressa em um subconjunto da UCB e sua expressão está associada a fatores clínico-patológicas. Descobrimos que a expressão nestin é um romance indicador prognóstico de pior sobrevida para pacientes com UCB após cistectomia; no entanto, seu significado prognóstico ainda requer confirmação com populações maiores de pacientes.