Abstract

cassete de ligação a ATP (ABC) transportadores estão associados com má resposta à quimioterapia, e conferem um prognóstico pobre em várias doenças malignas. No entanto, a associação entre a expressão do membro do ABC sub-família G 4 (ABCG4) e prognóstico em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas-(NSCLC) permanece obscuro. amostras de tecido NSCLC (n = 140) e amostras de tecido pulmonar normal (n = 90) foram ressecados de pacientes com estágio II a IV NSCLC entre maio de 2004 e maio de 2009. ABCG4 mRNA e expressão de proteínas foram detectadas por RT-PCR, western blot, e imuno-histoquímica. Os pacientes receberam quatro ciclos de quimioterapia pós-operatória baseada em cisplatina e foram acompanhados até 31 de Maio

st, 2014. taxa de ABCG4 positividade maior no NSCLC do que em tecidos pulmonares normais (48,6%

vs

. 0 %,

P Art 0,001) e expressão ABCG4 foi significativamente associada com pobre diferenciação, estágio superior do nó tumor metástase (TNM) e adenocarcinoma tipo histológico (todo o

P Art 0,001). Univariada (HR = 2,284, IC 95%: 1,570-3,324,

P Art 0,001) e multivariada (HR = 2,236, IC 95%: 1,505-3,321,

P Art 0,001 ) As análises mostraram que a expressão ABCG4 era um fator independente associado a um mau prognóstico em NSCLC. Pacientes com ABCG4 positivo NSCLC tiveram sobrevida média mais curta do que ABCG4 negativo NSCLC (20,1

vs

43,2 meses,

P

. 0,001). O significado prognóstico da expressão ABCG4 era evidente nos estágios III e IV NSCLC. Em conclusão, a alta expressão de ABCG4 foi associada a um mau prognóstico em pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia à base de cisplatina

Citation:. Yang G, Wang XJ, Huang LJ, Zhou Ya, Tian F, Zhao JB, et ai. (2015) Expressão alta ABCG4 está associado com mau prognóstico em não-pequenas células do câncer pulmonar pacientes tratados com quimioterapia cisplatina-base. PLoS ONE 10 (8): e0135576. doi: 10.1371 /journal.pone.0135576

editor: Gergely Szakacs, da Academia de Ciências da Hungria, HUNGRIA

Recebido: 29 de outubro de 2014; Aceito: 23 de julho de 2015; Publicação: 13 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (concessão No. 81.172.224). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cerca de 1,5 milhões de novos casos de cancro do pulmão são diagnosticados anualmente em todo o mundo, e cerca de 85% deles são cancros do pulmão de não-pequenas células (NSCLCs) [1]. Em 2012, cerca de 58% dos casos de CPNPC ocorreu nos países menos desenvolvidos [2]. A cirurgia é considerada a melhor opção de tratamento, mas a ressecção só é potencialmente curativa para 20-25% dos tumores [1]. A maioria dos pacientes vai apresentar-se com uma doença incurável e enfrentar uma taxa de sobrevivência relativa de 5 anos de 17% com terapias padrão atuais [3]. quimioterapia pós-operatória, com ou sem radioterapia, melhora a sobrevida de 4% em termos de sobrevivência absoluta de 5 anos, como demonstrado por uma meta-análise [4].

Actualmente, os regimes de combinação de quimioterapia à base de cisplatina são os mais eficazes terapias de primeira linha para o tratamento do NSCLC, de acordo com as diretrizes da National Comprehensive Cancer Network (NCCN) (versão 4,2014) [5]. No entanto, a eficácia da quimioterapia é limitado, com taxas de resposta (RR) de 20-35%, a sobrevivência livre de progressão (PFS) de 3.1-5.5 meses, ea sobrevida global (OS) 7.4-11.3 meses [6,7]. Por conseguinte, melhorar os resultados após a quimioterapia tem sido uma das questões mais desafiadoras no sucesso do tratamento de câncer de pulmão [8]. Isso é atribuído principalmente à resistência às drogas, que ocorre em praticamente todos os cancros e é um sério impedimento para o sucesso da quimioterapia [6,7]. é cada vez mais reconhecido que as resistências de drogas primárias e secundárias em desenvolvimento nas células cancerosas são a causa da falha mais fundamental quimioterapia subjacente [6,7].

A resistência às drogas é geralmente o resultado da expressão excessiva de cassete de ligação de ATP (ABC) transportadores [9,10]. proteínas transportadoras de ABC são candidatos ideais como biomarcadores para a predição da resistência à quimioterapia e prognóstico após a quimioterapia [11,12]. transportadores ABC são proteínas transmembranares que facilitam a translocação de substâncias através das membranas celulares heterogéneas, utilizando a energia da hidrólise de ATP [13]. Até à data, pelo menos, 48 ​​genes transportadores ABC humanos foram identificados, e eles foram divididos em sete subfamílias (ABCA através ABCG) [14]. Entre estes, ABCA2, ABCB1 (também conhecida como P-glicoproteína ou multirresistência 1 (MDR1)), ABCB4, abcb11, ABCC1-6, ABCC10, ABCC11, e ABCG2 (também conhecido como BCRP ou MXR) têm sido mostrados para ser associados com o transporte de efluxo e de drogas citotóxicas (estruturalmente diversos agentes quimioterapêuticos e seus metabolitos) das células de cancro do pulmão, reduzindo assim a concentração de droga intracelular [15]. ABCA1 também foi identificado como mediando a resistência aos medicamentos no cancro do pulmão e linhas celulares de cancro do pulmão resistentes a drogas [16]. Actualmente, a P-gp (ABCB1), MRP1 (ABCC1), e ABCG2 são considerados como sendo os principais transportadores de fármacos para o seu papel na resistência a múltiplas drogas observados em muitos tumores e linhas de células [17]. Embora a descoberta e uso de inibidores de transportadores ABC têm sido estudados ao longo dos últimos anos, estes inibidores não foram completamente bem sucedidos em superar a resistência de droga [18]. Como resultado, a identificação de novas proteínas transportadoras de ABC droga e a investigação dos seus mecanismos e inibidores são altamente garantido e extremamente importante para avaliar novos alvos para superar a resistência à droga.

Vários estudos têm demonstrado que os membros da ABCG ( ou branco) da subfamília estão associados com o transporte lipídico celular e resistência aos medicamentos [19-21]. ABCG5 e ABCG8 são altamente expresso em células epiteliais do intestino e actuam provavelmente como um heterodímero; eles têm sido associados com o efluxo de esteróis vegetais e colesterol na bílis [22,23]. A sobre-expressão de ABCG2 conduz a resistência de várias linhas de células de cancro a drogas anti-tumor [24]. ABCG4 é o quarto membro da família do “L”, e está localizado em 11q23.3 cromossoma. Este gene codifica um transcrito de 3874 pb, e a sua expressão é predominantemente intracelulares [25], mas a localização intracelular exacto ainda está para ser demonstrado [26]. Com efeito, os diferentes transportadores ABC pode ser localizada na membrana celular, em mitocôndrias, no aparelho de Golgi, no retículo endoplasmático, ou na membrana nuclear, em que eles participam em diversos processos celulares [26]. Além disso, de acordo com estudos anteriores [27-30], expressão ABCG4 em NSCLC permanece obscuro. Estudos anteriores revelaram que ABCG1 ABCG4 e são responsáveis ​​pelo transporte de colesterol em lipoproteína de alta densidade (HDL) partículas [31,32], e a sobre-expressão de ABCG4 também confere resistência a alquil-fosfolipídicas análogos (miltefosina, edelfosina, e perifosina ) em

Leishmania

[33]. No entanto, se ABCG4 desempenha um papel significativo no prognóstico após a quimioterapia, e se ele tem a função potencial de mediar a resistência aos fármacos no cancro do pulmão também permanecem obscuros. Portanto, o presente estudo centrou-se na compreensão da expressão e valor prognóstico pós-quimioterapia de ABCG4 em NSCLC.

Neste estudo retrospectivo, foi investigada a expressão de ABCG4 em NSCLC. Também avaliamos o valor de proteína ABCG4 para prever a sobrevivência em pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia combinada à base de cisplatina.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras

Um total de 140 amostras de tecido NSCLC (74 casos de carcinoma de células escamosas de pulmão e 66 casos de adenocarcinoma de pulmão) e 90 amostras de tecido pulmonar normal (localizado 5 cm dos tumores primários) obtidas por ressecção cirúrgica no Departamento de Cirurgia Torácica, Tang Du Hospital Filiado à Quarta Universidade médica Militar (Xi’an, China) entre maio de 2004 e maio de 2009, foram investigados no presente estudo. Tumores e tecidos pulmonares normais foram colhidas utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis

Os pacientes tinham idades entre 45-76 anos (média ± SD: 60,76 ± 6,88 anos).. Todas as amostras foram analisadas por patologistas e classificação histológica dos tumores foi realizada de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde. Os tumores foram classificados como fase II (n = 42), III (n = 56), ou IV (n = 42) de acordo com as orientações NCCN (Versão 4,2014) [5]. características clinicopatológicas de todos os pacientes foram registrados. Nenhum paciente tinha recebido quimioterapia, radioterapia, bioterapia, ou qualquer outra operação antes da cirurgia de câncer de pulmão. Todos os pacientes foram tratados com regimes de quimioterapia combinada à base de cisplatina considerados como regimes pós-operatório padrão para NSCLC [5]. Todos os pacientes receberam quatro ciclos de regimes de combinação quimioterapêuticos à base de cisplatina (a cisplatina 75 mg /m

2 dias 1 + gemcitabina de 1250 mg /m

2 dias 1, 8, todos os 21 dias /pemetrexed de 500 mg /m

2 dias 1 a cada 21 dias /docetaxel 75 mg /m

2 dias 1 a cada 21 dias). O acompanhamento foi censurado em 31 de Maio

st, 2014, com um período total de acompanhamento de 60 meses. O dia em que começou a quimioterapia foi considerado como o ponto de partida para a estimativa de sobrevivência pós-operatória

Todas as amostras foram divididas em duas partes:. A primeira parte foi colocada num dietilpirocarbonato a 0,1% (DEPC) tratado tubo congelação em água e armazenado a -80 ° C; a segunda parte foi fixada em formalina a 10% tamponada neutra e depois desidratado para inclusão em parafina.

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Regional de Investigação Clínica da Quarta Universidade Médica Militar. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito para o uso de seus registros médicos e amostras de tecido para fins de pesquisa.

reversa reação em cadeia da polimerase via transcriptase (RT-PCR)

amostras de tecidos congelados (100 mg) foram colhidas e moído num pó fino. As células A549 foram estavelmente transfectadas com o vector pcDNA3.1 contendo ABCG4 (Takara Bio, Otsu, Japão) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram semeadas em placas de 6 poços, e os plasmídeos de ADN e o reagente de transfecção foram adicionados 24 h mais tarde. As células A549 transfectadas foram cultivadas na presença de G418 (400 mg /ml; Life Technologies Co., Grand Island, NY, EUA). As células resistentes a G418 (A549-ABCG4) foram colhidos para análise de RT-PCR.

extracção de ARN foi realizada utilizando o kit de ARN total I (Omega, Norcross, GA, EUA). A concentração e a pureza das amostras de ARN foram determinados usando a absorvância a 260 e 280 nm (A260 /280) por espectrofotometria (Beckman DU800, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EUA).

a síntese de cDNA foi realizada usando um kit de transcrição reversa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) utilizando a Iniciador Aleatório Hexâmero, e RevertAid M-MuLV da transcriptase. A amplificação por PCR foi realizada utilizando Taq 2 × Mastermix (CWBio, Pequim, China). A desnaturação inicial foi realizado a 95 ° C durante 5 min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 35 s, emparelhamento a 51 ° C durante 35 s e extensão a 72 ° C durante 35 s, com uma extensão final a 72 ° C durante 5 min (Tabela 1). Os produtos de PCR foram analisados ​​em géis de agarose a 2% utilizando um gerador de imagens em gel (Alpha Innotech, Santa Clara, CA, EUA).

análise de Western blot

amostras de tecido congeladas (100 mg) foram cortadas em pedaços pequenos e homogeneizou-se num ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) buffer [1 × PBS, 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 10 ug /mL de leupeptina, 100 ug /ml de fluoreto de p-aminophenylmethylsulfonyl (p-APMSF), e 10 ug /ml de aprotinina] em gelo durante 1 h, e centrifugou-se a 14000 ×

g

durante 30 min. As células A549-ABCG4 foram lisadas com o tampão RIPA em gelo durante 1 hora e centrifugou-se a 14000 × g durante 30 min. O sobrenadante foi então recolhido e a concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA). os lisados ​​de proteína (50 ug) foram separados por electroforese em gel de 12% SDS-poliacrilamida (PAGE) e transferidos para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) em membranas de 2,5 mA /cm

3 durante 30 min. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado durante 1 hora à temperatura ambiente e incubadas com os anticorpos primários (anticorpo policlonal de coelho anti-ABCG4, 1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, EUA; anticorpo monoclonal de coelho e anti-β-actina , 1: 1000, Bio CW, Pequim, China), a 4 ° C, durante a noite. As membranas foram então lavadas com tampão de TBST (Tris-HCl a 10, pH 8,0, NaCl 150 mM e 0,1% de Tween-20), e subsequentemente incubadas com o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho, 1: 5000, CW Bio, Pequim , China), a 37 ° C durante 1 h, seguido por desenvolvimento de cor utilizando o kit cromogénico Milipore por western blots (Billerica, MA, EUA) e observação sob um analisador de quimioluminescência (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

imunohistoquímica

tecidos embebidos em parafina foram cortados em secções de 3-5-M para dewaxing e reidratação. A imuno-histoquímica foi realizada após a recuperação de antigénios baseado em aquecimento por microondas em tampão citrato 0,1 M (pH = 6,0) seguido de incubação com 3% H

2O

2, à temperatura ambiente durante 30 min, soro de cabra a 10% à temperatura ambiente durante 30 min, o anticorpo primário (o anticorpo policlonal de coelho anti-ABCG4, 01:40, Proteintech, Chicago, IL, EUA) durante a noite a 4 ° C, o anticorpo secundário marcado com biotina (Bio CW, Pequim, China) à temperatura ambiente durante 30 min , e recentemente preparada de 3,3′-diaminobenzidina (DAB) para o desenvolvimento da cor, durante 5 min. As secções foram então completamente enxaguados com água, re-corados com hematoxilina, desidratadas, limpas em xileno e montadas com uma lamela. A especificidade do anticorpo anti-ABCG4 foi testado usando peptídeos-blocking ABCG4 (1: 200; SC-34874; Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). Os péptidos de bloqueio foram adicionados para as lâminas e incubaram-se durante a noite a 4 ° C. Em seguida, adicionou-se o anticorpo primário e reveladas como descrito acima.

As amostras foram classificadas como “positiva” quando a membrana celular e /ou citoplasma foram coradas castanho. Cinco campos de alta potência (400 ×) foram selecionados de forma aleatória, e cada lâmina foi avaliada de forma independente por dois patologistas experientes cegos aos dados clínicos. -Salino tamponado com fosfato (PBS), em vez do anticorpo primário, foi usada como um controlo blank.

As amostras foram pontuados de acordo com a intensidade de coloração e a percentagem de células positivas. Os resultados foram pontuados com base nos seguintes critérios: a) a percentagem de células positivas (≤5%: 0; 6-25%: 1; 26-50%: 2; 51-75%: 3; e 75% : 4); b) a intensidade da coloração (sem cor: 0; amarelo: 1; marrom: 2; e tan: 3); e c) os dois graus foram multiplicados juntos e espécimes foram atribuídas a um dos 4 níveis: 0: negativo (-); 1-4: fracamente positivo (+); 5-8: moderadamente positiva (++); 9-12: fortemente positiva (+++) [34]. Para a análise multivariada e comparação com as curvas de sobrevivência, -foi definido como negativo e +, ++ e +++ foram todos definidos como positivo.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 18.0 (IBM, Armonk, NY, EUA). As associações entre expressão imuno-histoquímica e variáveis ​​clínicas foram avaliadas pelo teste de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis H, conforme apropriado. A sobrevida global foi medido a partir do início da quimioterapia à data de morte por qualquer causa ou da data em que o paciente estava última considerada por estar vivo. As curvas de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para análises univariada e multivariada. As correlações foram avaliadas através da análise de correlação de Spearman. Os coeficientes de correlação de classificação foram expressos como

r

s. 0.0≤

r

s Art 0,1 foi considerado como não correlacionadas; 0.1≤

r

s Art 0,3 foi considerado como fracamente correlacionadas; 0.3≤

r

s

≤0.5 foi considerado como moderadamente correlacionados;

r

s Art 0,5 foi considerado como um fortemente correlacionados. Frente e verso

P

-Valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

expressões de mRNA e proteína ABCG4 em NSCLC e tecidos pulmonares normais

Para investigar a expressão de ARNm ABCG4 em NSCLC e amostras de tecido pulmonar normal, RT-PCR foi realizada em ARNm isolado a partir dos tecidos de NSCLC (N = 14) e nos tecidos normais do pulmão (n = 2). A detecção de um produto de PCR de 383 pb correspondendo ao ARNm ABCG4 foi observada em tecidos NSCLC (Fig 1B), enquanto que nenhuma banda foi observada nos tecidos pulmonares normais (Fig 1A). A amplificação de β-actina (416 pb) foi claramente observado em ambos os tipos de tecidos (Fig 1).

β-actina foi utilizado como referência interna. M: marcador. (A) Pista 1: controlo positivo (A549-ABCG4). Lanes 2-3: tecidos pulmonares normais (norma) (n = 2); tecidos (B) NSCLC (NSCLC) (n = 14, pistas 1-14).

Para investigar a expressão de proteínas em NSCLC ABCG4 e tecidos pulmonares normais, a análise Western Blot foi realizada no conjunto de amostras utilizado para RT-PCR. a expressão da proteína ABCG4 (60 kDa) foi observada em tecidos NSCLC (Fig 2B e Fig S1), mas não nos tecidos pulmonares normais (Fig 2A). β-actina (43 kDa) foi utilizada como um controlo de normalização e foi observado em ambos os tipos de tecidos (Fig 2 e Fig S1).

blots foram cheios mostrado na Fig S1 β-actina (43 kDa) estava utilizado como referência interna. (A) Pista 1: controlo positivo (A549-ABCG4). Lanes 2-3: tecidos pulmonares normais (norma) (n = 2); (B) tecidos NSCLC (NSCLC) (n = 14, pistas 1-14).

Estes resultados indicaram que ABCG4 mRNA e expressão de proteínas eram obviamente diferentes entre NSCLC e tecidos pulmonares normais.

a expressão da proteína ABCG4 em NSCLC e tecidos pulmonares normais por imuno-histoquímica

Para investigar ainda mais a expressão da proteína ABCG4 em NSCLC, imuno-histoquímica foi realizada em NSCLC (N = 140) e as amostras normais tecidos do pulmão (n = 90) (Figura 3). Nenhuma expressão ABCG4 foi observado nas amostras de tecidos normais (Figura 3A). Algumas das amostras de NSCLC também não mostraram expressão de (-) (Fig 3B), enquanto que outras amostras foram fracamente positivas (+) (Figura 3C), moderadamente positiva (++) (Figura 3D), ou fortemente positivas para ABCG4 (++ +) (Figura 3E). coloração ABCG4-negativo se observou para as amostras de tecido NSCLC (++) utilizando o péptido ABCG4 bloqueio (Fig 3F). Com base em imuno-histoquímica, ABCG4 expressão foi detectada em 48,6% dos casos de NSCLC (68/140, 40 +, 23 ++, +++ e 5), e não foi detectada em qualquer das 90 amostras de tecidos normais de pulmão (

P

. 0,001) (Tabela 2)

(A) tecido pulmonar normal; (B) negativo (-) de coloração de tecido ABCG4 em NSCLC; (C) A coloração por fracamente positivo (+) de ABCG4 no tecido NSCLC; (D) (++) coloração moderadamente positiva de ABCG4 no tecido NSCLC; (E) fortemente positiva (+++) coloração de ABCG4 no tecido NSCLC; (F) A imuno-histoquímica mostra coloração ABCG4-negativos em tecidos NSCLC (++) usando ABCG4 bloqueio péptido. Ampliação:.. 200 ×

Estes resultados sugerem que ABCG4 foi expressa em tecidos NSCLC, e que não foi expressa em tecidos pulmonares normais

Associação entre a expressão ABCG4 e características clinicopatológicas em doentes com NSCLC

Tendo observado que ABCG4 foi sobre-expresso em cerca de metade das amostras de tecido com NSCLC, a associação entre a expressão ABCG4 e as características dos pacientes, foram investigados. Não houve correlação significativa com hábitos de sexo, idade, ou fumadores (todo o

P Art 0,05). No entanto, a alta expressão de ABCG4 foi significativamente correlacionada com adenocarcinoma de pulmão (53,0%), em vez de carcinoma do pulmão de células escamosas (44,6%) (

P Art 0,001), no mal (55,2%), em vez de bem /moderadamente ( 42,5%) diferenciado NSCLC (

P

= 0,008), e com o aumento da metástase do tumor (TNM) fase II, III e IV (31,0%

vs

. 53,6%

vs

59,5%, respectivamente) (

P

0,001) (Tabela 3). Além disso, os níveis de expressão ABCG4 foram fracamente positivamente correlacionada com o aumento do estágio TNM (

r

s

= 0,210,

P

= 0,013) (dados não mostrados) .

Estes dados sugerem que a expressão ABCG4 foi associada com a diferenciação do tumor, estágio TNM e tipo histológico, e que os níveis de expressão ABCG4 foram positivamente associados com o estágio TNM.

Associação entre a expressão ABCG4 e sobrevivência de pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia baseada em cisplatina

Para investigar a relação entre a expressão ABCG4 e a evolução clínica de pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia combinada à base de cisplatina, uni e multivariadas foram realizadas utilizando os riscos proporcionais de Cox modelo para determinar se o valor prognóstico da ABCG4 foi independente de outros factores. Na análise univariada, sexo, tabagismo, idade, e histologia não influenciou o prognóstico (todo o

P Art 0,05). expressão ABCG4 (hazard ratio [HR]: 2.284), alta estágio TNM (HR: 3.124), e pobres diferenciação (HR: 1.869) foram significativamente associados com um prognóstico pobre (Tabela 4). Além disso, fatores que foram associados com um

P

-valor 0,05 na análise univariada foram incluídas em uma análise multivariada. Os resultados mostraram que, além do estágio TNM (HR: 3.098) e diferenciação (HR: 1.811), expressão ABCG4 foi um fator prognóstico independente para sobrevida de pacientes com NSCLC. O valor ABCG4-positivo para OS rendeu um HR de 2.236 (Tabela 4). Estes resultados indicam que a expressão ABCG4 foi um fator prognóstico adverso em pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia baseada em cisplatina.

curvas OS são mostrados na figura 4, de acordo com o status de expressão ABCG4. sobrevida média foi de 43,2 e 20,1 meses em pacientes com NSCLC ABCG4-negativo e ABCG4-positivo, respectivamente (

P Art 0,0001, Fig 4A). A sobrevida média foi de 54, 32 e 14.15 meses em pacientes com estágios II, III e IV NSCLC, respectivamente (

P Art 0,0001, Fig 4B). A sobrevida média foi de 39,5 e 25,2 meses em pacientes com NSCLC bem /moderadamente e pouco diferenciados, respectivamente (

P

= 0,0008, Fig 4C). A sobrevida média no grupo ABCG4-negativo foi de 39,5 meses, em comparação com 21,05 meses no grupo ABCG4-positiva em estágio III (

P

= 0,0002, Fig 4E). Além disso, a sobrevida mediana no grupo ABCG4-negativo foi de 31,9 meses, em comparação com 13,8 meses no grupo ABCG4-positiva em estágio IV (

P

= 0,0226, Fig 4F). No entanto, a sobrevivência mediana no grupo ABCG4-negativa foi 54,2 meses, em comparação com 50,1 meses no grupo ABCG4-positiva na fase II, e não houve diferença significativa em relação ao OS com expressão ABCG4 (

P =

0,8127, Fig 4D).

(a) curvas de Kaplan-Meier foram plotados para determinar a taxa de sobrevivência cumulativa de pacientes com NSCLC com base na expressão ABCG4 (negativo

vs

. positivo). (B) as curvas de Kaplan-Meier foram plotados para determinar a taxa de sobrevivência cumulativa de pacientes com NSCLC com base no palco nó tumor metástase (TNM) (II

vs

. III

vs

. IV). curvas (C) de Kaplan-Meier foram plotados para determinar a taxa de sobrevivência cumulativa de pacientes com NSCLC baseada na diferenciação (mal

vs

. moderadamente /poço). curvas (D) de Kaplan-Meier foram plotados para determinar a taxa de sobrevivência cumulativa de pacientes com NSCLC em estágio TNM II com base na expressão ABCG4 (negativo

vs

. positivo). curvas (E) de Kaplan-Meier foram plotados para determinar a taxa de sobrevivência cumulativa de pacientes com NSCLC em estágio TNM III com base na expressão ABCG4 (negativo

vs

. positivo). curvas (F) de Kaplan-Meier foram plotados para determinar a taxa de sobrevivência cumulativa de pacientes com NSCLC em estágio TNM IV com base na expressão ABCG4 (negativo

vs

. positivo). Negativo:-; Positivo: +, ++ e +++

Discussão

Já foi estabelecido que os transportadores ABC estão envolvidos em MDR e têm um efeito sobre a eficácia dos regimes de quimioterapia [. ,,,0],11,12]. O objetivo deste estudo foi investigar ABCG4 e sua expressão no NSCLC, a fim de avaliar se existe uma associação entre a expressão ABCG4 e evolução dos pacientes após a quimioterapia. No presente estudo, nós fornecida evidência sólida para ARNm ABCG4 e a expressão da proteína em algumas amostras de tecidos NSCLC, mas não em qualquer um dos tecidos pulmonares normais. Além disso, a expressão ABCG4 foi associado com diferentes graus de diferenciação, estádio TNM e tipo histológico. Univariada e multivariada sugeriu que estágio TNM, diferenciação e expressão ABCG4 foram fatores independentes envolvidos no prognóstico nessa população de pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia baseada em cisplatina. Estes resultados sugerem uma pior sobrevivência em doentes com NSCLC ABCG4 positiva tratados com quimioterapia com cisplatina.

ABCG4 expressão foi significativamente mais elevada em amostras de tecido NSCLC comparação com amostras de tecido de pulmão normal. Além disso, a expressão ABCG4 foi associado com diferentes graus de diferenciação, estádio TNM e tipo histológico. Estudos anteriores mostraram que apesar das semelhanças na sequência, estrutura e função do MDR entre ABCG2 (BCRP) e ABCG4, ABCG2 não está associada a sexo, história de tabagismo, performance status (PS), tipo histológico e estádio TNM em NSCLC [35 , 36], enquanto observamos associações entre ABCG4 e tipo histológico, grau de diferenciação e estádio TNM. Uma explicação pode ser que a especificidade e diversidade de sequência e estrutura entre os genes da subfamília transportador ABCG contribuir para esta discrepância. Além disso, a expressão de proteínas da subfamília transportadores ABC variar de acordo com as variáveis ​​clínicas; por exemplo, a expressão ABCB1 é significativamente maior em mulheres que em homens, e maior no carcinoma de células não-escamosas do que em carcinoma de células escamosas em NSCLC. No entanto, a expressão ABCC2 é significativamente maior em estágio IV NSCLC comparação com estágio IIIB, enquanto não há nenhuma correlação significativa entre ABCC1 expressão /ABCC3 e variáveis ​​clínicas em NSCLC [35]. Essa discrepância precisa ser investigada. ABCG4 também compartilha algumas semelhanças com ABCG1. No entanto, a actividade de ATPase basal de ABCG4 é menor do que a de ABCG1, e ABCG4 não é inibida pelas mesmas drogas como ABCG1 [37]. No entanto, a interação exata eo papel dessa interação entre ABCG1 e ABCG4 ainda precisa ser elucidado [38].

Estudos anteriores demonstraram que ABCG4 medeia o efluxo de esteróides endógenos em células e os transfere para destacar lipoproteínas de densidade (HDL), ajudando assim a manter o colesterol homeostase [30,39]. No entanto, Castanys-Muñoz et al. descobriram que a sobre-expressão de ABCG4 também está envolvido em análogos de alquilo de fosfolípido (miltefosina, edelfosina, e perifosine) resistência em

Leishmania

[33]. Os resultados do presente estudo sugerem uma menor sobrevida em pacientes com NSCLC ABCG4 positiva tratados com quimioterapia baseada em cisplatina. Especula-se que pacientes com NSCLC ABCG4-positivos podem apresentar resistência à quimioterapia baseada em cisplatina. Sugerimos que ABCG4 pode servir como alvo molecular para redução da resistência à droga em NSCLC. A relação entre ABCG4 e resistência às drogas e, especialmente resistência a múltiplas drogas, será dirigida mais especificamente em estudos futuros.

Por outro lado, este foi o primeiro estudo a investigar a relação entre a expressão ABCG4 e prognóstico em pacientes com NSCLC. Com base em curvas OS, os pacientes ABCG4 positivo teve um tempo médio de sobrevivência mais curto do que os pacientes ABCG4-negativo, exceto para a fase II CPNPC (

P

= 0.8127). A sobrevida média não foi significativamente diferente no CPNPC estágio II, que pode ser porque os níveis de expressão ABCG4 foram relativamente baixos no CPNPC estágio II, e que o número de pacientes ABCG4-positivos com a fase II NSCLC foi relativamente pequena (n = 13). Portanto, este resultado deve ser interpretado com cautela. As análises multivariadas univariada e mostrou que, além de palco e diferenciação TNM, ABCG4 foi independentemente associada com OS no CPNPC tratados com quimioterapia combinada à base de cisplatina. Estes resultados sugerem que a expressão ABCG4 pode ser fator de risco independente de prognóstico e biomarcador preditivo em pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia combinada à base de cisplatina. Os nossos resultados são consistentes com os de Yoh et ai. e Ota et al., que suporta um papel preditivo para ABCG2 no prognóstico de doentes com NSCLC tratados com quimioterapia de combinação com cisplatina [35,36]. Além disso, especula-se que a expressão do mRNA ABCG4 pode ser usada para projetar a quimioterapia individualizado para pacientes com NSCLC.

Este estudo teve algumas limitações. Na verdade, o tamanho da amostra foi pequeno, e um tamanho de amostra maior seria preferível. Também não tinha controle de indivíduos saudáveis, porque ressecção pulmonar em indivíduos saudáveis ​​é altamente invasivo e antiético. No entanto, os tecidos de controle dos pacientes com NSCLC foram histologicamente diferente dos tecidos e 5 cm de distância dos tumores, por isso, presume este foi um controlo eficaz sob as circunstâncias. Finalmente, a localização intracelular de ABCG4 serão avaliadas em um trabalho futuro. Estudos posteriores serão sempre executar em diferentes linhagens de células NSCLC que superexpressam ABCG4 sozinho ou em combinação com outros transportadores ABC, que deverá ajudar a elucidar o papel exato e função do ABCG4 em NSCLC.

Conclusões

este estudo sugere fortemente que a alta expressão ABCG4 está associada com mau prognóstico em pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia à base de cisplatina, e os pacientes com NSCLC ABCG4-positivos podem apresentar resistência à quimioterapia baseada em cisplatina. Além disso, o presente estudo é o primeiro a indicar um papel potencial para a expressão ABCG4 como um fator preditivo independente de mau prognóstico em pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia combinada à base de cisplatina. No entanto, um estudo mais aprofundado com o tamanho da amostra maior e as células são necessários para confirmar estes resultados e da via e mecanismo específico dirigir este efeito precisam ser melhor estudados. Estes podem levar a uma nova abordagem para a reversão da resistência a drogas quimioterápicas por entender ABCG4 e seu mecanismo em NSCLC.

Informações de Apoio

S1 Fig. . Western blot cheio de proteína ABCG4 (60 kDa) expressão

β-actina (43 kDa) foi utilizado como referência interna

doi:. 10.1371 /journal.pone.0135576.s001

(PDF)

S1 Arquivo. . Os dados brutos para análise de riscos proporcionais de Cox modelo e curvas de Kaplan-Meier

Nota: Género: 0, do sexo masculino; 1, do sexo feminino. Evento: 0, morte; 1, dados censurados. Idade: 0, ≥60; 1, 60. Tabaco: 0, ≥20 embalagens; 1, 20 pacotes.