Abstract
Caracol, um repressor potente de expressão da caderina-E, desempenha um papel fundamental na epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) no cancro epitelial. Recentemente, EMT e programas stemness são encontrados ligados entre si. No estudo atual, a expressão de Snail e sua contribuição para células-tronco do câncer (CSC) expressão do marcador, invasão de auto-renovação, clonogenicidade e tumorigenicidade de células de câncer pancreático foram estudados. Nossos resultados mostraram que Snail foi altamente expressa em CSC
linha de células de alta Panc-1. Estável, ARN gancho de cabelo curto (shRNA) mediada knockdown Snail em células diminuiu invasão Panc-1, em linha com o aumento da expressão de E-caderina e a sua translocação desde o núcleo para a membrana. silenciamento Snail em Panc-1 também inibiu a expressão CSC marcador ALDH, juntamente com a diminuição da esfera e a capacidade de formação de colónias, que era altamente consistente com a expressão de factores de transcrição de células estaminais associados como Sox2 e Oct4. Em modelos de xenoenxerto de ratinho, knockdown de Snail levou a uma redução do número de murganhos portadores de tumor e uma reduzida dimensão média de tumores, que tinha uma coloração mais forte membrana de E-caderina e a coloração mais leve de Oct4. Colectivamente, estes resultados implicam Snail é necessária para a manutenção do fenótipo de células estaminais-como no câncer de pâncreas, e inibição do caracol pode ser uma estratégia eficaz para o tratamento de câncer de pâncreas, visando CSCs
Citation:. Zhou W, Lv R, Qi W, Wu D, Xu Y, Liu W, et al. (2014) Caracol contribui para a manutenção de células semelhantes a células estaminais fenótipo em câncer de pâncreas humano. PLoS ONE 9 (1): e87409. doi: 10.1371 /journal.pone.0087409
Autor: Michael Klymkowsky, Universidade do Colorado, Boulder, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de julho de 2013; Aceito: 24 de dezembro de 2013; Publicação: 29 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Zhou, et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China [81001095]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
pâncreas adenocarcinoma ductal é um câncer epitelial altamente agressivo com uma taxa de sobrevida em 5 anos relatado de aproximadamente 5% [1]. Apenas 20% dos pacientes com câncer pancreático são elegíveis para ressecção cirúrgica e doença metastática desenvolve-se frequentemente mesmo após a cirurgia, enquanto a quimioterapia atual e rádio-terapias são ineficazes [2]. Portanto, a compreensão dos eventos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e progressão do câncer de pâncreas é urgentemente necessária, que pode ser a chave para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes e inovadoras.
Uma quantidade crescente de evidências científicas indicam que os tumores contêm uma pequena subpopulação de células, isto é, do cancro de células estaminais-like (CSCs) ou células iniciadoras de cancro (CICs), que exibem uma capacidade de auto-renovação, resistentes à quimioterapia convencional e são responsáveis pela falha de terapia, a recidiva do cancro e metástase [3 ]. Embora a hipótese de CSCs sugere que os tumores podem surgir a partir de células estaminais ou progenitoras, estudos de alguns laboratórios indicam que epitelial-mesenquimal transição (EMT), um processo de desenvolvimento em que as células perdem as características epiteliais e adquirem propriedades mesenquimais, tais como aumento da motilidade e invasão, pode células com células-tronco como características dotar [4] – [6].
EMT é induzida pela repressão da expressão da caderina-e pelos reguladores EMT como Caracol, Lesma, e twist. A família do caracol de dedo de zinco-repressores transcricionais reprime directamente de E-caderina in vitro e in vivo por meio de uma interacção entre a sua região COOH-terminal e a sequência 5′-CACCTG-3 ‘no promotor da E-caderina [7]. Em células de cancro colo-rectais humanos, a sobre-expressão de Snail foi relatado para induzir não só EMT mas também um fenótipo CSC-like, que aumentada a migração celular e invasão in vitro e um aumento na formação de metástases in vivo [8]. Os estudos mostraram também que Snail desempenha um papel essencial no processo de progressão e metastática do cancro pancreático humano [9], [10]. Na clínica, o Snail superexpressão já havia sido associado a pior prognóstico e um fenótipo mais invasivo em muitos tumores malignos [11] – [13]. No entanto, existem poucos relatos sobre a relação entre a expressão Caracol e o ganho de propriedades de células-tronco do câncer de pâncreas. Por isso, avaliou a função do Caracol na expressão do marcador com células-tronco, a capacidade de auto-renovação na linha de células de câncer pancreático in vitro e tumores de xenoenxerto formação in vivo. Nosso trabalho revela que a regulação de genes mediada por Snail pode apoiar o crescimento do câncer pancreático humano através da manutenção do compartimento de células-tronco do câncer de pâncreas.
Materiais e Métodos
cultura celular
O pancreático humano linhas celulares de cancro Panc-1 e BxPC-3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células foram cultivadas e mantidas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% (Gibco /Invitrogen, CA), penicilina-estreptomicina (Flow Laboratories, Rockville, MD). Ambas as linhas celulares foram mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C com 5% de CO2. morfologia celular bruto para a presença ou ausência de características morfológicas consistentes com EMT foi avaliado por dois observadores cegos para as condições de tratamento. Imagens de linhas celulares foram feitas usando um microscópio Nikon Eclipse TS100 invertido e câmera Pro-MicroScan (Oplenic).
Avaliação da atividade aldeído desidrogenase
substrato Aldefluor (2,5 ul, Aldagen, Inc., Durham, NC) foi adicionado a 1 × 10
6 células tumorais em tampão de ensaio de 500 ul e incubadas durante 60 min a 37 ° C. As células foram analisadas num citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson) de acordo com as instruções do fabricante. O tratamento de células com 5 ul do inibidor da ALDH dietilamino-benzaldeído (DEAB) serviu como controlo negativo. vectores lentivirais sem fluorescência foram usadas para transfecção de células durante a análise FACS.
Esfera ensaio de formação de
ensaio de formação de esfera foi realizada como descrito noutro local [14]. Em resumo, as células foram plaqueadas em poços seis placas de fixação ultrabaixo (Corning Inc., Corning, NY, EUA) a uma densidade de 1000 células /ml em DMEM suplementado com 1% de suplemento de N2 (Gibco, terra Grand, NY), 2% B27 suplemento (Gibco, Grand island, NY), 20 fator ng /mL de plaquetas humanas de crescimento (Sigma-Aldrich), 100 ng de factor de crescimento /ml epidérmico (PeproTech, Rocky Hill, NJ) e 1% de antibiótico-antimicótico (Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO2. culturas esfera foram passados após 7~10 dias. Para as esferas de passagem, o meio foi removido e as esferas foram recolhidas e incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos em 0,05% de tripsina (Solarbio, Pequim, China) e observadas ao microscópio para verificar a dissociação. As células obtidas a partir de dissociação foram peneirados através de um filtro de 40 mícrons e contados pelo contador utilizando o corante azul de tripano antes de repique.
macio ensaio de agar
Para avaliar o potencial clonogênica, o ensaio de formação de colónias foi realizada do seguinte modo. Cada poço de uma placa de cultura de seis poços foi revestido com 2 ml de uma mistura de agar de fundo (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Depois de a camada inferior solidificada, 2 ml de agar de topo mistura de meio (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) contendo 1 × 10
foi adicionado 4 células, e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 3 semanas. As placas foram coradas com 0,5 ml de violeta de cristal de 0,005% durante 1 h e em seguida um microscópio de dissecção foi utilizado para contar o número de colónias . 50 células [15]
Transwell ensaio de invasão
para o ensaio de invasão, foi utilizado o sistema de 24 poços da placa Transwell com um filtro de membrana de policarbonato de tamanho de poro de 8 um (Corning Costar, Corning, Nova Iorque). 1 × 10
5 100 células em meio isento de soro ul foram adicionadas à câmara superior revestida com Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA). A câmara inferior contém 10% de FBS contendo meio. As células foram incubadas durante 48 horas e as células que tinham invadido através da membrana de Matrigel-revestidos foram fixadas e coradas com violeta de cristal, depois contadas sob um microscópio de luz em quatro campos aleatórios de forma cega.
em tempo real análise de RT-PCR para a expressão do gene
para análise em tempo real de RT-PCR, o ARN total de células foi extraído usando o kit de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). O ADNc foi sintetizado utilizando quantidades equivalentes de ARN total (1 ug) com iniciadores aleatórios em 20 ul de transcriptase reversa mistura de reacção (Promega, Madison, WI). iniciadores de PCR em tempo real foram concebidos e comprado de Ruisai Inc (Xangai, China) como segue:
Snail, para a frente (5′-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3 ‘)
e reverso (5′- ATCTCCGGAGGTGGGATG-3 ‘);
Slug, para a frente (5′-AGCGAACTGGACACACATAC-3′)
e reverso (5′-TCTAGACTGGGCATCGCAG-3 ‘);
torção 1 , para a frente (5′-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 ‘)
e reverso (5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3′);
ZEB1, para a frente (5′-CGAGTCAGATGCAGAAAATGAGCAA-3 ‘)
e reverso (5′-ACCCAGACTGCGTCACATGTCTT-3 ‘);
ZEB2, para a frente (5′-GAGTTGATGCCTCGGCTATTGC-3′)
e reverso (5’CTGGACATTGAGCTGCTTCGATC-3 ‘) ;.
GAPDH, para a frente (5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3 ‘)
e reverso (5’GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′)
A amplificação foi realizada em um volume total de 20 ul contendo 1 ul de cada iniciador, 10 ul LightCycler FastStart DNA mestre SYBR green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) e 1 ul de ADNc de 01:10 diluída. As reacções de PCR foram preparadas em duplicado, e aqueceu-se a 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg, emparelhamento a 55 ° C durante 20 seg e extensão a 72 ° C durante 20 seg. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na
método ΔΔCt. A alteração n vezes na expressão de mRNAs foi determinada de acordo com o método de 2-
ΔΔCT.
Lentivirus mediada por RNAi de Caracol
O pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR vector foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). shRNAs double-stranded segmentação Snail humana foram desenhados por BLOCK-i T ™ RNAi Designer. A sequência alvo 1 foi 5′-GCCTAACTACAGCGAGCTG-3 ‘; sequência alvo 2 era 5’-GGATCTCCAGGCTCGAAAG-3 ‘. Ambas as sequências alvo foram verificados quanto específico para caracol por explosão busca contra o genoma humano. Universal de controlo não segmentação shRNA (sequências: 5’-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 ‘; 5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3’) foi utilizada como controlo negativo. shRNA foram sintetizados e clonado em pcDNA6.2-GW /EmGFP-Mir, em seguida, transferido para o plasmídeo de expressão de lentivírus pLenti6 /V5-DEST com a tecnologia de recombinação Gateway. Produção viral foi feito por transfecção das células 293 T com shRNA ou plasmídeo de controlo negativo e embalagem Mix (Invitrogen) na presença de POLOdeliverer ™ 3000 Transfection Reagent (Ruisai Inc, Shanghai, China). Os sobrenadantes foram colhidos 48 h após a transfecção e depois foram filtrados; os títulos virais foram então determinados por PCR em tempo real. As células subconfluentes foram infectadas com lentivírus a uma multiplicidade de infecção de 50, na presença de 8 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich). Panc-1 de células estável com o silenciamento do gene do caracol foram seleccionados com 2 ug /ml de blasticidina para 4 semanas. Em seguida, as células foram cultivadas com 1 ug /ml de blasticidina. Outro controle negativo shRNA plasmídeo (sc-108060) de Santa Cruz Biotechnology, que codifica uma sequência shRNA mexidos, foi utilizado para transfecção transiente de acordo com o protocolo.
Western blot análise
Para células inteiras extracção de proteínas, as células foram lisadas com tampão RIPA gelado contendo PMSF 1 mM e centrifugado a 14000 g durante 5 min. O sobrenadante contendo a proteína isolada foi quantificada por um ensaio de Bradford modificado disponível comercialmente (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). amostras de proteínas de Western blot foram preparados por proteínas isoladas a ferver com a desnaturação tampão de amostra. Quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram então bloqueadas com 5% de leite em pó magro em TBS e 0,1% de Tween 20 durante 1 h e sondadas com o anticorpo primário apropriado durante a noite a 4 ° C. As membranas foram então lavadas e incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano adequado (Sigma Aldrich, St Louis, MO) durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram então lavadas e as bandas de proteína foram visualizadas usando um kit disponível comercialmente quimioluminescência aumentada (ECL) (Thermo Scientific). Para verificar a precisão da carga de proteína isolada a partir de lisados de células inteiras, as manchas foram retirados, lavados e sondado com anticorpo de GAPDH (Bioworld) como um controlo de carga. As imagens foram visualizadas utilizando o sistema ECL Detection (Amersham, Arlington Heights, IL). Os anticorpos utilizados para análises de Western blot foram como se segue: o mAb mAb de coelho anti-Snail, o mAb de coelho anti-E-caderina, o mAb de coelho anti-vimentina, o mAb de coelho anti-Bmi1, coelho mAb anti-Nanog, o mAb de coelho anti-Oct4, coelho anti-Sox2 (Cell Signaling Technology, Inc.). A densitometria de Western blots foram analisados usando o software Image J..
Microscopia de imunofluorescência
As células foram cultivadas em lamelas de vidro, fixadas em formaldeído a 4% em PBS durante 10 min, permeabilizadas com 0,2% de Triton X -100 durante 10 min e bloqueadas em soro de cabra a 10% em PBS-0,2% de Tween durante 1 h. As lamelas foram incubadas com o anticorpo de E-caderina (BD Biosciences, 1:200 diluição) em solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem das células com PBS-0,2% de Tween, incubou-se as células durante 1 h com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho Alexa 594 (diluição 1:1000; Invitrogen). Os núcleos foram contrastadas com DAPI. As lâminas foram lavadas extensamente com PBS e montadas com Fluoromount-G. As amostras foram fotografados usando imunofluorescência microscópio.
análise in vivo do crescimento do tumor
Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do animal de Zhejiang University School of Medicine (ZYXK2010-0149). As suspensões de células individuais (2 × 10
5 num volume total de 100 uL de 1/1 (v /v) de PBS /Matrigel) foram injectados por via subcutânea na área direita e esquerda midabdominal de ratinhos nus macho (linhagem BALB /c ) com idade de 8 semanas. O tamanho do tumor monitorizada diariamente com compassos e calculou-se o volume do tumor de acordo com a fórmula (comprimento x largura
2) /2. Os animais foram submetidos a necropsia 28 dias após o implante celular e o crescimento do tumor foi avaliada.
A análise imuno-histoquímica de tecidos de xenoenxerto
Os tumores subcutâneos formados em ratinhos foram fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato e embebidos em parafina. secções espessas 4-um foram desparafinizadas utilizando xileno e hidratadas com uma série graduada de lavagens com etanol. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por 10 min de incubação em 3% H
2O
2. Após incubação com a solução de bloqueio durante 30 minutos, as secções foram incubadas com anticorpo primário a partir de BD Biosciences (anti-Snail, 1:200 diluição, anti-E-caderina, 1:200 diluição, e anti-Oct4, 1:300 diluição) para 1 h, um anticorpo secundário biotinilado durante 20 min e em seguida com estreptavidina peroxidase de rábano (HRP) durante 10 min. O anticorpo foi visualizada com diaminobenzidina (DAB) cromógeno e secções foram contrastadas com H E
A análise estatística
As experiências foram repetidas pelo menos duas vezes.. Os resultados são expressos como média ± DP. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste t de Student para amostras independentes, quando apropriado, utilizando software SPSS análise estatística (versão 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL). diferenças significativas entre os grupos foram calculados em P . 0,05
Resultados
expressão do caracol e da haste marcador de células ALDH em linhas de células pancreáticas
Sob o microscópio, BxPC-3 células foram epitelial morfologicamente na natureza. Em contraste, as células Panc-1 foram populações mistas de células epiteliais e mesenquimais do tipo em forma de fuso (Figura 1 A). Citometria de fluxo, linha de células mal diferenciadas Panc-1 foi caracterizado como CSC alta de células
, com mais ALDH
alta população, enquanto linhagem celular bem diferenciado BxPC-3 como CSC
baixa de células com menos ALDH
população elevada (Figura 1 B). ensaio de formação de esfera também revelado Panc-1 que formado mais e maiores do que esferas BxPC-3 fez (Figura 1 A). Para obter insights sobre o papel crucial dos reguladores EMT, examinamos a expressão basal de Caracol, Lesma, TWIST1, ZEB1 e ZEB2 em Panc-1 e BxPC-3. Notavelmente, em tempo real de RT-PCR A análise mostrou que as células Panc-1 tinha uma expressão significativamente mais elevada de Snail e ZEB1 ARNm (aproximadamente 6 vezes e 4 vezes, respectivamente, P 0,01) em comparação com células BxPC-3 (Figura 1 C). Houve uma correlação entre pobres diferenciação, Caracol e os níveis de expressão ZEB1 ea capacidade de formação de esfera nestas duas linhas celulares de cancro do pâncreas. Nós escolhemos a linha de células Panc-1 para experimentos mais tarde caracol silenciamento devido ao seu nível relativamente elevado de caracol e excelente eficiência de transfecção lentiviral expressão.
A. Morfologia das células Panc-1 e BxPC-3 e as suas esferas. Note-se que as células Panc-1 têm mais populações mesenquimais em forma de fuso e pode formar esferas mais e maiores. ** P 0,01 comparado com BxPC-3. B. Actividade da ALDH em Panc-1 e BxPC-3 células. Os gráficos de pontos de células analisadas por citometria de fluxo para a actividade de ALDH. As células foram tratadas com substrato Aldefluor na presença ou ausência de DEAB inibidor da ALDH. Após o tratamento, as amostras foram analisadas por citometria de fluxo para detectar a presença de ALDH
de células de alta. Os valores apresentados são as médias de três experiências independentes. C. em tempo real de RT-PCR quantificar os caracol, Slug, TWIST1, ZEB1, e a expressão de ARNm em células ZEB2 Panc-1 e BxPC-3. Os gráficos de barras mostram a relação entre o nível de expressão em células Panc-1 para que em células BxPC-3. ** P . 0,01
Snail induz mudanças EMT-como em células de câncer pancreático
Para examinar o papel do Caracol na indução de EMT e geração de CSC, que produziu um caracol knockdown estavelmente Panc-1 linha celular (Panc-1 /shSnail) por transfecção lentiviral.
Dois clones expressando shSnail estáveis independentes (S1, S2) e um controle negativo estável shRNA clone (NC) foram analisadas para a expressão do mRNA do caracol . S1 e S2 mostraram até 80% regulação baixa dos níveis de mRNA do caracol, enquanto clone de controlo não exibiram qualquer redução significativa no mRNA Snail (Figura 2A). Nós escolhemos clone S1 como Panc-1 /shSnail para seguinte experimento devido à sua maior extensão do caracol silenciamento. Knockdown de Snail em células Panc-1 foi confirmada por análise de Western blot (Figura 2B e C). Coelho mAb anti-Snail foi validada contra os lisados celulares a partir de Panc-1, Mia-PaCa2, BxPC-3, e as linhas celulares Capan-1. O padrão de coloração foi idêntico ao dos dados anteriormente publicados (Figura S1) [9], [16]. Para descartar a heterogeneidade causada por transfecção estável e protocolo de seleção, usamos um outro controle negativo plasmídeo shRNA (sc-108060) para a transfecção transitória. Em tempo real de RT-PCR e Western blot revelou nenhuma diferença significativa da expressão de Snail entre clones de controlo transf ectadas estavelmente e transientemente (Figura S2).
. expressão do mRNA do caracol de-expressando shSnail estável (S1, S2) e controle negativo shRNA expressando (NC) Panc-1 clones. Os valores são as médias e desvios-padrão das medições em triplicado. ** P 0,01 comparado com NC. blot B. ocidental mostrando marcadores epiteliais-mesenquimais Caracol, Lesma, TWIST1, ZEB1, ZEB2, E-caderina e vimentina em células Panc-1 transfectadas com o controle negativo mediado por lentivírus shRNA (Panc-1 /NC) ou shSnail (Panc-1 /shSnail). GAPDH foi usada como controlo de carga. C. Quantificação dos níveis de proteína de Caracol, Lesma, TWIST1, ZEB1, ZEB2, E-caderina e vimentina em Panc-1 /NC e Panc-1 células /shSnail. * P 0,05, ** P . 0,01
Depois de infecção por lentivírus, cego investigadores observaram diferenças na aparência bruta de células. infecção estável de células Panc-1 pelo shSnail aumentou significativamente a adesão intercelular e forma de calçada semelhante, em comparação com células de controlo (Figura 3A). Em seguida, avaliamos a expressão e localização de E-caderina usando imunofluorescência. Comparado com Panc-1 células /CN, células Panc-1 /shSnail tinham aumentado os níveis de expressão de E-caderina e relocalização de E-caderina do compartimento nuclear para a membrana plasmática da célula (Figura 3B). Estas alterações foram típico de células com um fenótipo epitelial, indicando que as células mesenquimais foram submetidos a-to-epitelial de transição (TEM), após o silenciamento do caracol. Para confirmar ainda mais a observação, avaliamos a expressão da molécula de adesão epitelial E-caderina, marcador de células mesenquimais vimentina e outra transcrição EMT fatores Slug, TWIST1, ZEB1 e ZEB2 por Western blot em lisados celulares. Tal como esperado, após o silenciamento de Snail em Panc-1, foi observada a expressão de E-caderina para aumentar. Por outro lado, foi observado um decréscimo na expressão de vimentina após ZEB1 e caracol knockdown. Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de proteína de Slug, TWIST1 e ZEB2 (Figura 2 B, C). Estes resultados mostram uma clara relação entre Caracol e E-caderina, e também sugerem uma interacção directa ou indirecta entre Caracol e ZEB1, sendo que ambos têm o potencial para reprimir a transcrição E-caderina.
A. alterações morfológicas das células de Panc-1 após caracol silenciamento indicam uma mudança no padrão de crescimento celular a partir de um mesenquimais para um fenótipo epitelial. coloração B. imunofluorescência para a expressão e localização celular de E-caderina em clones estáveis de Panc-1 /NC e Panc-1 /shSnail. ADN nuclear foi detectada por coloração com DAPI. Estável caracol knockdown leva a um aumento da expressão de E-caderina e a sua translocação desde o núcleo para a membrana. C. caracol silenciamento inibe a invasividade Panc-1 em ensaios de invasão in vitro de Matrigel. ** P 0,01 comparado com Panc-1 /NF. Os dados apresentados aqui são a média ± DP de três experiências.
Snail aumenta a capacidade de invasão celular em
de células de câncer pancreático
Uma vez que os processos de EMT têm sido relacionados com a invasão da célula, o próximo perguntado se expressão de Snail tem algum efeito sobre a capacidade de invasão de células em células de cancro pancreático. Usando o Matrigel no ensaio de invasão in vitro, encontramos células Panc-1 com caracol silenciamento tinha diminuído significativamente a capacidade para a invasão, quando comparado com células de controlo (Figura 3 C). Estes dados confirmam que a expressão Snail aumenta a capacidade invasiva de células de câncer de pâncreas, e a inativação de caracol leva ao MET com características menos invasivos.
Snail aumenta com células-tronco como propriedades em células de câncer de pâncreas
Como Snail é altamente expresso no CSC
elevado em comparação com CSC
células de baixa, que, portanto, examinar se Caracol poderia afetar a expressão do marcador de células-tronco ALDH. Snail silenciados células Panc-1 mostraram uma diminuição significativa no ALDH
população elevada (1,60%) em comparação com os seus homólogos de controlo (6,01%) (Figura 4 A). Em seguida, foi utilizado no ensaio de formação de esfera vitro para analisar se Caracol participa na renovação CSC após passagens em série. Nós mostramos que Snail knockdown não só afetou a formação inicial de esferas, mas também levou a uma redução contínua de números esfera nas gerações subsequentes. teste de formação Colony também mostrou que silenciamento de Caracol bloqueou significativamente o crescimento da colônia de Panc-1 células (Figura 4 B). Estas experiências implicam que caracol tem um papel importante na regulação do conteúdo CSC pancreático e é necessário para a capacidade de auto-renovação.
A. silenciamento Snail diminui ALDH
população elevada em células Panc-1. Os gráficos de pontos de células analisadas por citometria de fluxo para a actividade de ALDH. Os valores apresentados são as médias de três experiências independentes. B. caracol silenciamento inibe significativamente a capacidade de formação de esfera com passagens em série e a capacidade do clonogenicidade em células Panc-1. imagens representativas de colónia são mostrados acima da coluna diagrama. Experiências semelhantes foram repetidas três vezes. ** P 0,01, comparado com Panc-1 /NF. análise de mancha C. ocidental de extratos de células de Panc-1 /NC e as células Panc-1 /shSnail para Bmi1, Nanog, Sox2, e expressão Oct4. GAPDH foi usada como um controlo de carga. D. Quantificação dos níveis de proteína de Bmi1, Nanog, Sox2 e Oct4 em Panc-1 /NC e Panc-1 células /shSnail. * P 0,05, ** P 0,01 em comparação com Panc-1 /NC
Snail aumenta a expressão de células-tronco associada fatores de transcrição
Como expressão do caracol tem algum relacionamento com ele. conteúdo CSC, utilizou-se Western blot para determinar se a expressão de Snail tem papéis na mudança de expressão de Bmi1, Nanog, Sox2, e Oct4, que são necessários para a manutenção da pluripotência das células estaminais. Como mostrado na Figura 4 C e D, lentiviral transfecção mediada de Snail shRNA induziu uma redução dramática na expressão de Sox2 e Oct4 (P 0,05 e P 0,01, respectivamente) em células Panc-1, o que foi consistente com a perda de CSC fenótipo, sugerindo que a expressão destes fatores pode ser importante para induzida por Snail formação CSC em células de câncer de pâncreas.
Snail aumenta a tumorigenicidade de células de câncer pancreático in vivo
Uma vez que os nossos estudos in vitro sugeriram caracol que desempenha um papel regulador na invasão de células de cancro do pâncreas e formação CSC, que implantado subcutaneamente números iguais de Panc-1 /NF e Panc-1 /shSnail nos ratinhos nus e medido o crescimento do tumor resultante. Quando injetadas 2 × 10
5 células, Panc-1 /NC teve 100% de formação (8/8) do tumor, enquanto apenas 2/8 camundongos injetados com Panc-1 /shSnail mostrou o enxerto de tumor pancreático. Por outro lado, uma tendência para a formação de tumor retardado e uma diminuição em tamanhos dos tumores foram observados em tumores derivados de células do caracol silenciamento em comparação com aqueles a partir de células de controlo (Figura 5A). A imuno-histoquímica de tumores mostraram uma coloração mais clara do caracol e Oct4, enquanto uma membrana mais forte coloração de E-caderina em tumores Panc-1 /shSnail, em comparação com os de Panc-1 tumores /NC (Figura 5B). Estes dados estão de acordo com nossas observações in vitro e apoiar o papel do Caracol na manutenção do compartimento CSC pancreático.
A. representação gráfica das taxas de crescimento de tumores de xenoenxerto subcutâneo utilizando-se células de Panc-1 /NC e Panc-1 /shSnail. 2 × 10
5 de cada célula foi transplantado em oito ratos por grupo. Todos os ratinhos no grupo /CN Panc-1, enquanto que apenas dois ratos do grupo /shSnail Panc-1 apresentaram formação do tumor. B. Expressão de Caracol, E-caderina, e Oct4 em tumores de xenoenxerto. Exemplos representativos de Caracol, E-caderina e expressão Oct4 determinado por imuno-histoquímica. expressão de Snail fortemente positiva se encontra presente no núcleo e no citoplasma de tumores Panc-1 /NF (A), mas não em tumores Panc-1 /shSnail (b). A expressão de E-caderina é fraco e heterogêneo nos tumores Panc-1 /NC (c), mas mais intensa na membrana de Panc-1 /tumores shSnail (d). nível mais baixo de expressão Oct4 está presente nos tumores Panc-1 /shSnail (F), em comparação com a de Panc-1 /NF tumores (e). Barras de escala: 10 mm
Discussão
Nosso estudo demonstra que Snail que está relacionado com EMT de células de câncer pancreático humano também pode regular a expressão de marcadores de células-tronco e fatores de transcrição de pluripotência manutenção. , modulando a capacidade de auto-renovação e clonogenicidade. Juntamente com o estudo da implantação do tumor, os nossos resultados indicam que a activação de Snail é necessário para a manutenção de características semelhantes a células estaminais do cancro, o qual tem impacto directo iniciação do tumor, crescimento in vivo. Nós demonstraram de forma convincente que a inibição de Snail pode ser considerado como uma nova estratégia para melhorar os efeitos biológicos de agentes anticancerígenos e quimiopreventivos.
Investigadores CSCs geralmente identificados a partir de cancro do pâncreas com base na expressão dos antigénios de superfície celular como CD44 , CD24, antigénio específico da epitelial (ESA), e CD133 [17] – [20]. Existem diferentes conclusões em estudos separados sobre qual a baliza melhores enriquece para CSCs pancreáticas. No entanto, estudos recentes descobriram que as populações celulares enriquecidas em actividade de ALDH alta sozinho são suficientes para eficiente tumor-iniciação com potencial tumorigénico reforçada [21]. Em nosso experimento, knockdown da chave EMT indutor do caracol diminuiu significativamente a ALDH
população de alto celular. Estes dados indicam que as células tumorais EMT dota com propriedades semelhantes a células estaminais. Nossos resultados estão de acordo com a pesquisa de Chen et al, que encontrou ALDH
células de alta em câncer de cabeça e pescoço escamoso ter mudança EMT e endogenamente co-expresso caracol. Além disso, o knockdown da expressão de Snail diminuiu significativamente a expressão de ALDH, inibiu cancerosas propriedades estaminais semelhante [22]. Estas observações foram também confirmadas por formação de esfera no implante in vitro e in vivo do tumor, onde caracol knockdown levou a uma menor e menor do enxerto. Estes resultados são consistentes com os de Mani e seus colegas [4] que mostrou que forçou expressão de moléculas de EMT-associados, tais como Caracol e resultados torção em células com um fenótipo de células-tronco do câncer. EMT oferece uma maneira alternativa para gerar propriedades das células-tronco do câncer de células tumorais epiteliais diferenciadas. Esta hipótese de desdiferenciação é suportado pela geração recentemente descrita de células estaminais pluripotentes a partir de células somáticas aparentemente terminalmente diferenciadas [23].
Considera-se geralmente que Sox2 e Oct4 são reguladores-chave de transcrição de células estaminais embrionárias (ESC) auto-renovação e pluripotência [24] – [26]. Acumulando as evidências indicam que estes factores de transcrição dos CES são expressos por células como CSC-em diferentes tipos de cancro. Knockdown destes genes pode levar à diminuição do fenótipo CSC, reduzir as capacidades clonogénicas e tumorigénicas das células cancerosas. [27] – [29]. Eles também são suficientes para reprogramar células somáticas humanas para células estaminais pluripotentes, que apresentam as características essenciais dos CES [23]. No presente estudo, verificou-se que os níveis de Sox2 e Oct4 expressão foram diminuiu em Caracol-silenciando células Panc-1 em comparação com as células controle. Isto sugere que as funções do caracol como um interruptor principal durante a regulação dos potenciais pluripotentes da célula-tronco. Resultados semelhantes são encontrados em outros estudos, em que a alta expressão de Oct4 e Nanog promove EMT, e está associada com resistência à droga, metástase tumoral e prognóstico pobre em várias malignidade humanas. [30], [31].